CN107271520A - 基于CdTe‑Ag2Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于CdTe‑Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法和应用，属于纳米材料和电化学分析技术领域。以介孔硒化银负载碲化镉量子点CdTe‑Ag₂Se纳米复合物作为皮质酮捕获抗体基底材料制备传感器，实现对皮质酮的灵敏检测。

Description

基于CdTe-Ag2Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制 备方法和应用

技术领域

本发明涉及基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法和应用。具体涉及碲化镉量子点CdTe QDs为电化学发光材料，利用具有高孔隙率、大比表面积、无毒、生物相容性好等优点的介孔硒化银Ag₂Se作为载体材料增加发光材料与抗体的固载量，制备一种检测皮质酮的无标记型电化学发光传感器，属于纳米材料和电化学分析领域。

背景技术

皮质酮（corticosterone）是人体内由肾上腺皮质分泌的最主要的糖皮质激素，对维持生命所必需的糖、蛋白质、脂肪代谢以及各种器官功能起着重要的作用。体内皮质酮分泌不足或过多均可导致机体免疫功能下降，从而增加机体对许多疾病的易感性。因此，测定其在血液中的含量变化对研究糖皮质激素与人体各种代谢与组织器官功能的关系具有重要意义。

目前，国内外有关尿、血、组织中皮质酮残留检测的报道较多，主要有薄层色谱法、气质联用法、液质联用法及高效液相色谱法等色谱分析法和酶联免疫、放射免疫等免疫分析法。尽管这些检测手段已经非常成熟，有具有一定的优越性，但也存在明显的局限性。其中色谱法灵敏度高，重现性好，但是对于样品纯化要求较高，样品需求量大且需要昂贵的仪器设备。酶联免疫和放射免疫法虽然灵敏度较高，样品前处理简单，但测定周期长，且很难排除激素中结构类似物引起的交叉反应。此外，酶联免疫分析方法重现性较差，放射免疫法还存在放射性废物处理等问题。因此，为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，操作快速简便的电化学发光免疫分析方法。

Juan Huan等（Biosensors and Bioelectronics, 2015, 73: 221-227.）公开了：基于碲化镉量子点的阴极电化学发光构建了一种近红外胆固醇电化学发光传感器。利用胆固醇氧化酶催化胆固醇原位产生过氧化氢作为碲化镉量子点共反应剂，产生碲化镉量子点的阴极电化学发光，提供了一种高效、灵敏的检测手段。本发明与对比文件1相比较：（1）本发明制备了水溶性碲化镉量子点，在高电位下，碲化镉量子点会失去一个电子，形成电子空穴对，具有强氧化性，产生较强且稳定的阳极碲化镉量子点电化学发光；（2）本发明避免使用胆固醇氧化酶，以二丁基乙醇胺作为共反应剂，与碲化镉量子点之间发生电子转移，产生电化学发光，使得传感器性能更加稳定；（3）碲化镉量子点尺寸较小，其固载量越多，所呈现的电化学发光信号越强。因此，本发明制备了一种介孔硒化银，其具有高孔隙率、大比表面积、无毒、生物相容性好等优点，与常规的石墨烯、碳纳米管相比，利用介孔硒化银作为载体材料，其具有丰富的孔隙结构，可增加发光材料碲化镉量子点与抗体的固载量，进而可捕获更多的皮质酮抗原，实现对皮质酮的高灵敏、宽范围检测。

CN104391117A的专利公开了一种基于PPy-NH₂GO-Ag₂Se@CdSe的胃癌抗原电致化学发光传感器的制备方法及应用，并具体公开了Ag₂Se@CdSe纳米大头针的制备方法，以Ag₂Se@CdSe纳米大头针为电化学发光信号源，利用PPy-NH₂GO大的比表面积将Ag₂Se@CdSe固载在PPy-NH₂GO的表面，PPy-NH₂GO优良的导电性可以有效加强传感器的发光信号。本发明与对比文件2相比较：（1）本发明直接在介孔硒化银表面原位生长碲化镉量子点，碲化镉量子点分布更加均匀，性能更加稳定；（2）利用介孔硒化银负载碲化镉量子点，介孔硒化银具有发达的孔隙结构，且具有较大的比表面积，大量的碲化镉量子点可分布在介孔硒化银的孔道和表面，进一步增强传感器所呈现的电化学发光强度，提高传感器的灵敏度。本发明所制备的电化学发光传感器对皮质酮的检测范围为0.001~200 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL，该方法可有效用于皮质酮的分析，具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前皮质酮检测灵敏度低、检测耗时、准确度低等的不足。

