CN102998461A

CN102998461A - 乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法

Info

Publication number: CN102998461A
Application number: CN2012104721838A
Authority: CN
Inventors: 肖海龙; 屠海云
Original assignee: HANGZHOU QUALITY TECHNOLOGY SUPERVISION INSPECTION INSTITUTE
Current assignee: HANGZHOU QUALITY TECHNOLOGY SUPERVISION INSPECTION INSTITUTE
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-11-19
Also published as: CN102998461B

Abstract

本发明涉及乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法。目的是提供的试剂及方法应具有操作简便、快速、结果直观的特点。技术方案是：乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量：鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体、缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体、缓冲液；底物显色剂A液；底物显色剂B液；终止液。乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制备方法，其中的鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是：1）制取抗原；2）用所制备的抗原免疫小鼠，经过处理获得所述抗体；其中的兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是：1）制取抗原；2）用所制备的抗原免疫新西兰白兔，经过处理获得所述抗体。

Description

乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测小麦球蛋白的高灵敏ELISA试剂及制备方法，可应用于牛奶中小麦蛋白掺伪快速筛查检测，以及蛋白饮品中小麦球蛋白过敏原的快速定性检测。

背景技术

不同来源的蛋白质的营养价值有别，一般来说，牛奶中蛋白质含有人体生长发育的一切必需的氨基酸，消化率可达98%～100%，为完全蛋白质，因而具有较高的营养价值，植物蛋白白中缺少必需氨基酸，且在人体消化吸收和利用程度也较差，因而营养价值相对较低。根据其不同的溶解性，可将小麦中的蛋白质分为清蛋白(溶于水和稀的缓冲液)、球蛋白(溶于盐溶液)、麦谷蛋白(溶于稀酸和稀碱溶液)和醇溶蛋白(溶于70%～90%乙醇)，后两种蛋白主要影响面粉面筋性能。由于生产来源及加工工艺的因素，市场上动物奶蛋白价格远高于植物蛋白。在利润的驱使下，采用植物蛋白代替动物蛋白、在乳品及含蛋白饮料中掺假的情况时有发生；曾有过牛奶中掺小麦粉的报道，也存在掺小麦蛋白的可能性。这种掺假尽管质量安全危害性较低，但降低了乳品应有的价值，具有欺骗消费者、扰乱市场秩序的恶果。为确保产品的真实性，有必要建立快速检测小麦球蛋白的方法。

另据报道，国外约有30%的人群对特定食物有过敏反应，我国一项针对15～24岁健康人群的调查显示，在15～24岁年龄段健康人群中，约有6%的人曾患有食物过敏。估计20%～65%的过敏性肠道综合征和消化不良患者的病因与食物过敏有关。小麦被认为是一种主要的食物过敏原，它是FAO(1995)报告的八类常见过敏食物之一。虽然目前全世界缺乏有关小麦过敏的发病率统计数据，但小麦过敏仍然是一个不可忽视的食品安全问题，小麦球蛋白是小麦蛋白成分中的主要过敏原之一。对于食物过敏，目前还没有有效的治疗手段，患者只能通过严格避免过敏源来避免症状的发生。因此，食品中过敏原的检测也就成为食源性过敏控制的主要手段。

目前关于乳及蛋白饮品中小麦球蛋白的快速定性方法鲜见报道，针对蛋白成分检测技术主要有SDS-PAGE、PCR、液相色谱和质谱等；上述技术仅适合应用于实验室分析，不适合于普通消费者使用。由于乳及蛋白饮品消费群体广，有必要建立一种简便、快速、经济、高灵敏的定性检测试剂，供广大消费者自行使用。

发明内容

本发明的目的是针对以上背景和技术需求，提供一种酶联免疫吸附试剂（ELISA）以及制备方法，用于乳及蛋白饮品中小麦球蛋白的快速定性检测；所述试剂及方法应具有操作简便、快速、结果直观、高灵敏的特点。

为了达到上述目的，本发明人进行了广泛深入的研究，通过提取、纯化麦胚粉中小麦球蛋白，制备小麦球蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，获得了采用单克隆抗体捕获目标、多克隆抗体检测的双抗夹心法所需的检测试剂，从而完成本发明。

本发明提供的技术方案是：乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体80-120ng/ml，其余是缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体70-90ng/ml，其余是缓冲液；

底物显色剂A液：醋酸钠26-28g/l，柠檬酸3-3.5g/l，30%双氧水0.5-0.7ml/l，其余为蒸馏水；

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.3-0.5g/l，柠檬酸1.8-2.0g/l，甘油0.09-0.11l/l，TMB 0.28-0.32g/l，DMSO 5-7ml/l，其余为蒸馏水；

