CN110456059A - 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用 - Google Patents

一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110456059A
CN110456059A CN201910583426.7A CN201910583426A CN110456059A CN 110456059 A CN110456059 A CN 110456059A CN 201910583426 A CN201910583426 A CN 201910583426A CN 110456059 A CN110456059 A CN 110456059A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
detection
hydrogel
card
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910583426.7A
Other languages
English (en)
Inventor
王彦波
傅玲琳
周瑾茹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Gongshang University
Original Assignee
Zhejiang Gongshang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Gongshang University filed Critical Zhejiang Gongshang University
Priority to CN201910583426.7A priority Critical patent/CN110456059A/zh
Publication of CN110456059A publication Critical patent/CN110456059A/zh
Priority to NL2025926A priority patent/NL2025926B1/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用，该检测卡包括：底卡，所述底卡设有加样区和检测区，所述加样区连接所述检测区，以使所述加样区内的样品移动至所述检测区；所述检测区设有核酸适配体‑水凝胶膜管；面卡，所述面卡设有加样孔，所述加样孔适于将样品加入所述加样区。本发明的检测卡检测灵敏度高，操作简便，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量。

Description

一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用
技术领域
本发明涉过敏原检测领域，具体涉及一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用。
背景技术
近年来，有关食源性虾、蟹过敏的报道屡见不鲜。在联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的食物之中，虾鱼蟹等甲壳类动物及其制品是重要的一类。据统计，在亚洲国家中，大约有40％的成人和儿童会对甲壳类产生过敏反应。
目前，美国、欧盟和新西兰等国家均要求对过敏食品进行过敏原标示，以提醒消费者，避免误食。因此，过敏原含量的检测是进行过敏食品的生产、评估和标示工作的基础和首要任务。精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)和原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)广泛存在于虾、蟹等甲壳类中，是甲壳类中两种主要的过敏原。
相关技术中甲壳类精氨酸激酶检测方法主要有ELISA、RT-PCR、LC-MS等技术。这些方法都需要高端仪器设备及专业人员操作，检测时间较长，操作较为复杂。
由此，甲壳类过敏原的检测方法有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种甲壳类过敏原的检测卡。该检测卡检测灵敏度高，操作简便，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种甲壳类过敏原的检测卡。根据本发明的实施例，该检测卡包括：底卡，所述底卡设有加样区和检测区，所述加样区连接所述检测区，以使所述加样区内的样品移动至所述检测区；所述检测区设有核酸适配体-水凝胶膜管；面卡，所述面卡设有加样孔，所述加样孔适于将样品加入所述加样区。
根据本发明实施例的检测卡，通过核酸适配体-水凝胶膜管中核酸适配体-水凝胶特异性结合样品中的原肌球蛋白和精氨酸激酶，从而影响水凝胶在毛细管中的行为方式，记录不同浓度迁移时间变化，再根据变化曲线换算待测样品中甲壳类过敏原中原肌球蛋白和精氨酸激酶的浓度，达到定量检测的水平。本发明的检测卡结构简单，操作简便，实验室人员稍加培训即可操作，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种甲壳类过敏原的检测卡，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述核酸适配体-水凝胶膜管包括二氧化硅毛细管和核酸适配体-水凝胶，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体适于与原肌球蛋白和精氨酸激酶特异性结合。