发明内容

本发明的目的之一是合成具有良好电化学发光性能、高稳定性的碲化镉量子点。该发明的碲化镉/二丁基乙醇胺体系，相对于碲化镉/过硫酸钾、碲化镉/过氧化氢电化学发光体系，该发明采用二丁基乙醇胺作为共反应剂，可采集碲化镉量子点的阳极电化学发光信号，信号更强，更加稳定。

本发明的目的之二是同时采用两种表面活性剂，合成介孔硒化银。在合成过程中，相对于传统合成方法仅加入一种表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，该发明同时使用两种表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基苯磺酸钠，十六烷基三甲基溴化铵属于阳离子表面活性剂，其附着在硒化银纳米粒子表面可防止大量硒化银粒子发生团聚，十二烷基苯磺酸钠属于阴离子表面活性剂，其使用可在一定程度上减弱硒化银纳米粒子同性电荷，两种表面活性剂同时使用可保证硒化银纳米粒子不发生团聚的前提下，有效地促进硒化银纳米粒子组装成纳米多孔结构。

本发明的目的之三是合成具有高孔隙率、大比表面积、无毒、生物相容性好等优点的介孔硒化银。相比于常规的载体材料石墨烯、碳纳米管等纳米材料，介孔硒化银具有丰富的孔隙结构，有利于电解液中共反应剂的扩散，使共反应剂快速到达电极表面，增强电化学发光响应；介孔硒化银由较多的纳米粒子组装形成，具有发达的孔隙结构。通过向介孔硒化银中滴加碲化镉量子点的前驱体，可在介孔硒化银孔道和表面形成大量的碲化镉量子点，使得传感器表现出较强的电化学发光强度，提高传感器的灵敏度。

本发明的目的之四是合成CdTe-Ag₂Se纳米复合物。相对于独立的碲化镉量子点，其不易固载在电极上，CdTe-Ag₂Se纳米复合物起到对碲化镉量子点很好的固载作用；相对于独立的硒化银，其电化学发光信号弱，CdTe-Ag₂Se纳米复合物表现出更强更稳定的电化学发光信号，并且CdTe-Ag₂Se纳米复合物具有良好的导电性和生物相容性。在原位生长碲化镉量子点过程中，加入巯基丙酸，直接在CdTe-Ag₂Se纳米复合物表面引入羧基基团，通过羧基的活化，可将皮质酮抗体捕获至电极表面。

本发明的目的之五是针对现有的皮质酮检测方法存在的问题，提供一种简单快速可靠的基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器，通过不同浓度的皮质酮对CdTe-Ag₂Se纳米复合物电化学发光性能的影响，实现对皮质酮的快速、灵敏、特异和高效检测。

本发明的技术方案如下：

1. 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法

（1）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

1）介孔硒化银Ag₂Se的制备

将5~15 mL十八烷基胺加入50 mL的烧杯中，加热至150~200 ºC，加入0.3~0.7 g的硝酸银，磁力搅拌5~15 min，溶液颜色由无色变为亮黄色，最后变成深褐色；继续加入0.1~0.15g硒粉，溶液瞬间由深褐色变为黑色，搅拌10 min，离心分离，用乙醇洗涤3次，制得产物Ag₂Se纳米粒子；将产物Ag₂Se纳米粒子分散到20 mL非极性溶剂环己烷中，制得Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液；

将5~15 mL Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液、0.2~0.7 g十六烷基三甲基溴化铵和0.2~0.6g十二烷基苯磺酸钠加入到80~120 mL超纯水中，室温搅拌1 h，加热到60~100 ºC，继续搅拌1 h使环己烷蒸发除去，离心分离，将获得的沉淀物放进管式炉，在氩气的保护下300 ºC煅烧2 h，制得介孔硒化银Ag₂Se；