终止液：1.8-2.2mol/L硫酸溶液。

所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体100ng/ml，其余是缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体80ng/ml，其余是缓冲液；

底物显色剂A液：醋酸钠27g/l，柠檬酸3.2g/l，30%双氧水0.6ml/l，其余为蒸馏水；

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.4g/l，柠檬酸1.9g/l，甘油0.1l/l，TMB 0.30g/l，DMSO 6ml/l，其余为蒸馏水；

终止液：2.0mol/L硫酸溶液。

所述缓冲液是磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸盐中的一种或多种。

乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制备方法，其特征在于其中的鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是：

1）麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3%—10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；

2）用所制备的抗原免疫小鼠，取其脾脏的B细胞，将B细胞核骨髓瘤细胞融合，筛选针对抗原蛋白表位的单克隆抗体分泌型杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，8-10天后收集腹水，采用Protein G亲和层析柱纯化，获得鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体；

其中的兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是：

2）用所制备的抗原免疫新西兰白兔，取兔血清，采用Protein A亲和层析柱纯化，获得兔抗小麦球蛋白多克隆抗体；采用戊二醛将HRP与兔抗小麦球蛋白多克隆抗体偶联，赖氨酸封闭残留的醛基，采用Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，获得兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体。

所述底物显色剂中的A、B分别液避光保存，使用的时候根据需要量取等量A与B液混匀后使用。

本发明使用时的操作步骤如下：

1）将鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体与固相载体联结，形成固相抗体；接着洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2）在固相抗体加上受检标本，保温反应；使标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；然后洗涤除去其他未结合物质。

3）在步骤2）所述复合物上添加兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体（酶标抗体），保温反应；使复合物上的抗原与酶标抗体结合，然后彻底洗涤未结合的酶标抗体；此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

4）加底物显色；若固相上的酶催化底物成为有色产物，即可得知受检标本中带有小麦球蛋白；通过比色，还可测知标本中的抗原量。

本发明得到的小麦球蛋白和单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果见图1；图中：M:蛋白分子Marker；1:小麦球蛋白；2：小麦球蛋白单克隆抗体。

从图中可以看出，纯化后的小麦球蛋白主要有六条谱带,其分子量依次为57.8kDa、41.8kDa、38.7kDa、24.1kD a、16.5kDa和14.3kDa。经粗测，所提取的小麦球蛋白纯度达到95%以上。纯化后的单克隆抗体共有两条谱带，分别为55kDa（重链）和27kDa（轻链），纯度达98%以上。

所制备的试剂对小麦球蛋白检测的灵敏度

将纯化抗原的浓度稀释到0.5μg/mL，之后连续作2倍梯度稀释，按确定的ELISA条件进行测定，灵敏度测试结果见图2。由图2可知，检测试剂对小麦球蛋白的检测限均在10ng/mL左右，显示出良好的灵敏度。

所制备的试剂对小麦球蛋白检测的的特异性

分别用牛奶α-酪蛋白（α-casein）、大麦球蛋白（Barley globulin）、小麦清蛋白（Wheat albumin）、小麦醇溶蛋白（Wheat gliadin）、玉米醇溶蛋白（Zein）和花生球蛋白（Arachin）、小麦粉、乔麦粉、豆浆、玉米汁、鸡蛋面条等样品进行测试，测试结果见表1，所制备的检测试剂可正确识别小麦球蛋白和含该蛋白的样品，与其他样品无交叉情况，显示出良好的特异性。

表1小麦球蛋白ELISA方法的特异性和实际样品测试

样品号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												ELISA测试	+	-	+	-	-	-	+	-	-	-	+

注：1—α-Casein；2—Barley globulin；3—Wheat albumin；4—Wheat gliadin；5—Zein；6—Arachin；7—小麦粉；8—乔麦粉；9—豆浆；10—玉米汁；11—鸡蛋面条。

本发明的有益效果是：本发明所提供的试剂用于定性测量乳及蛋白饮品中的小麦球蛋白，不但灵敏度高、测定结果直观，而且操作简便、快速（1小时内即可获得结果），适合于消费者应用的快速筛查方法。

附图说明

图1是纯化后的小麦球蛋白及其单克隆抗体电泳图。

图2是小麦球蛋白ELISA检测方法灵敏度示意图。

图3是样品测试结果示意图。

具体实施方式

（一）试剂与材料

1）常规试剂：正己烷、弗氏佐剂（Sigma）、胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶、聚乙二醇1500。

