CN105628924A - 一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法 - Google Patents

一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒的试剂包括：皮质酮标准品，由PBS缓冲溶液组成的1倍稀释液，由PBST缓冲溶液组成的50倍浓缩洗涤液，由皮质酮一抗组成的一抗，由HRP标记山羊抗小鼠二抗组成的酶标二抗，TMB显色液和由硫酸组成的终止液。使用本发明试剂盒测定皮质酮含量对于需自备的仪器和用品的要求较为简单，容易操作，符合一般实验室的测定条件。本发明方法的样本前处理过程快速简单，仅用甲醇溶液沉淀样品中蛋白质特别是IgG即可，仅需数分钟，成本极低；最重要的是经过甲醇沉淀去除样品本身蛋白质和IgG等，就可以解除了一抗不能样品同源的限制性，不会造成假阳性结果。

Description

一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法。
背景技术
皮质酮（CORT）是小分子抗原，在酶联免疫吸附实验中，不易直接包被于微孔板底部。目前市面上皮质酮酶联免疫吸附法检测试剂盒有直接竞争法、间接竞争法、双抗体夹心法等类型试剂盒，并且对样本来源有区分。
但是目前现有的这些皮质酮酶联免疫吸附法检测试剂盒存在有以下几种问题：
1、种类多种，给客户选择增加疑惑，而针对小分子半抗原，本身比较适合的方法就是竞争法。
2、样品来源限制性，比较若一抗是鼠抗，样品来源于鼠，通过HRP标记的抗鼠的二抗作用就会产生假阳性结果。
3、成本高，若选择包被抗体的方法，则浪费抗体，并且酶标抗原也会增大成本。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法，可快速准确的测算出皮质酮的含量。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种皮质酮含量测定试剂盒，包括以下试剂：
皮质酮（CORT）标准品，0.5mg×1支，4℃保存；
1倍稀释液（1×Dilutionbuffer），20mL×3瓶，4℃保存，由PBS缓冲溶液组成；
50倍浓缩洗涤液（50×Washingbuffer），20mL×1瓶，4℃保存，由PBST缓冲溶液组成；
一抗，1.5mL×1支，由皮质酮（CORT）一抗组成；
酶标二抗，1.5mL×1支，由HRP标记山羊抗小鼠二抗组成；
TMB显色液，12mL；
终止液（Stopsolution），6mL×1瓶，4℃保存，由硫酸组成。
进一步的，所述的1倍稀释液中，PBS缓冲溶液的pH=7.4，物质的量浓度为0.01M；
进一步的，所述的50倍浓缩洗涤液中，PBST缓冲溶液由50mL，pH=7.4，物质的量浓度为0.01M的PBS缓冲溶液与2mLtween-20配制而成；
进一步的，所述一抗，皮质酮一抗的体积为45μL；
进一步的，所述酶标二抗中，HRP标记山羊抗小鼠二抗的体积为30μL；
进一步的，所述终止液中，硫酸的物质的量浓度为2M。
本试剂盒应用间接竞争法测定标本中皮质酮（CORT）水平。用纯化的皮质酮（CORT）标准品包被微孔板，制成固相抗原。样品中皮质酮与固相抗原竞争抗体，再利用HRP标记的二抗催化底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质酮（CORT）呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中皮质酮（CORT）浓度。
一种基于酶联免疫吸附实验测定组织、血清、血浆及相关液体样本中皮质酮（CORT）含量的方法，包括以下步骤：
步骤1样本的前处理；
1）血清：血液室温自然凝固90分钟，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶；实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
2）血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，在转速为3000转/分下，离心10分钟；仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
3）尿液：用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；胸腹水、脑脊液参照实行；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
4）细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，仔细收集上清；检测细胞内的成份时，用pH=7.2-7.4的PBS缓冲溶液稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/mL左右；通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份；在转速为2000-3000转/分下，离心20分钟左右，仔细收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
5）组织标本：称取组织1g，加入1mL，pH=7.4的PBS缓冲溶液，充分研磨；在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
步骤2标准品的稀释与加样；
1）用甲醇作为溶剂将皮质酮标准品配制成5mg/mL的标准品母液，根据实验使用量用该试剂盒中的所述稀释液（dilutionbuffer）将所述母液稀释1000倍，使其浓度达到5μg/mL（先稀释100倍，再稀释10倍），并再将其稀释成64μg/L作为标准液；
2）设置浓度分别为64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L的标准曲线；