根据本发明的实施例，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体包括原肌球蛋白核酸适配体和精氨酸激酶核酸适配体；所述原肌球蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示；所述精氨酸激酶核酸适配体的核苷酸系列如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示。
根据本发明的实施例，所述二氧化硅毛细管的长度为8～10cm，内径为295～305μm；所述核酸适配体-水凝胶长度为1～1.5mm。
根据本发明的实施例，所述检测区的两侧设有刻度表。
根据本发明的实施例，所述加样孔呈漏斗状。
根据本发明的实施例，所述加样区覆盖有滤纸。
根据本发明的实施例，所述滤纸为圆形滤纸；任选地，所述滤纸的直径为1～1.5cm，孔径为2～3μm。
根据本发明的实施例，所述甲壳类过敏原的检测卡通过以下步骤制备：
(1)制备核酸适配体-水凝胶，其中，核酸适配体包括原肌球蛋白核酸适配体和精氨酸激酶核酸适配体；
(2)将加热后的二氧化硅毛细管插入所述核酸适配体-水凝胶中，以获得核酸适配体-水凝胶膜管；
(3)将所述核酸适配体-水凝胶膜管固定在所述检测区；
(4)将滤纸覆盖在所述加样区上；
(5)在所述检测区的两侧设置刻度表；
(6)将面卡和底卡卡合在一起，以获得所述甲壳类过敏原的检测卡。
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述二氧化硅毛细管插入所述核酸适配体-水凝胶的深度为1～1.5mm，时间为3～5s；
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述二氧化硅毛细管的加热温度为90～95℃，加热时间为10～15min。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测甲壳类过敏原的方法，根据本发明的实施例，该方法包括绘制原肌球蛋白的标准曲线和精氨酸激酶的标准曲线；将待测样品从前述的甲壳类过敏原的检测卡中的加样孔加入所述加样区，并记录所述核酸适配体-水凝胶膜管中的核酸适配体-水凝胶到达终点的时间，以获得核酸适配体-水凝胶到达终点的时间检测值；将所述核酸适配体-水凝胶到达终点的时间检测值代入所述原肌球蛋白的标准曲线和所述精氨酸激酶的标准曲线，以获得所述待测样品中原肌球蛋白的浓度和精氨酸激酶的浓度。由此，利用该方法检测甲壳类过敏原，检测的灵敏度高，检测时间短，操作简便，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为根据本发明实施例甲壳类过敏原的检测卡的主视结构示意图；
图2为根据本发明实施例精氨酸激酶标准曲线拟合结果图；
图3为根据本发明实施例原肌球蛋白标准曲线拟合结果图；
图4为根据本发明实施例精氨酸激酶交叉反应性结果图；
图5为根据本发明实施例原肌球蛋白交叉反应性结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种甲壳类过敏原的检测卡。发明人通过对大量的甲壳类精氨酸激酶和原肌球蛋白DNA文库进行筛选、改性获得能够分别与甲壳类精氨酸激酶和原肌球蛋白特异性结合的精氨酸激酶核酸适配体和原肌球蛋白核酸适配体，从而制作出核酸适配体，再通过核酸适配体-水凝胶膜管中核酸适配体-水凝胶特异性结合样品中的原肌球蛋白和精氨酸激酶，从而影响水凝胶在毛细管中的行为方式，记录不同浓度迁移时间变化，再根据变化曲线换算待测样品中甲壳类过敏原中原肌球蛋白和精氨酸激酶的浓度，达到定量检测的水平，从而判断样品中是否存在甲壳类过敏原，存在的量多少。本发明的检测卡结构简单，操作简便，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
为了便于理解本发明实施例的检测卡，参考图1，根据本发明的实施例，对该检测卡进行解释说明，具体如下：
底卡10：根据本发明的实施例，底卡10的类型不受特别的限制，只要不与待测样品发生反应即可，本领域技术人员可以根据需要自行进行选择。根据本发明的一些具体实施例，可以选取PET塑料作为底卡。底卡10设有加样区11和检测区12，加样区10连接检测区12，以使加样区11内的样品移动至检测区12；检测区12设有核酸适配体-水凝胶膜管121。根据本发明的具体实施例，核酸适配体-水凝胶膜管121包括二氧化硅毛细管和核酸适配体-水凝胶，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体适于与原肌球蛋白和精氨酸激酶特异性结合。由此，待测样品与核酸适配体结合，可影响水凝胶的移动。