2）CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液的制备

将50 mg介孔硒化银Ag₂Se溶于50 mL超纯水中，加入1.6 mL、浓度为0.05~0.15 mol/L的氯化镉水溶液，在搅拌下加入290~297 mg六偏磷酸钠和30~40 μL巯基丙酸，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调pH为8.0，继续加入3.3~7.3 mg Na₂TeO₃，溶液颜色立即变为黄绿色，将混合溶液在100 ºC下回流10 min，加入2~3 mL氨水，继续回流25 h，离心分离，并用丙酮洗涤3次，将产物分散到超纯水中，得到CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液，4 ºC储存；

3）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

在CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液中，加入1 mL、浓度为0.4~0.6 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC溶液，1 mL、浓度为0.09~0.15 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和10~100 μL、浓度为1 mg/mL的皮质酮抗体Ab溶液，在4 ºC下振荡孵化24 h，离心除去过量的皮质酮抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液， 4 ºC下备用；

（2）电化学发光传感器的制备方法

1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

2）滴涂6 μL、浓度为0.5~2 mg/mL的抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液于电极表面，4 ºC保存至干燥；

3）滴加6 μL、质量分数为0.1~0.5%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，4 ºC晾干；

4）滴加6 μL不同浓度的皮质酮抗原，4 ºC下孵化20~40 min，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 ºC 晾干，制得基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器。

2. 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器用于皮质酮检测的应用

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 V~1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 5.5~8.4的含15~25 mmol/L二丁基乙醇胺的PBS溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的皮质酮产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测的皮质酮抗原样品溶液代替皮质酮抗原标准溶液进行检测，本发明的基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器用于皮质酮检测，检测范围为0.001~200 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。

本发明的有益成果

（1）本发明制备了一种水溶性碲化镉量子点，将其作为电化学发光材料，采用二丁基乙醇胺作为共反应剂，发明了一种碲化镉量子点阳极电化学发光免疫传感器；

（2）本发明合成了一种介孔硒化银纳米材料，其具有高孔隙率和大的比表面积等优点，有利于电解液中共反应剂的扩散，并可将大量发光材料固定在其表面或孔内，有效增强碲化镉量子点的电化学发光信号；

（3）本发明制备了CdTe-Ag₂Se纳米复合物。利用其良好的导电性和生物相容性，将其作为传感平台，制备的CdTe-Ag₂Se纳米复合物表面含大量羧基基团，可将皮质酮抗体有效地固定在CdTe-Ag₂Se纳米复合物表面；

（4）本发明利用抗原、抗体之间的免疫反应，提高了检测方法的特异性；

（5）本发明基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物构建了一种无标记型电化学发光传感器用于皮质酮的检测。操作简单，响应时间短，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。

具体实施方式

实施例1

1. 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法

（1）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

1）介孔硒化银Ag₂Se的制备

将5 mL十八烷基胺加入50 mL的烧杯中，加热至150 ºC，加入0.3 g的硝酸银，磁力搅拌5 min，溶液颜色由无色变为亮黄色，最后变成深褐色；继续加入0.1 g硒粉，溶液瞬间由深褐色变为黑色，搅拌10 min，离心分离，用乙醇洗涤3次，制得产物Ag₂Se纳米粒子；将产物Ag₂Se纳米粒子分散到20 mL非极性溶剂环己烷中，制得Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液；

将5 mL Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液、0.2 g十六烷基三甲基溴化铵和0.2 g十二烷基苯磺酸钠加入到80 mL超纯水中，室温搅拌1 h，加热到60 ºC，继续搅拌1 h使环己烷蒸发除去，离心分离，将获得的沉淀物放进管式炉，在氩气的保护下300 ºC煅烧2 h，制得介孔硒化银Ag₂Se；

2）CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液的制备

将50 mg介孔硒化银Ag₂Se溶于50 mL超纯水中，加入1.6 mL、浓度为0.05 mol/L的氯化镉水溶液，在搅拌下加入290 mg六偏磷酸钠和30 μL巯基丙酸，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调pH为8.0，继续加入3.3 mg Na₂TeO₃，溶液颜色立即变为黄绿色，将混合溶液在100 ºC下回流10 min，加入2 mL氨水，继续回流25 h，离心分离，并用丙酮洗涤3次，将产物分散到超纯水中，得到CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液，4 ºC储存；

3）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

在CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液中，加入1 mL、浓度为0.4 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC溶液，1 mL、浓度为0.09 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和10 μL、浓度为1 mg/mL的皮质酮抗体Ab溶液，在4 ºC下振荡孵化24 h，离心除去过量的皮质酮抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液，4 ºC下备用；