2）100×青链霉素溶液:取青霉素(钠盐)100万单位和链霉素100万单位，溶于100mL灭菌超纯水中，小量分装，－20℃保存，用于细胞培养基的抗菌添加剂。

3）基础培养基：取RPMI-1640培养基10.4g，NaHCO3 2g，定溶于1000mL双蒸水中，用0.22μm滤膜过滤，无菌分装。

4）完全培养基：基础培养基+10%新生牛血清+1%100×青链霉素溶液。

5）HAT培养基:完全培养基+1%100×HAT溶液。

6）PBS（磷酸盐缓冲液）：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L。

其余缓冲液（三羟甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸盐）也可自制或外购。

7）底物显色剂：

底物显色剂A液：醋酸钠26-28g，柠檬酸3-3.5g，30%双氧水0.5-0.7ml，蒸馏水加至1000ml。

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.3-0.52g，柠檬酸1.8-2.0g，甘油0.09-0.11l，取0.28-0.32g TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）溶于5-7DMSO（二甲基亚砜）中，蒸馏水加至1000ml。

底物显色剂A、B液避光保存，使用的时候根据需要量取等量A与B液混匀后使用。

8）终止液（以2mol/L浓度为例）：称取54ml浓硫酸，不断搅拌加入446ml蒸馏水中，配置获得2mol/L硫酸溶液终止液。

所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂中，鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体、兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体、底物显色剂A液、底物显色剂B液、终止液分别按一定量封装，使用时根据需要取用。

（二）具体步骤

1、小麦球蛋白的提取和纯化

称取10g过筛麦胚粉，烘箱105℃干热20min灭酶，加入50ml正己烷4℃磁力搅拌过夜脱脂，3000rpm离心20min，弃正己烷层；再次用50ml正己烷洗涤沉淀3次，旋转蒸发去除残留正己烷。将脱脂麦胚粉加入10倍体积的去离子水40℃水浴磁力搅拌2h，1000rpm离心30min，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白。将洗涤后的沉淀加入10倍体积的3%NaCl溶液，40℃水浴磁力搅拌2h，4000rpm离心30min，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液注入分子量为8000-10000透析袋，4℃对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，8000rpm离心10min，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白。冻干粉用3%NaCl溶液4℃磁力搅拌过夜溶解，配制浓度为1mg/L~3mg/L，3000rpm离心30min，取上清，作为免疫抗原。

2、鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体制备

首次免疫抗原用完全弗氏佐剂1:1混合，采取皮下及肌肉多点注射，后续免疫抗原用不完全弗氏佐剂1:1混合，间隔4周后进行第2次免疫，间隔3周后进行第3次免疫，间隔3周后进行第4次免疫，每次免疫后鼠尾取血检测血清效价。血清效价检测有显著免疫反应的小鼠可以进行免疫B细胞的制备用于后续融合。将小鼠麻醉处死后，在无菌操作下摘取小鼠脾脏，并浸没在基础培养基中，用镊子轻轻打开脾脏外包膜获得单细胞悬液，离心洗涤3次，计数并用20ml基础培养基重悬，调整细胞浓度为80-120个/ml，放入50ml聚丙烯离心管，并于4℃放置。按5:1~10:1的比例混合脾细胞和骨髓瘤细胞，4℃离心10min，轻轻去掉上清并把细胞沉淀打散，置于37℃水浴中，在1min内边混合边逐滴加入1ml 50%PEG，继续混合，在2min内加入2ml预热的基础培养基，4min内边混合边加入另外8ml完全培养基，4℃离心10min，加入HAT培养基轻轻混匀，铺板105个细胞/孔，37℃下在含5%的CO2培养箱中培养。采用ELISA方法筛选针对抗原蛋白表位的单克隆抗体分泌型杂交瘤细胞株，抗原蛋白（小麦球蛋白）包被ELISA板，脱脂奶粉溶液封闭后，将各个孔中的培养上清37℃孵育1h，洗涤3次，HRP标记的二抗检测。将有明显显色的阳性孔中的细胞吸出，稀释后进行继续培养及亚克隆。收集阳性孔中的杂交瘤细胞并重悬，用完全培养基按比例将细胞悬液稀释10倍，分别接种到96孔板中，连续培养1周后，取上清进行ELISA筛选，收集阳性克隆再进行新一轮的亚克隆操作，连续进行3-4轮后，每孔中获得单一阳性克隆。将阳性克隆扩增培养，用ELISA方法筛选培养液上清的效价，挑选效价最高的杂交瘤细胞株，继续进行亚克隆，待连续两次亚克隆的阳性都为100%时结束亚克隆。将筛选出的杂交瘤细胞株扩大培养，收集到离心管中，1200r/min离心8min，弃上清，用基础培养基悬浮，然后再离心，如此反复用基础培养基将细胞洗涤三次，随后用血细胞计数板对收集的细胞进行计数，按每只小鼠注射1×10⁶个细胞左右将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，8-10天后收集腹水，采用Protein G亲和层析柱纯化，获得鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体。