根据本发明的实施例，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体包括原肌球蛋白核酸适配体和精氨酸激酶核酸适配体；所述原肌球蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示；所述精氨酸激酶核酸适配体的核苷酸系列如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示。由此，待测样品能与核酸适配体特异性结合且亲和力高，进而实现灵敏度高、特异性强、操作简单的检测。
根据本发明的实施例，所述二氧化硅毛细管的长度为8～10cm，内径为295～305μm；所述核酸适配体-水凝胶长度为1～1.5mm。由此，能够较好地观察水凝胶在毛细管中的行为方式，实现操作简单的检测。
根据本发明的实施例，所述检测区的两侧设有刻度表。由此，能够标示水凝胶在毛细管中移动的起点和终点，以更简便地记录水凝胶的迁移时间，实现操作简单的检测。
面卡20，面卡20与底卡10卡合在一起，形成所述检测卡。根据本发明的实施例，面卡20的类型不受特别的限制，本领域技术人员可以根据需要自行进行选择。根据本发明的一些具体实施例，可以选取PDMS塑料作为面卡。面卡20设有加样孔21，加样孔21适于将样品加入加样区11。也就是说，加样孔21设置在加样区11的上方，便于将样品加入加样区11内。根据本发明的具体实施例，加样孔呈漏斗状。漏斗状上宽下窄的结构可避免在加样品时，样品滴到检测卡的面卡20上，样品用量控制不准，且污染面卡20，使得后续的操作处理不便。
根据本发明的实施例，加样区11覆盖有滤纸211。滤纸211可防止样品中的杂质进入加样区11，影响水凝胶的移动。根据本发明的实施例，滤纸211可为圆形滤纸；圆形滤纸的直径为1～1.5cm，孔径为2～3μm。由此，可较好地将样品中的杂质过滤。
检测甲壳类过敏原的方法
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种检测甲壳类过敏原的方法。发明人发现，利用该方法检测甲壳类过敏原，检测的灵敏度高、特异性强，检测时间短，检测成本低，易于操作和推广；可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量。
根据本发明的实施例，该方法包括：
绘制原肌球蛋白的标准曲线和精氨酸激酶的标准曲线；根据本发明的实施例，配制一系列浓度梯度的原肌球蛋白和精氨酸激酶标准溶液，用同一批次的数张检测卡检测，以标准溶液浓度的对数值为横坐标，以水凝胶到达终点的时间为横坐标，绘制标准曲线。
将待测样品从前述的甲壳类过敏原的检测卡中的加样孔加入所述加样区，并记录所述核酸适配体-水凝胶膜管中的水凝胶到达终点的时间，以获得核酸适配体-水凝胶到达终点的时间检测值。
将所述水凝胶到达终点的时间检测值代入所述原肌球蛋白的标准曲线和所述精氨酸激酶的标准曲线，以获得所述待测样品中原肌球蛋白的浓度和精氨酸激酶的浓度。
由此，利用该方法检测甲壳类过敏原，检测的灵敏度高，检测时间短，操作简便，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明：
实施例1
精氨酸激酶的制备：
(1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。
(2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于buffer A(50mM NaCl、2mM NaHCO3、10mMEDTA)用均质机均质并于4℃下静置2h。
(3)将步骤(2)静置后的溶液于8000r/min，4℃下离心20min，取上清液，加入70％硫酸铵，于4℃下静置8h。
(4)将步骤(3)静置后的上清液于8000r/min，4℃下离心20min，取上清液，加入90％硫酸铵，于4℃下静置6h。
(5)将步骤(4)静置后的上清液于8000r/min，4℃离心20min，取沉淀，沉淀溶于Buffer B(20mM Tris-HCL、1mM NaCl，pH 8.0)，获得精氨酸激酶液。
(6)对所述精氨酸激酶液用Source 15Q阴离子交换柱，0.5M NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱产物，得到精氨酸激酶，备用。
原肌球蛋白的制备：
(1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。
(2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于Buffer A(50mmol/L KCl和2mmol/L NaHCO3)中，充分均质后于4℃下抽提20min。
(3)将步骤(2)抽提后的溶液于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，将沉淀重悬在10倍体积的Buffer A中，4℃、10000r/min离心20min后取沉淀，重复5次。
(4)将步骤(3)后的沉淀经预冷丙酮充分洗涤至无色后用六层纱布过滤取沉淀，沉淀于室温晾干，除去脂肪及脂溶性色素等杂质得到对虾丙酮粉。
(5)将对虾丙酮粉溶于Buffer B(0.02mol/L的Tris-HCl、1mol/L的KCl和0.1mmol/L的DTT，pH 7.5)中，抽提72h。
(6)将步骤(5)获得的抽提液用六层纱布过滤取上清液，上清液隔水加热20min。
(7)将步骤(6)加热后的上清液于4℃、10000r/min下离心20min后，取上清液，上清液缓慢加入30％硫酸铵，于4℃下静置1h。
