CN104502294B

CN104502294B - 一种三元复合体系检测探针的构建方法

Info

Publication number: CN104502294B
Application number: CN201410851334.XA
Authority: CN
Inventors: 王承克; 王坤; 董晓娅; 刘倩
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2017-05-03
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104502294A

Abstract

本发明一种三元复合体系检测探针的构建方法，属于生物传感领域。利用建立的方法设计出能够对待测分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测的检测探针。特点在于利用核酸碱基互配和核酸链连续互补原理，对检测信号放大，属于生物传感领域。首先用待测分子与核酸链H₁作用后，引发其构型改变，使其能与核酸链H₂的碱基互补配对，使H₂构型改变，改变后的H₂又能与H₁的碱基互补配对，实现单一检测分子引发核酸链式反应的目的。最后，在氯化血红素存在时，H₂上的过氧化物酶模拟序列能够催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，在盐酸溶液存在时产生有色溶液。根据溶液在一定波长处吸光度与待测分子浓度之间的关系，可以得到其检测曲线。

Description

一种三元复合体系检测探针的构建方法

技术领域

本发明专利涉及一种构建三元复合体系检测探针的技术，可用于对赭曲霉毒素A进行灵敏检测。特点在于利用适配体、核酸碱基互配和核酸链连续互补，对检测信号放大，属于生物传感领域。

背景技术

赭曲霉毒素A是一种常见的霉菌毒素，广泛存在于霉变的水果和谷物中。其毒性主要是肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。

目前，赭曲霉毒素A在食品中的检测手段多为生物鉴定法、化学分析法以及仪器分析法。其中生物鉴定法主要用于定性判断真菌毒素的存在与否，其缺点在于灵敏度不高。化学分析法对操作人员技术要求不高，但结果重现性差。目前常用的仪器分析法包括高效液相色谱法和质谱法，具有灵敏度高、重现性好的优点，但所用仪器昂贵，对操作人员技术要求高，且用到大量有机溶剂，因此不利于推广使用。近年来，抗体技术在构建大分子探针，如蛋白质的检测方面有许多应用，但一些小分子，如赭曲霉毒素A，相应的抗体难以制备，且亲和力弱，因此不利于灵敏度高的检测探针的制备。发展简便、灵敏、快速、高效的小分子检测探针对于食品安全的保障具有重要意义。

核酸适配体的使用能够在一定程度上解决这一难题。适配体是一段能与待检测分子通过构型互补，改变三维结构、实现对待测分子高亲和性、高特异性结合的一段寡核苷酸序列。与抗体相比，其具有以下优势：(1)靶分子的分子量更广，包括大分子量的蛋白质，核酸，小分子量的无机、有机化合物；(2)能够通过核酸构象的改变，实现对靶分子的高亲和性结合；(3)适配体可以人工合成，且性质稳定，因此适配体在小分子检测探针的构建中具有非常好的应用前景。尽管目前有利用适配体构建检测探针的报道，但构建三元体系，利用三元体系中适配体对小分子的识别作用，过氧化物酶模拟单元实现对检测信号的免标测定，并结合核酸链式反应对信号的放大效应进行检测探针的构建，用于小分子的检测尚未见报道。

本项目中，我们利用了核酸适配体和核酸链式反应原理，设计了两条核酸序列H₁和H₂，在不含有待测目标分子时，二者初始构象为首尾相连的“发夹”结构，H₁不能与H₂结合，而当目标分子存在时，包含适配体的探针分子H₁“发夹”结构能够打开，暴露出与H₂碱基互补的DNA片段，进而通过与H₂的结合，使H₂的“发夹”结构打开，H₂包含能够在氯化血红素存在时催化过氧化氢氧化四甲基联苯胺，产生有色物质的DNA片段(过氧化物酶模拟片段)。“发夹”结构打开后的H₂又可以与H₁碱基互补，进而引发新的H₁片段“发夹”结构打开，通过多轮循环反应，可以实现检测信号的放大。基于此，构建了包含适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应单元的三元复合体系检测探针，能够用于小分子，如赭曲霉毒素A的检测。