（2）电化学发光传感器的制备方法

1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

2）滴涂6 μL、浓度为0.5 mg/mL的抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液于电极表面，4ºC保存至干燥；

3）滴加6 μL、质量分数为0.1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，4 ºC晾干；

4）滴加6 μL不同浓度的皮质酮抗原，4 ºC下孵化20 min，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 ºC 晾干，制得基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器。

实施例2

1. 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法

（1）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

1）介孔硒化银Ag₂Se的制备

将15 mL十八烷基胺加入50 mL的烧杯中，加热至200 ºC，加入0.7 g的硝酸银，磁力搅拌15 min，溶液颜色由无色变为亮黄色，最后变成深褐色；继续加入0.15 g硒粉，溶液瞬间由深褐色变为黑色，搅拌10 min，离心分离，用乙醇洗涤3次，制得产物Ag₂Se纳米粒子；将产物Ag₂Se纳米粒子分散到20 mL非极性溶剂环己烷中，制得Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液；

将15 mL Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液、0.7 g十六烷基三甲基溴化铵和0.6 g十二烷基苯磺酸钠加入到120 mL超纯水中，室温搅拌1 h，加热到100 ºC，继续搅拌1 h使环己烷蒸发除去，离心分离，将获得的沉淀物放进管式炉，在氩气的保护下300 ºC煅烧2 h，制得介孔硒化银Ag₂Se；

2）CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液的制备

将50 mg介孔硒化银Ag₂Se溶于50 mL超纯水中，加入1.6 mL、浓度为0.15 mol/L的氯化镉水溶液，在搅拌下加入297 mg六偏磷酸钠和40 μL巯基丙酸，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调pH为8.0，继续加入7.3 mg Na₂TeO₃，溶液颜色立即变为黄绿色，将混合溶液在100 ºC下回流10 min，加入3 mL氨水，继续回流25 h，离心分离，并用丙酮洗涤3次，将产物分散到超纯水中，得到CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液，4 ºC储存；

3）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

在CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液中，加入1 mL、浓度为0.6 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC溶液，1 mL、浓度为0.15 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和100 μL、浓度为1 mg/mL的皮质酮抗体Ab溶液，在4 ºC下振荡孵化24 h，离心除去过量的皮质酮抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液，4 ºC下备用；

（2）电化学发光传感器的制备方法

1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

2）滴涂6 μL、浓度为0.5~2 mg/mL的抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液于电极表面，4 ºC保存至干燥；

3）滴加6 μL、质量分数为0.1~0.5%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，4 ºC晾干；

4）滴加6 μL不同浓度的皮质酮抗原，4 ºC下孵化20~40 min，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 ºC 晾干，制得基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器。

实施例3

1. 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法

（1）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

1）介孔硒化银Ag₂Se的制备

将10 mL十八烷基胺加入50 mL的烧杯中，加热至170 ºC，加入0.5 g的硝酸银，磁力搅拌10 min，溶液颜色由无色变为亮黄色，最后变成深褐色；继续加入0.12 g硒粉，溶液瞬间由深褐色变为黑色，搅拌10 min，离心分离，用乙醇洗涤3次，制得产物Ag₂Se纳米粒子；将产物Ag₂Se纳米粒子分散到20 mL非极性溶剂环己烷中，制得Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液；

将8 mL Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液、0.5 g十六烷基三甲基溴化铵和0.4 g十二烷基苯磺酸钠加入到100 mL超纯水中，室温搅拌1 h，加热到80 ºC，继续搅拌1 h使环己烷蒸发除去，离心分离，将获得的沉淀物放进管式炉，在氩气的保护下300 ºC煅烧2 h，制得介孔硒化银Ag₂Se；

2）CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液的制备

将50 mg介孔硒化银Ag₂Se溶于50 mL超纯水中，加入1.6 mL、浓度为0.10 mol/L的氯化镉水溶液，在搅拌下加入295 mg六偏磷酸钠和35 μL巯基丙酸，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调pH为8.0，继续加入5.3 mg Na₂TeO₃，溶液颜色立即变为黄绿色，将混合溶液在100 ºC下回流10 min，加入1.5 mL氨水，继续回流25 h，离心分离，并用丙酮洗涤3次，将产物分散到超纯水中，得到CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液，4 ºC储存；