(8)将静置后的液体于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，采用1M PBS复溶，获得原肌球蛋白液。
(9)将原肌球蛋白液用DEAE Sepharose F.F.阴离子交换柱，0.5M NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱产物，得到原肌球蛋白，备用。
核酸适配体的筛选：
构建甲壳类精氨酸激酶随机ssDNA文库。(文库容量为1014，片段长度为40bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
本实施例采用三种模式交替筛选。
第一种筛选中，将ssDNA文库分别与原肌球蛋白和精氨酸激酶(实施例1制备)于37℃下孵育1h，然后加入到石墨烯溶液(石墨烯粉末，5mg/ml，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司)。所得混合物在37℃下培养吸附自由松散的ssDNA。接着，将混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，分离去除沉淀中未结合的ssDNA和石墨烯，剩余的上清液含有与精氨酸激酶结合的ssDNA，进行不对称PCR扩增(限制性引物与非限制性引物比例为1:50；序列分别是5’-CAG GGG AGC GAG CG-3’；5’-ATG AGG CAG GGG CCT CG-3’，扩增条件：95℃变1min；循环条件，95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；延长，72℃，3min。)。随后，对PCR产物进行纯化和ssDNA核酸外切酶消化制备。筛选出的核酸适配体结合缓冲液(BB：50mM Tris，150mMNaCl，2mM MgCl2，pH 7.4)于95℃加热5min并在冰上冷却15min以获得单链核苷酸的最佳构象结构。最后，进行纯化的单链DNA作为下一轮的子库。
第二种筛选中，先将新的ssDNA文库与石墨烯溶液在37℃孵育1h，将混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，将沉淀洗涤再离心，重复三次。沉淀复溶后加入精氨酸激酶，混合培养得到与精氨酸激酶结合的ssDNA，进行不对称PCR扩增(方法同第一种筛选)，随后，对PCR产物进行纯化和ssDNA核酸外切酶消化制备。最后，进行纯化的单链DNA作为下一轮的子库。
第三种筛选中，将ssDNA与卵清蛋白、木瓜蛋白、原肌球蛋白在37℃孵育1h，混合液中加入石墨烯继续孵育，混合物在12000转/分钟转速下进行离心15min，去上清，将沉淀中的ssDNA与石墨烯分离进行不对称PCR扩增，扩增后得到的ssDNA即是最后得到的核酸适配体。
经过多次筛选后，得到8条核苷酸序列。数据分析得到解离常数(Kd)，解离常数小则亲和性强，其中，最强亲和性的核苷酸序列为所需序列，共有4条，命名为SEQ ID No.1～4。
其中，SEQ ID No.1序列为：
5’-CTACCCAGAACTCTCGCGTTAGCTCAGTCGCTGTTTCGGGGCCAA-3’；
SEQ ID No.2序列为：
5’-CTACGAACGATGATGAGTCCAGAGACATATTACTTCGCGCATAAA-3’；
SEQ ID No.3序列为：
5’-CCAGGCCGCCAACGTTGACCTAGAAGCACTGCCAGACCCG-3’；
SEQ ID No.4序列为：
5’-CTACCAGGCCGCCAACGTTGACCTAGAAGCACTGCCGACC-3’。
实施例2
利用本发明实施例的方法，制备甲壳类过敏原的检测卡，步骤如下：
核酸适配体-水凝胶的制备：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成与实施例1获得的核酸适配体互补的两条DNA1股和DNA2股。将制备好的DNA1股和DNA2股原液分别放置在含有4％丙烯酰胺的离心管中，在25℃下真空干燥10min以除去空气。然后在DNA1股和DNA2股原液中分别加入1.4％(v/v)引发剂(0.05g的APS溶于0.5mL超纯水)和催化剂(25μL TEMED溶于0.5mL超纯水)。在25℃下再次进行真空干燥15min，产生直链PS-DNA1和PS-DNA2。将110μM PS-DNA1和110μMPS-DNA2溶液与65μM核酸适配体(实施例1获得的)混合在Buffer中混合(77mM NaHPO4，23mMNaH2PO4，50mM NaCl，5mM MgCl2)，在65℃干浴中孵育5min，然后慢慢冷却至室温(重复三次)，得到核酸适配体-水凝胶。
其中，与SEQ ID No.1对应的DNA1序列为：5’-AGT TCT GGG TAG-3’，命名为SEQ IDNo.5；与SEQ ID No.1对应的DNA2序列为：5’-TGG CCC CGA AAC-3’，命名为SEQ ID No.6。
与SEQ ID No.2对应的DNA1序列为：5’-CAT CGT TCG TAG-3’，命名为SEQ IDNo.7；与SEQ ID No.2对应的DNA2序列为：5’-TTT GTA CGC GAA-3’，命名为SEQ ID No.8。