发明内容

技术问题：本发明提供一种基于适配体，过氧化物酶模拟片段和核酸链式反应三元体系的构建方法，能实现操作简单、灵敏快速，无需使用信号分子标记，对检测信号多级放大的目的，并对小分子，如赭曲霉毒素A进行灵敏检测。首先，设计出DNA片段H₁(H₁含有可识别待测分子(本项目以赭曲霉毒素A为例)的适配体)和DNA片段H₂，(H₂含有能在氯化血红素存在时催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段))，二者初始结构为首尾相连的“发夹”结构。在没有加入赭曲霉毒素A前，H₁由于内部碱基互补，产生“发夹”结构，首尾相连，不能与DNA片段H₂作用，当赭曲霉毒素A加入后，由于适配体与赭曲霉毒素A作用后，空间结构改变，使“发夹”结构打开，能够与DNA片段H₂的一端互补，诱导原来为“发夹”结构的H₂打开，进而再与H₁作用，经过循环反应后，能够形成含有大量过氧化物酶模拟片段的长链DNA，通过加入含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，使检测信号放大。

技术方案：一种基于适配体，过氧化物酶模拟片段和DNA杂交链式反应原理，构建三元复合体系检测探针的方法。首先设计出特殊的DNA片段H₁，使H₁中含有能识别小分子(如赭曲霉毒素A)的适配体，初始构象为首尾相连的“发夹”结构，通过加入检测分子使H₁的结构被破坏，暴露出能与DNA片段H₂反应的碱基；进而加入特殊设计的DNA片段H₂，H₂初始结构也为首尾相连的“发夹”结构，并且含有能在氯化血红素存在时催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段)。结构改变后的H₁与H₂反应，使H₂的碱基互补链打开，“发夹”结构被破坏，暴露出能与H₁作用的碱基序列，同时过氧化物酶模拟片段也暴露出。经过多轮循环后，许多组H₁与H₂将形成长的DNA链，每个链上含有大量过氧化物酶模拟片段。最后，加入H₂O₂和四甲基联苯胺，经过信号放大后，测定溶液吸光度，得到相应的检测信号，建立检测信号与赭曲霉毒素A浓度间的联系，获取检测曲线。

具体来讲，一种三元复合体系检测探针的构建方法，按照下述步骤进行：

(1)首先选取能与小分子赭曲霉毒素A作用的DNA片段(适配体)，根据适配体碱基序列，设计能与其形成分子内杂交互补的片段，连接到适配体的3’末端，形成三元复合体系中的探针H₁。

(2)根据H₁ 3’端的碱基序列，设计能够与其杂交互补的片段a，同时寻找能与a形成分子内杂交互补的片段b，连接到其5’末端，再选取能模拟过氧化物酶的碱基片段c，将以上三个片段依从3’端到5’端分别为a-c-b的顺序排列，形成三元复合体系中的探针H₂。

(3)小分子赭曲霉毒素A与H₁的反应：取一定量含有赭曲霉毒素A的待测溶液，在其中加入H₁水溶液，使H₁终浓度为1-100nM，然后加入10μL CaCl₂水溶液和10μL KCl水溶液，使CaCl₂终浓度为10mM，KCl终浓度为20mM，最后加入10μL氯化血红素水溶液，使氯化血红素终浓度为150nM，混合均匀，反应10分钟。

(4)加入H₂后的链增长：在前述(3)的溶液中接着加入H₂水溶液，使H₂终浓度为1-100nM，充分混合均匀后，反应60分钟。

(5)显色过程：在前述(4)的溶液中加入80μL含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，使最终H₂O₂和四甲基联苯胺的浓度分别为0.03％和0.2μg/mL。最后反应60分钟后，加入50μL 1M的盐酸，5分钟后测定波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线。

(6)赭曲霉毒素A的检测：取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5μL，再加入45μL水，作为实际样品(待测溶液)。重复上述(3)(4)步骤，以及(5)步骤中除去绘制绘吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线的其余步骤。将得到的吸光度值与(5)中得到的浓度关系曲线进行对比，得到对应的赭曲霉毒素A的浓度，实现样品中赭曲霉毒素A的检测，从而实现一种三元复合体系检测探针方法的构建。