3）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

在CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液中，加入1 mL、浓度为0.5 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC溶液，1 mL、浓度为0.12 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和60 μL、浓度为1 mg/mL的皮质酮抗体Ab溶液，在4 ºC下振荡孵化24 h，离心除去过量的皮质酮抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液，4 ºC下备用；

（2）电化学发光传感器的制备方法

1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

2）滴涂6 μL、浓度为1 mg/mL的抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液于电极表面，4 ºC保存至干燥；

3）滴加6 μL、质量分数为0.3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，4 ºC晾干；

4）滴加6 μL不同浓度的皮质酮抗原，4 ºC下孵化30 min，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 ºC 晾干，制得基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器。

实施例4 基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器用于皮质酮的检测

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，实施例1、实施例2或实施例3所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 V~1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 5.5~8.4的含15~25 mmol/L二丁基乙醇胺的PBS溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的皮质酮产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测的皮质酮抗原样品溶液代替皮质酮抗原标准溶液进行检测，检测范围为0.001~200 ng/mL，检测限为0.21 pg/mL。

Claims (2)

1.基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

1）介孔硒化银Ag₂Se的制备

将5~15 mL十八烷基胺加入50 mL的烧杯中，加热至150~200 ºC，加入0.3~0.7 g的硝酸银，磁力搅拌5~15 min，溶液颜色由无色变为亮黄色，最后变成深褐色；继续加入0.1~0.15g硒粉，溶液瞬间由深褐色变为黑色，搅拌10 min，离心分离，用乙醇洗涤3次，制得产物Ag₂Se纳米粒子；将产物Ag₂Se纳米粒子分散到20 mL非极性溶剂环己烷中，制得Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液；

将5~15 mL Ag₂Se纳米粒子环己烷溶液、0.2~0.7 g十六烷基三甲基溴化铵和0.2~0.6 g十二烷基苯磺酸钠加入到80~120 mL超纯水中，室温搅拌1 h，加热到60~100 ºC，继续搅拌1h使环己烷蒸发除去，离心分离，将获得的沉淀物放进管式炉，在氩气的保护下300 ºC煅烧2h，制得介孔硒化银Ag₂Se；

2）CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液的制备

将50 mg介孔硒化银Ag₂Se溶于50 mL超纯水中，加入1.6 mL、浓度为0.05~0.15 mol/L的氯化镉水溶液，在搅拌下加入290~297 mg六偏磷酸钠和30~40 μL巯基丙酸，用1.0 mol/L的氢氧化钠溶液调pH为8.0，继续加入3.3~7.3 mg Na₂TeO₃，溶液颜色立即变为黄绿色，将混合溶液在100 ºC下回流10 min，加入2~3 mL氨水，继续回流25 h，离心分离，并用丙酮洗涤3次，将产物分散到超纯水中，得到CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液，4 ºC储存；

3）抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液的制备

在CdTe-Ag₂Se纳米复合物溶液中，加入1 mL、浓度为0.4~0.6 mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺EDC溶液，1 mL、浓度为0.09~0.15 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和10~100 μL、浓度为1 mg/mL的皮质酮抗体Ab溶液，在4 ºC下振荡孵化24 h，离心除去过量的皮质酮抗体Ab，将产物分散到1 mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液， 4 ºC下备用；

（2）基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器的制备方法

1）将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；

2）滴涂6 μL、浓度为0.5~2 mg/mL的抗体捕获基底材料CdTe-Ag₂Se-Ab溶液于电极表面，4 ºC保存至干燥；

3）滴加6 μL、质量分数为0.1~0.5%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液PBS冲洗电极表面，4 ºC晾干；

4）滴加6 μL不同浓度的皮质酮抗原，4 ºC下孵化20~40 min，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 ºC 晾干，制得基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器。

2.如权利要求1所述的制备方法制备的基于CdTe-Ag₂Se纳米复合物的皮质酮电化学发光传感器作为皮质酮检测的应用，其特征在于，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为0 V~1.4 V，扫描速率为0.1 V/s；

（2）在10 mL、pH 5.5~8.4的含15~25 mmol/L二丁基乙醇胺的PBS溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的皮质酮产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；

（3）将待测的皮质酮抗原样品溶液代替皮质酮抗原标准溶液进行检测。