与SEQ ID No.3对应的DNA1序列为：5’-TTG GCG GCC TGG-3’，命名为SEQ IDNo.9；与SEQ ID No.3对应的DNA2序列为：5’-CGG GTC TGG CAG-3’，命名为SEQ ID No.10。
与SEQ ID No.4对应的DNA1序列为：5’-GCG GCC TGG TAG-3’，命名为SEQ IDNo.11；与SEQ ID No.4对应的DNA2序列为：5’-GGT CGG CAG TGC-3’，命名为SEQ ID No.12。
核酸适配体-水凝胶膜管的制备：
先用piraha溶液(H2SO4∶H2O2＝7∶3)在100℃下浸泡二氧化硅毛细管(300±5μm)1h，然后用丙酮和乙醇分别浸泡上述的二氧化硅毛细管，超声10min，用超纯水充分清洗二氧化硅毛细管，氮气吹干；然后在90℃下加热二氧化硅毛细管10min，将热毛细管插入上述制备的核酸适配体-水凝胶3s(深度1mm)，冷藏备用。
底卡的制备：
将厚度为1mm白色PET(Polyethylene terephthalate，聚对苯二甲酸)塑料切成10cm×3cm长条形；然后将长度为8cm核酸适配体-水凝胶膜管固定在底卡的检测区，含有核酸适配体-水凝胶的一侧靠近加样区；然后在膜管的两侧从加样区到检测区的方向刻上0～8cm的毫米刻度值；然后将直径为1cm的滤纸覆盖在加样区。
面卡的制备：
面卡为透明PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)塑料面卡预留加样孔，加样孔的位置与底卡加样区对应。
最后，将制备好的面卡和底卡合在一起，压紧，即获得所述甲壳类过敏原的检测卡。
实施例3
检测甲壳类过敏原：
原肌球蛋白的标准曲线和精氨酸激酶的标准曲线的指定：
将不同浓度(1、5、10、50、100、500、1000μg/mL)的实施例1得到精氨酸激酶溶液用同一批次的数张实施例2得到的甲壳类过敏原的检测卡检测。将检测卡放水平，在加样孔中加入100μL标准溶液，然后用一个分辨率为几十毫秒的计时器记录核酸适配体-水凝胶通过8cm长的毛细管时所需的时间。以浓度的对数值为横坐标，以核酸适配体-水凝胶到达终点的时间为横坐标，绘制标准曲线。结果如图2所示，回归方程为y＝-7.573x+25.13，R2＝0.9984。
将不同浓度(1、5、10、50、100、500、1000μg/mL)的实施例1得到原肌球蛋白溶液用同一批次的数张实施例2得到的甲壳类过敏原的检测卡检测。将检测卡放水平，在加样孔中加入100μL标准溶液，然后用一个分辨率为几十毫秒的计时器记录样品通过8cm长的毛细管时所需的时间。以浓度的对数值为横坐标，以核酸适配体-水凝胶到达终点的时间为横坐标，绘制标准曲线。结果如图3所示，回归方程为y＝-8.222x+28.06，R2＝0.9958。
样品的制备：
取2g南美白对虾肌肉，用液氮研磨成粉，然后采用凯基全蛋白提取试剂盒提取蛋白浸液。具体步骤如下：
(1)在预冷的1mL Lysis Buffer中分别加入1μL蛋白酶抑制剂、10μL磷酸酶抑制剂及5μL 100mM PMSF，制成混合液，混匀后置冰上保存数分钟待用。
(2)取一只新鲜南美白对虾，去虾头、尾、壳及肠线；将虾肌肉用小刀切成泥状，置于研钵中，加入液氮研磨，直至粉末状。
(3)快速称取0.1g虾粉置于1.5mL预冷离心管中，加入1mL上述混合液，混匀后4℃静置2h。
(4)将步骤(3)静置后的溶液于10000r/min，4℃离心5min，取上清液，分装保存于-80℃，应避免反复冻融，获得虾全蛋白浸液。
(5)将提取的虾全蛋白浸液通过ANX Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用0.2～0.4M NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱产物，PBS透析后得到南美白对虾的杂蛋白混合液。
(6)取1mL南美白对虾的杂蛋白混合液，分别加入不同量的AK(精氨酸激酶)，使AK浓度为5、10、20、50μg/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测和回收率测定。样品检测时，将不同浓度(5、10、20、50μg/mL)的AK和南美白对虾的杂蛋白混合液用同一批次的数张实施例2得到的甲壳类过敏原的检测卡检测。将检测卡放水平，在加样孔中加入100μL的样品，然后用一个分辨率为几十毫秒的计时器记录样品通过8cm长的毛细管时所需的时间。检测结果如表1所示，在5～50μg/mL浓度添加范围内，回收率在93％～103％，表明该方法可以用于实际样品中精氨酸激酶的检测。
表1人工添加样品检测结果(n＝6)
(7)取1mL南美白对虾的杂蛋白混合液，分别加入不同量的TM(原肌球蛋白)，使TM浓度为5、10、20、50μg/mL，每个浓度6个平行样，进行样品检测和回收率测定。样品检测时，将不同浓度(5、10、20、50μg/mL)的TM和南美白对虾的杂蛋白混合液用同一批次的数张实施例2得到的甲壳类过敏原的检测卡检测。将检测卡放水平，在加样孔中加入100μL的样品，然后用一个分辨率为几十毫秒的计时器记录样品通过8cm长的毛细管时所需的时间。检测结果如表2所示，在5～50μg/mL浓度添加范围内，回收率在94％～102％，表明该方法可以用于实际样品中原肌球蛋白的检测。
表2人工添加样品检测结果(n＝6)