3）标准曲线每个浓度设置两个重复，浓度稀释采用倍比稀释法，分别取五支EP管，各加入200μL所述稀释液（dilutionbuffer），取200μL的64μg/L标准液加入到第一根EP管混匀成32μg/L标准液，再从其中取出200μL的32μg/L标准液加入到第二根EP管混匀成16μg/L标准液，以此类推，再从其中取出200μL的16μg/L标准液加入到第三根EP管混匀成8μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第四根EP管混匀成4μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第五根EP管混匀成2μg/L标准液；从而得到64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L这6个浓度梯度的标准液；
步骤3样品与抗体预结合；
用0.2%OVA将所述一抗稀释125倍，并且再取5根EP管，分别设为标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔；
标准孔：分别取130μL上述6个浓度梯度的标准液与等体积稀释后的抗体混合；
待测样品孔：取130μl样品与等体积稀释后的所述一抗混合。
空白孔：取260μL所述稀释液（dilutionbuffer）；
对照孔：取130μL所述稀释液（dilutionbuffer）与等体积稀释后的抗体混合；
将上述标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管进行室温摇床预温育40分钟；
步骤4温育；
将上述预温育的标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管混匀后，分别取各EP管中100μL的物质加入到酶标板对应孔中，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；
步骤5洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液（washingbuffer）用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤6加酶标二抗；
400倍稀释所述酶标二抗，每孔加入100μL，用封板膜封板后37℃温育60分钟；
步骤7二次洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液（washingbuffer）用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤8显色；
每孔分别加入100μL所述TMB显色液，混匀，37℃避光显色15-20分钟；
步骤9终止；
每孔分别加50μL所述终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）；
步骤10测定；
以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加所述终止液后15分钟以内进行；
步骤11计算；
抑制率=（A对照-A测定）/A对照×100%；
以皮质酮（CORT）标准液的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制对数标准曲线，根据标准曲线计算相应的样本浓度；再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
本发明的有益效果是：
1、使用本发明试剂盒测定皮质酮含量对于需自备的仪器和用品的要求较为简单，容易操作，符合一般实验室的测定条件。
2、本发明方法的样本前处理过程快速简单，仅用甲醇溶液沉淀样品中蛋白质特别是IgG即可，仅需数分钟，成本极低；最重要的是经过甲醇沉淀去除样品本身蛋白质和IgG等，就可以解除了一抗不能样品同源的限制性，不会造成假阳性结果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种皮质酮含量测定试剂盒，包括以下试剂：
皮质酮（CORT）标准品，0.5mg×1支，4℃保存；
1倍稀释液（1×Dilutionbuffer），20mL×3瓶，4℃保存，由pH=7.4，物质的量浓度为0.01M的PBS缓冲溶液组成；
50倍浓缩洗涤液（50×Washingbuffer），20mL×1瓶，4℃保存，由PBST缓冲溶液组成，PBST缓冲溶液由50mL，pH=7.4，物质的量浓度为0.01M的PBS缓冲溶液与2mLtween-20配制而成；
一抗，1.5mL×1支，由体积为45μL的皮质酮（CORT）一抗组成；
酶标二抗，1.5mL×1支，由体积为30μL的HRP标记山羊抗小鼠二抗组成；
TMB显色液，12mL；
终止液（Stopsolution），6mL×1瓶，4℃保存，由物质的量浓度为2M的硫酸组成。
本试剂盒应用间接竞争法测定标本中皮质酮（CORT）水平。用纯化的皮质酮（CORT）标准品包被微孔板，制成固相抗原。样品中皮质酮与固相抗原竞争抗体，再利用HRP标记的二抗催化底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质酮（CORT）呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中皮质酮（CORT）浓度。
一种基于酶联免疫吸附实验测定组织、血清、血浆及相关液体样本中皮质酮（CORT）含量的方法，包括以下步骤：
步骤1样本的前处理；
1）血清：血液室温自然凝固90分钟，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶；实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
2）血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，在转速为3000转/分下，离心10分钟；仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
3）尿液：用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；胸腹水、脑脊液参照实行；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