其中所述的H₁包含可以在CaCl₂存在时与赭曲霉毒素A相互作用并改变构型的适配体，即：5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA CGC CAC，所述的H₂包含能在氯化血红素存在时催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生有色物质的片段(过氧化物酶模拟片段)，即：CT GGG AGG GAG GGA GGG，该片段能够在KCl存在时形成四联体的空间结构，H₁的5’端可以与赭曲霉毒素A发生特异性相互作用，且可以与H₂的3’端互补，H₂的5’端可以与H₁的3’端互补，在没有与赭曲霉毒素A作用前，H₁的3’端可以与其5’端的7-18位碱基互补，H₂的3’可以与其5’端的28-35位碱基互补形成首尾相连的“发夹”结构。

所绘制的浓度曲线是指不同浓度的赭曲霉毒素A与H₁反应后，再加入H₂，最后加入含H₂O₂的四甲基联苯胺显色后，根据不同浓度赭曲霉毒素A对应的溶液在波长为450纳米处的吸光度对赭曲霉毒素A浓度绘制的曲线。

本发明的有益效果是：利用核酸链式反应原理，将适配体和过氧化物酶模拟片段分别设计到两条能互补杂交配对的DNA中，构建出三元复合体系的DNA检测探针。通过赭曲霉毒素A与DNA链H₁作用后H₁链构型的改变，使H₁“发夹”结构的打开，引发链式反应的进行，通过与H₂碱基互补使链长增长，利用H₂链上的过氧化物酶模拟片段，催化H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生有色物质，实现检测信号的放大。相比以往小分子的检测方法，该发明具有以下优点：

(1)无需对DNA进行巯基、氨基等修饰，降低了实验材料的成本。

(2)通过DNA序列的设计和小分子待测物引发的核酸链式反应，实现了一个小分子待测物产生多个检测分子的结果，与以往方法中一个检测分子对应产生一个信号分子相比，检测信号得到放大，检测灵敏度得到提高。

(3)通过H₂链中过氧化物酶模拟片段的引入，使待测小分子的浓度与H₂O₂氧化四甲基联苯胺产生的有色物质的量成比例，简化了信号获得的过程，同时避免了对DNA进行分子标记。

附图说明

图1为三元复合体系DNA的设计图以及赭曲霉毒素A检测的示意图。

图2为溶液中赭曲霉毒素A的检测曲线。

具体实施方式

实施例1：

在50μL一定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μL的DNA H₁，(H₁的DNA序列为GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使H₁的终浓度为1nM，再加入10μL CaCl₂溶液和10μL KCl溶液，使CaCl₂终浓度为10mM，KCl终浓度为20mM，再加入10μL氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150nM，混合均匀，反应10分钟。再加入10μL的另一种DNA，即H₂(H₂的DNA序列为CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGG TGTGGGTGGC G)水溶液，使H₂终浓度为1nM，混合均匀，反应1小时。再加入80μL含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中H₂O₂浓度为：0.03％，四甲基联苯胺浓度为：0.2μg/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50μL 1M的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素A浓度的曲线。

取可能含有赭曲霉毒素A的食品(如面粉)1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5μL，再加入45μL水，作为实际样品(待测溶液)。重复上述步骤，将得到的吸光度值上述得到的浓度关系曲线进行对比，就得到了对应的赭曲霉毒素A的浓度。

实施例2：

在50μL一定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μL的DNA H₁，(H₁的DNA序列为GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使H₁的终浓度为50nM，再加入10μL CaCl₂溶液和10μL KCl溶液，使CaCl₂终浓度为10mM，KCl终浓度为20mM，再加入10μL氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150nM，混合均匀，反应10分钟。再加入10μL的另一种DNA，即H₂(H₂的DNA序列为CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGG TGTGGGTGGC G)水溶液，使H₂终浓度为50nM，混合均匀，反应1小时。再加入80μL含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中H₂O₂浓度为：0.03％，四甲基联苯胺浓度为：0.2μg/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50μL 1M的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素A浓度的曲线，如图2所示。