实际浓度(μg/mL) 样品检出值(μg/mL) 回收率(％)
5 5.10±0.03 102
10 9.95±0.07 99
20 19.61±0.04 98
50 47.05±0.11 94
实施例4
对实施例2得到的甲壳类过敏原的检测卡进行评估，具体方法如下：
精密性检测：
使用实施例3的方法对浓度为10、20和50μg/mL的原肌球蛋白和精氨酸激酶标准溶液连续检测6次，检测结果如表3所示。结果表明，精氨酸激酶含量的相对标准偏差为1.6～3.6％，原肌球蛋白含量的相对标准偏差为2.7～3.6％，说明该检测方法稳定。
表3方法精密性检测结果(n＝6)
交叉反应检测：
使用实施例3的方法对虾杂蛋白混合液，即含有除精氨酸激酶以外的其他鱼类蛋白的混合液进行检测。配制虾杂蛋白混合液浓度为10、20、30、40μg/mL的虾杂蛋白溶液进行特异性试验，结果如图4所示，表明该方法特异性较强，对其他虾蛋白没有交叉反应。
使用实施例3的方法对虾杂蛋白混合液，即含有除原肌球蛋白以外的其他鱼类蛋白的混合液进行检测。配制虾杂蛋白混合液浓度为10、20、30、40μg/mL的虾杂蛋白溶液进行特异性试验，结果如图4所示，表明该方法特异性较强，对其他虾蛋白没有交叉反应。
综上，本发明通过核酸适配体-水凝胶膜管中核酸适配体-水凝胶特异性结合样品中的原肌球蛋白和精氨酸激酶，从而影响水凝胶在毛细管中的行为方式，记录不同浓度迁移时间变化，再根据变化曲线换算待测样品中甲壳类过敏原中原肌球蛋白和精氨酸激酶的浓度，达到定量检测的水平。本发明的检测卡结构简单，操作简便，实验室人员稍加培训即可操作，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用
<130> 2019
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacccagaa ctctcgcgtt agctcagtcg ctgtttcggg gccaa 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacgaacga tgatgagtcc agagacatat tacttcgcgc ataaa 45
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaggccgcc aacgttgacc tagaagcact gccagacccg 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaccaggcc gccaacgttg acctagaagc actgccgacc 40
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agttctgggt ag 12
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggccccgaa ac 12
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcgttcgt ag 12
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
catcgttcgt ag 12
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggcggcct gg 12
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggtctggc ag 12
<210> 11
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcggcctggt ag 12
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtcggcagt gc 12

Claims (10)

1.一种甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，包括：
底卡，所述底卡设有加样区和检测区，所述加样区连接所述检测区，以使所述加样区内的样品移动至所述检测区；所述检测区设有核酸适配体-水凝胶膜管；
面卡，所述面卡设有加样孔，所述加样孔适于将样品加入所述加样区。
2.如权利要求1所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述核酸适配体-水凝胶膜管包括二氧化硅毛细管和核酸适配体-水凝胶，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体适于与原肌球蛋白和精氨酸激酶特异性结合。
3.如权利要求2所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述核酸适配体-水凝胶中的核酸适配体包括原肌球蛋白核酸适配体和精氨酸激酶核酸适配体；所述原肌球蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述精氨酸激酶核酸适配体的核苷酸系列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