4）细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，仔细收集上清；检测细胞内的成份时，用pH=7.2-7.4的PBS缓冲溶液稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/mL左右；通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份；在转速为2000-3000转/分下，离心20分钟左右，仔细收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
5）组织标本：称取组织1g，加入1mL，pH=7.4的PBS缓冲溶液，充分研磨；在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液（dilutionbuffer）稀释甲醇复溶后的样品；
步骤2标准品的稀释与加样；
1）用甲醇作为溶剂将皮质酮标准品配制成5mg/mL的标准品母液，根据实验使用量用该试剂盒中的所述稀释液（dilutionbuffer）将所述母液稀释1000倍，使其浓度达到5μg/mL（先稀释100倍，再稀释10倍），并再将其稀释成64μg/L作为标准液；
2）设置浓度分别为64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L的标准曲线；
3）标准曲线的每个浓度设置两个重复，浓度稀释采用倍比稀释法，分别取五支EP管，各加入200μL所述稀释液（dilutionbuffer），取200μL的64μg/L标准液加入到第一根EP管混匀成32μg/L标准液，再从其中取出200μL的32μg/L标准液加入到第二根EP管混匀成16μg/L标准液，以此类推，再从其中取出200μL的16μg/L标准液加入到第三根EP管混匀成8μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第四根EP管混匀成4μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第五根EP管混匀成2μg/L标准液；从而得到64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L这6个浓度梯度的标准液；
步骤3样品与抗体预结合；
用0.2%OVA将所述一抗稀释125倍，并且再取5根EP管，分别设为标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔；
标准孔：分别取130μL上述6个浓度梯度的标准液与等体积稀释后的抗体混合；
待测样品孔：取130μl样品与等体积稀释后的所述一抗混合。
空白孔：取260μL所述稀释液（dilutionbuffer）；
对照孔：取130μL所述稀释液（dilutionbuffer）与等体积稀释后的抗体混合；
将上述标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管进行室温摇床预温育40分钟；
步骤4温育；
将上述预温育的标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管混匀后，分别取各EP管中100μL的物质加入到酶标板对应孔中，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；
步骤5洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液（washingbuffer）用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤6加酶标二抗；
400倍稀释所述酶标二抗，每孔加入100μL，用封板膜封板后37℃温育60分钟；
步骤7二次洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液（washingbuffer）用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤8显色；
每孔分别加入100μL所述TMB显色液，混匀，37℃避光显色15-20分钟；
步骤9终止；
每孔分别加50μL所述终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）；
步骤10测定；
以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加所述终止液后15分钟以内进行；
步骤11计算；
抑制率=（A对照-A测定）/A对照×100%；
以皮质酮（CORT）标准液的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制对数标准曲线，根据标准曲线计算相应的样本浓度；再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡20分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔,实验方法中包含了两次重复,若增加重复次数,请相应调整。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．TMB显色液请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种皮质酮含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
皮质酮标准品，0.5mg×1支，4℃保存；
1倍稀释液，20mL×3瓶，4℃保存，由PBS缓冲溶液组成；
50倍浓缩洗涤液，20mL×1瓶，4℃保存，由PBST缓冲溶液组成；
一抗，1.5mL×1支，由皮质酮一抗组成；
酶标二抗，1.5mL×1支，由HRP标记山羊抗小鼠二抗组成；
TMB显色液，12mL；
终止液，6mL×1瓶，4℃保存，由硫酸组成。
2.根据权利要求1所述的皮质酮含量测定试剂盒，其特征在于：