3、兔抗小麦球蛋白多克隆抗体制备

用完全弗氏佐剂与小麦球蛋白1:1混合，对新西兰白兔进行首次免疫，采取皮下及肌肉多点注射，后续免疫采用不完全弗氏佐剂与小麦球蛋白1:1混合，间隔4周后进行第2次免疫，间隔3周后进行第3次免疫，间隔3周后进行第4次免疫。第4次免疫后，则一次性采取颈动脉放血。将所取得的全血，放置于37℃过夜，4℃离心沉淀血红细胞，取上清。用Protein A亲和层析株对抗小麦球蛋白血清进行纯化，得到高效价、高纯度的兔抗小麦球蛋白多克隆抗体。

4、兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体制备

取10mg HRP溶于0.2mL1.25%戊二醛，室温（20±5℃）反应结合18h。用Sephadex G-50凝胶柱除去游离的戊二醛。将兔抗小麦球蛋白多克隆抗体IgG溶于0.15mol/L NaCl，再加入醛化HRP溶液（10mg/mL）混合。加入0.1mL 1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液（pH至9.0～9.6），2-8℃，电磁搅拌下结合24h。加入1mL0.2mol/L赖氨酸，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。采用Sephadex G-200凝胶柱层析，收集洗脱峰，获得兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体。

5、ELISA的建立

取纯化后的单抗包被48孔板，100μl/孔，放入湿盒室温下放置1小时，然后4℃包被过夜；用PBS溶液洗3次每次3分钟；每孔加入200μL1％的牛血清白蛋白封闭，37℃放置1小时；取出后，PBS溶液洗3次每次3分钟；加入样品（目标蛋白为1μg/ml～1mg/ml），100μl/孔，37℃放置60分钟；PBST溶液洗3次每次3分钟；每孔加入100μl 1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的多抗,37℃放置30分钟；PBST溶液洗3次每次3分钟；加入显色液100μl/孔，避光显色10分钟；加入终止液（2M的H2SO4溶液）50μl；肉眼观察或用酶标仪读数。

6、测试结果

采用实际样品测试，结果如图3所示；阴性对照无可见的颜色，阳性对照为金黄色。所测试的样品中，1、2、4、6号样品含有小麦球蛋白，显示为金黄色；其他样品无颜色，不含该成分。

实施例1：

乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体80ng/ml，其余是CAPSO缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体70ng/ml，其余是CAPSO缓冲液；

底物显色剂A液：醋酸钠28g/l，柠檬酸3g/l，30%双氧水0.5ml/l，其余为蒸馏水；

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.5g/l，柠檬酸1.8g/l，甘油0.09l/l，TMB 0.28g/l，DMSO 5/l，其余为蒸馏水；

终止液：1.8mol/L硫酸溶液。

实施例2：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体120ng/ml，其余是三羟甲基氨基甲烷缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体90ng/ml，其余是三羟甲基氨基甲烷缓冲液；

底物显色剂A液：醋酸钠26g/l，柠檬酸3.5g/l，30%双氧水0.7ml/l，其余为蒸馏水；

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.5g/l，柠檬酸2.0g/l，甘油0.11l/l，TMB0.32g/l，DMSO 7ml/l，其余为蒸馏水；

终止液：2.2mol/L硫酸溶液。

实施例3：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体100ng/ml，其余是磷酸盐缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体80ng/ml，其余是磷酸盐缓冲液；

底物显色剂A液：醋酸钠27.2g/l，柠檬酸3.2g/l，30%双氧水0.6ml/l，其余为蒸馏水；

底物显色剂B液：乙二胺四乙酸二钠0.4g/l，柠檬酸1.9g/l，甘油0.1l/l，TMB 0.3g/l，DMSO 6ml/l，其余为蒸馏水；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

Claims

1.乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体80-120ng/ml，其余是缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体70-90ng/ml，其余是缓冲液；

终止液：1.8-2.2mol/L硫酸溶液。

2.根据权利要求1所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述检测试剂包括以下分别封装的组分及含量：

鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体100ng/ml，其余是缓冲液；

兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体80ng/ml，其余是缓冲液；

终止液：2.0mol/L硫酸溶液。

3.根据权利要求1或2所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸盐中的一种或多种。

4.权利要求1所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制作方法，其特征在于所述鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是：

1）麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3%-10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；

所述兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是：

5.根据权利要求4所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述底物显色剂中的A、B分别液避光保存，使用的时候根据需要量取等量A与B液混匀后使用。