4.如权利要求2所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述二氧化硅毛细管的长度为8～10cm，内径为295～305μm；所述核酸适配体-水凝胶长度为1～1.5mm。
5.如权利要求1所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述检测区的两侧设有刻度表。
6.如权利要求1所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述加样孔呈漏斗状。
7.如权利要求1所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述加样区覆盖有滤纸；任选地，所述滤纸为圆形滤纸；任选地，所述滤纸的直径为1～1.5cm，孔径为2～3μm。
8.如权利要求1所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，所述甲壳类过敏原的检测卡通过以下步骤制备：
(1)制备核酸适配体-水凝胶，其中，核酸适配体包括原肌球蛋白核酸适配体和精氨酸激酶核酸适配体；
(2)将加热后的二氧化硅毛细管插入所述核酸适配体-水凝胶中，以获得核酸适配体-水凝胶膜管；
(3)将所述核酸适配体-水凝胶膜管固定在所述检测区；
(4)将滤纸覆盖在所述加样区上；
(5)在所述检测区的两侧设置刻度表；
(6)将面卡和底卡卡合在一起，以获得所述甲壳类过敏原的检测卡。
9.如权利要求8所述的甲壳类过敏原的检测卡，其特征在于，在步骤(2)中，所述二氧化硅毛细管插入所述核酸适配体-水凝胶的深度为1～1.5mm，时间为3～5s；
任选地，在步骤(2)中，所述二氧化硅毛细管的加热温度为90～95℃，加热时间为10～15min。
10.一种检测甲壳类过敏原的方法，其特征在于，包括：
绘制原肌球蛋白的标准曲线和精氨酸激酶的标准曲线；
将待测样品从权利要求1～9中任一项所述的甲壳类过敏原的检测卡中的加样孔加入所述加样区，并记录所述核酸适配体-水凝胶膜管中的核酸适配体-水凝胶到达终点的时间，以获得核酸适配体-水凝胶到达终点的时间检测值；
将所述核酸适配体-水凝胶到达终点的时间检测值代入所述原肌球蛋白的标准曲线和所述精氨酸激酶的标准曲线，以获得所述待测样品中原肌球蛋白的浓度和精氨酸激酶的浓度。
CN201910583426.7A 2019-07-01 2019-07-01 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用 Pending CN110456059A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910583426.7A CN110456059A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用
NL2025926A NL2025926B1 (en) 2019-07-01 2020-06-26 Crustacean allergen test card and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910583426.7A CN110456059A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110456059A true CN110456059A (zh) 2019-11-15

Family

ID=68481866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910583426.7A Pending CN110456059A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110456059A (zh)
NL (1) NL2025926B1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341153A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 浙江工商大学 一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用
CN113341151A (zh) * 2021-03-19 2021-09-03 合肥工业大学 一种甲壳类致敏原的检测卡及其制备方法、应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107918018A (zh) * 2017-10-31 2018-04-17 浙江工商大学 一种基于抗体技术的近场光波靶向传感器检测甲壳类过敏原的方法
CN108866060A (zh) * 2018-06-12 2018-11-23 浙江工商大学 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107918018A (zh) * 2017-10-31 2018-04-17 浙江工商大学 一种基于抗体技术的近场光波靶向传感器检测甲壳类过敏原的方法