所述1×柱体积的稀释液中，PBS缓冲溶液的pH=7.4，物质的量浓度为0.01M；
所述50×柱体积的洗涤液中，PBST缓冲溶液由50mL，pH=7.4，物质的量浓度为0.01M的PBS缓冲溶液与2mLtween-20配制而成；
所述一抗，皮质酮一抗的体积为45μL；
所述酶标二抗中，HRP标记山羊抗小鼠二抗的体积为30μL；
所述终止液中，硫酸的物质的量浓度为2M。
3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的皮质酮含量测定方法，其特征在于，基于酶联免疫吸附实验，包括以下步骤：
步骤1样本的前处理；
1）血清：血液室温自然凝固90分钟，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶；实验时，用所述稀释液稀释甲醇复溶后的样品；
2）血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，在转速为3000转/分下，离心10分钟；仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液稀释甲醇复溶后的样品；
3）尿液：用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；胸腹水、脑脊液参照实行；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液稀释甲醇复溶后的样品；
4）细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集，在转速为3000转/分下，离心10分钟，仔细收集上清；检测细胞内的成份时，用pH=7.2-7.4的PBS缓冲溶液稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/mL；通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份；在转速为2000-3000转/分下，离心20分钟，仔细收集上清；保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液稀释甲醇复溶后的样品；
5）组织标本：称取组织1g，加入1mL，pH=7.4的PBS缓冲溶液，充分研磨；在转速为3000转/分下，离心10分钟，收集上清；每次实验前，样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白，在转速为3000转/分下，离心10分钟，取上清，氮气吹干，20μL甲醇复溶，实验时，用所述稀释液稀释甲醇复溶后的样品；
步骤2标准品的稀释与加样；
用甲醇作为溶剂将皮质酮标准品配制成5mg/mL的标准品母液，根据实验使用量用该试剂盒中的所述稀释液将所述母液稀释1000倍，使其浓度达到5μg/mL，并再将其稀释成64μg/L作为标准液；
设置浓度分别为64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L的标准曲线；
标准曲线的每个浓度设置两个重复，浓度稀释采用倍比稀释法，分别取五支EP管，各加入200μL所述稀释液，取200μL的64μg/L标准液加入到第一根EP管混匀成32μg/L标准液，再从其中取出200μL的32μg/L标准液加入到第二根EP管混匀成16μg/L标准液，以此类推，再从其中取出200μL的16μg/L标准液加入到第三根EP管混匀成8μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第四根EP管混匀成4μg/L标准液，再从其中取出200μL的8μg/L标准液加入到第五根EP管混匀成2μg/L标准液；从而得到64μg/L，32μg/L，16μg/L，8μg/L，4μg/L，2μg/L这6个浓度梯度的标准液；
步骤3样品与抗体预结合；
用0.2%OVA将所述一抗稀释125倍，并且再取5根EP管，分别设为标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔；
标准孔：分别取130μL上述6个浓度梯度的标准液与等体积稀释后的抗体混合；
待测样品孔：取130μl样品与等体积稀释后的所述一抗混合；
空白孔：取260μL所述稀释液；
对照孔：取130μL所述稀释液与等体积稀释后的抗体混合；
将上述标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管进行室温摇床预温育40分钟；
步骤4温育；
将上述预温育的标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管混匀后，分别取各EP管中100μL的物质加入到酶标板对应孔中，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；
步骤5洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤6加酶标二抗；
400倍稀释所述酶标二抗，每孔加入100μL，用封板膜封板后37℃温育60分钟；
步骤7二次洗涤；
将所述的50倍浓缩洗涤液用蒸馏水50倍稀释后备用，弃酶标板中液体，吸水纸上拍干，每孔加入300μL所述浓缩洗涤液，停留1分钟，弃液体，拍干；重复4次；
步骤8显色；
每孔分别加入100μL所述TMB显色液，混匀，37℃避光显色15-20分钟；
步骤9终止；
每孔分别加50μL所述终止液，终止反应；
步骤10测定；
以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度；测定应在加所述终止液后15分钟以内进行；
步骤11计算；
抑制率=（A对照-A测定）/A对照×100%；
以皮质酮标准液的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制对数标准曲线，根据标准曲线计算相应的样本浓度；再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
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