实施例3：

在50μL一定浓度的赭曲霉毒素A溶液中加入10μL的DNA H₁，(H₁的DNA序列为GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC)水溶液，使H₁的终浓度为100nM，再加入10μL CaCl₂溶液和10μL KCl溶液，使CaCl₂终浓度为10mM，KCl终浓度为20mM，再加入10μL氯化血红素溶液，使氯化血红素浓度为150nM，混合均匀，反应10分钟。再加入10μL的另一种DNA，即H₂(H₂的DNA序列为CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGG TGTGGGTGGC G)水溶液，使H₂终浓度为100nM，混合均匀，反应1小时。再加入80μL含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液，(加入后溶液中H₂O₂浓度为：0.03％，四甲基联苯胺浓度为：0.2μg/mL)混合均匀，反应1小时，再加入50μL 1M的盐酸，5分钟后测定溶液在波长为450纳米处的吸光度。绘制吸光度与赭曲霉毒素A浓度的曲线。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种三元复合体系检测探针的构建方法

<160> 1

<170> Patent In version 3.3

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

1 GATCGGGTGT GGGTGGCGTA AAGGGAGCAT CGGACACGCC ACCCACAC 48

<110> 江苏大学

<120> 一种三元复合体系检测探针的构建方法

<160> 2

<170> Patent In version 3.3

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

1 CCACACCCGA TCCTGGGAGG GAGGGAGGGG TGTGGGTGGC G 41

Claims

1.一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）首先选取能与小分子赭曲霉毒素A作用的DNA片段作为适配体，根据适配体碱基序列，设计能与其形成分子内杂交互补的片段，连接到适配体的3’末端，形成三元复合体系中的探针H₁；

（2）根据H₁ 3’端的碱基序列，设计能够与其杂交互补的片段a，同时寻找能与a形成分子内杂交互补的片段b，连接到其5’末端，再选取能模拟过氧化物酶的碱基片段c，将以上三个片段依从3’端到5’端分别为a-c-b的顺序排列，形成三元复合体系中的探针H₂；

（3）小分子赭曲霉毒素A与H₁的反应：取一定量含有赭曲霉毒素A的待测溶液，在其中加入H₁水溶液，使H₁终浓度为1-100 nM，然后加入10微升CaCl₂水溶液和10微升 KCl水溶液，使CaCl₂终浓度为10 mM，KCl终浓度为20 mM，最后加入10微升氯化血红素水溶液，使氯化血红素终浓度为150 nM，混合均匀，反应10分钟；

（4）加入H₂后的链增长：在前述（3）的溶液中接着加入H₂水溶液，使H₂终浓度为1-100nM，充分混合均匀后，反应60分钟；

（5）显色过程：在前述（4）的溶液中加入80微升含有H₂O₂的四甲基联苯胺溶液；

最后反应60分钟后，加入50微升1 M的盐酸，5分钟后测定波长为450纳米处的吸光度；绘制吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线；

（6）赭曲霉毒素A的检测：取可能含有赭曲霉毒素A的食品1克，加入甲醇10mL，搅拌5分钟后，将溶液离心，吸取上部溶液5微升，再加入45微升水，作为实际样品待测溶液；

重复上述（3）（4）步骤，以及（5）步骤中除去绘制绘吸光度与待测溶液中赭曲霉毒素A的浓度关系曲线的其余步骤；

将得到的吸光度值与（5）中得到的浓度关系曲线进行对比，得到对应的赭曲霉毒素A的浓度，实现样品中赭曲霉毒素A的检测，从而实现一种三元复合体系检测探针方法的构建。

2.根据权利要求1所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于可能含有赭曲霉毒素A的食品为面粉。

3.根据权利要求1所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段H₁如SEQUENCE LISTING1所示。

4.根据权利要求1所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的DNA片段H₂为所述的H₂如SEQUENCE LISTING2所示。

5.根据权利要求1所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于其中所述的三元复合体系检测探针在检测赭曲霉毒素A的应用。

6.根据权利要求1所述的一种构建三元复合体系检测探针的方法，其特征在于最终H₂O₂和四甲基联苯胺的浓度分别为0.03%和0.2微g/mL。