CN108866060A (zh) * 2018-06-12 2018-11-23 浙江工商大学 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANSHENG LI等: "Control of capillary behavior through target-responsive hydrogel permeability alteration for sensitive visual quantitative detection", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
YOUXIONG ZHANG等: "DNA aptamer for use in a fluorescent assay for the shrimp allergen tropomyosin", 《MICROCHIM ACTA》 *
郭磊: "SELEX技术及寡核苷酸适配体的近期研究进展", 《国际药学研究杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341151A (zh) * 2021-03-19 2021-09-03 合肥工业大学 一种甲壳类致敏原的检测卡及其制备方法、应用
CN113341153A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 浙江工商大学 一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
NL2025926B1 (en) 2022-06-15
NL2025926A (en) 2021-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hurwitz et al. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis
Tesfaye et al. Frequency distribution of ABO and Rh (D) blood group alleles in Silte Zone, Ethiopia
CN109642229A (zh) 从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞dna的自动和手动方法
CN110093457A (zh) 一种非洲猪瘟病毒asfv-lamp检测引物组及试剂盒
CN107090457A (zh) 检测样品的多元分析
Bouwman et al. Genome-wide detection of DNA double-strand breaks by in-suspension BLISS
CN110456059A (zh) 一种甲壳类过敏原的检测卡及其应用
CN113341151B (zh) 一种甲壳类致敏原的检测卡及其制备方法、应用
CN111383774A (zh) 用于筛选脑胶质瘤治疗方案的系统
CN109486942A (zh) 一种用于类风湿性关节炎诊断的生物标志物及其应用
CN112501173A (zh) 一种gpc1 dna适配体及其应用
CN102965378A (zh) 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法
CN110004149A (zh) 一种程序性死亡受体-配体1的核酸适体及其应用
CN103911379B (zh) 核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用
CN108866060B (zh) 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法
CN110512011A (zh) 一种肠道菌群检测分析方法、装置、系统及存储介质
CN103695419B (zh) 一种病毒核酸提取试剂
CN105483246B (zh) 基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用
Zhang et al. Robust acquisition of spatial transcriptional programs in tissues with immunofluorescence-guided laser capture microdissection
CN107779503A (zh) 阿尔茨海默相关的差异表达基因及其应用
CN108753940A (zh) 通过检测粪便确定人体内植物性来源小rna的方法
CN105018607B (zh) 一种基于dna质量鉴定牛奶中脂肪和蛋白质含量的方法
CN107312779A (zh) 用于分离滋养层细胞的核酸适配体、分离滋养层细胞的方法和染色体拷贝数变异分析的方法
CN108060220A (zh) 弓形虫慢性感染雄性小鼠生殖系统靶标基因的鉴定及其在临床上的应用
Zhang et al. Robust acquisition of high resolution spatial transcriptomes from preserved tissues with immunofluorescence based laser capture microdissection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191115