CN108753940A - 通过检测粪便确定人体内植物性来源小rna的方法 - Google Patents

通过检测粪便确定人体内植物性来源小rna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，旨在提供一种通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法。包括以下步骤：以常规方法采集人类粪便样品；利用RNA提取试剂盒提取粪便样品的总RNA；按照常规小RNA建库流程和方法，构建小RNA文库；利用高通量测序技术平台对粪便样品中的小RNA进行高通量测序；对测序结果进行小RNA数据的生物信息学分析，以确定人体内植物来源的miRNA及其丰度。本发明通过对人类粪便样品进行小RNA测序，利用生物信息学方法分别可以鉴定样品中植物miRNA的种类和丰度，既可以利用粪便样品代替血液分析人体内植物miRNA丰度与饮食的关系，又能够作为肠道微生物检测的补充，提供更多信息。

Description

通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，特别涉及对人体内小RNA样品测序与分析，确定植物性来源小RNA的方法。
背景技术
不编码蛋白质的单链小分子RNA是近10年来发现的一类具有调控功能的新基因，microRNA(miRNA)是其中重要一种小分子RNA。miRNA长度为20～24个核苷酸，能够通过序列配对，结合到靶基因mRNA上，特别是mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslational region,3’-UTR)。如果序列完全匹配，会造成目标mRNA被切割，断裂的mRNA之后会被降解。如果miRNA和目标mRNA不完全互补结合，这将抑制mRNA翻译成蛋白质，而不影响mRNA的稳定性。
近年来，植物性来源miRNA在人类血液中被大规模发现，如miR168，miR159等(Zhang等，2012，Cell Research；Chin等，2016，Cell Research)。植物miR159在血清里的含量和人类乳腺癌的发生增殖成负相关，提示该miRNA可能与癌症发生有关，进一步小鼠实验也证实了miR159抗乳腺癌的功效。
现有的植物性来源miRNA检测主要是通过提取血清中的miRNA来鉴定人体血液中植物性小RNA。从植物miRNA角度来说，它们本身的序列特性、化学修饰以及和其他食物成分的相互作用会导致部分难以被人体吸收，因此许多植物miRNA很难在血液中被检测到(Axtell等，2011，Genome biology)。另外，血液检测无法检测肠道微生物是否编码植物性miRNA，同时抽血获得血液过程相对复杂繁琐。
人类粪便样品包括人类肠道剥落组织、肠道微生物和摄入食物消化残余物质。肠道微生物长期与人类共生，参与对人体许多重要生理代谢的调控，其遗传构成与人类健康与疾病密切相关(Sommer等，2017，Nature Reviews Microbiology)。目前利用粪便样品实现对来自人体内有关植物miRNA的检测技术未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术方案是，克服现有技术的不足，提出一种通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法。
为解决技术问题，本发明采用如下技术方案：
提供一种通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法，包括以下步骤：
(1)以常规方法(如采集盒取样等)采集人类粪便样品；
(2)利用RNA提取试剂盒(如BIOG RNA Stool Kit等)提取粪便样品的总RNA；
(3)按照常规小RNA建库流程和方法，构建小RNA文库；
(4)利用高通量测序技术平台(如Illumina HiSeqTM 2500等)对粪便样品中的小RNA进行高通量测序；
(5)对测序结果进行小RNA数据的生物信息学分析，以确定人体内植物来源的miRNA及其丰度。
本发明中，步骤(2)所用RNA提取试剂盒是下述的任意一种：BIOG RNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒、Stool RNA Kit(200)粪便RNA提取试剂盒、强力粪便RNA提取试剂盒PowerMicrobiome RNA Isolation Kit。
本发明中，所述步骤(5)包括：
(a)数据质量控制
利用生物信息学软件对小RNA测序得到的原始序列进行数据质量统计(如FastQC等)，然后根据统计结果，用过滤软件(如NGSQCToolkit等)过滤原始序列中的低质量序列(通常为测序质量值低于20)及建库过程中使用的3’和5’端的接头序列；
(b)植物来源miRNA及其丰度鉴定
从公共数据库(如NCBI、miRBase、PNRD等)或已发表文章中下载已知植物所有小RNA成熟序列和前体序列，利用比对软件(如bowtie2，hisat等)将过滤后的读序比对至已知植物miRNA成熟序列，结合miRNA鉴定软件(如mirdeep2等)鉴定粪便样品中植物性miRNA的种类及丰度。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明通过对人类粪便样品进行小RNA测序，利用生物信息学方法分别可以鉴定样品中植物miRNA的种类和丰度，既可以利用粪便样品代替血液分析人体内植物miRNA丰度与饮食的关系，又能够作为肠道微生物检测的补充，提供更多信息。
附图说明
图1为一个人类粪便样品A中植物miRNA的种类和丰度鉴定结果；
图2为一个人类粪便样品B中植物miRNA的种类和丰度鉴定结果；
图3为一个人类粪便样品C中植物miRNA的种类和丰度鉴定结果。
图1-3中的纵坐标是来自相应miRNA的测序读序数量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优势更加清晰，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。需要声明的是，此处所描述的具体实例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了部分对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
具体实施例子如下：
步骤一、样品采集：
本发明中实验所用的三份粪便样品来三位自志愿者个人捐赠，提取步骤如下：
从采集盒(瓶)中取样或将测试卡及取样木棒交给志愿者自行取样，取样时直接打开测试卡正面的盖子，并利用取样木棒挖取不同部位的粪便检体10-50mg(相当于火柴头大小)涂抹在测试卡A窗或B窗的方格内(切勿超出方格之外)，然后合上盖子。若是志愿者自行取样应尽快将测试卡交回医检师处或检验室，粪便标本要新鲜，且不可混入尿液，保证便盒清洁干燥；
步骤二、样品RNA提取：
下面以常州百代生物科技有限公司公司生产的BIOG RNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒为例说明样品RNA的提取过程。该试剂盒由吸附柱、收集管、裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、析出液、洗涤液、洗脱液和消化液组成，应另自行准备好无水乙醇、PBS和1.6mL离心管；提取的具体操作步骤如下：
(1)取出析出液和洗涤液，按以下操作：
a)析出液：4.5mL加入25.5mL无水乙醇；9mL加入51mL无水乙醇；
b)洗涤液：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇；
c)配制好的析出液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用；
(2)取200mg的粪便于试管中(若粪便样本为液态，取200μL于试管中)，加入2mLPBS充分振荡混匀，300g离心5分钟，收集上清；取收集的上清液1mL于1.5mL离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清后沉淀用1mL PBS重悬，振荡混匀后，12000rpm离心5分钟，收集沉淀；
(3)加入200μL裂解液Ⅰ，悬浮沉淀，37℃放置30分钟；
(4)加入200μL裂解液Ⅱ，20μL消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10分钟；(5)加入600μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验；
(6)将吸附柱放入收集管内，取步骤(5)所得溶液600μL转入吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；
(7)将剩余400μL步骤(5)所得溶液转入上述吸附柱内，重复操作步骤(6)；
(8)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；
(9)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；
(10)取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入30-100μL洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集RNA溶液。提取的RNA-70℃保存，或直接用于下一步实验；
本发明中，也可以使用其他市售粪便RNA提取试剂盒实现粪便样品中总RNA的提取，例如北京索莱宝科技有限公司生产的Stool RNA Kit粪便RNA提取试剂盒、深圳市安必胜科技有限公司生产的强力粪便RNA提取试剂盒PowerMicrobiome RNA Isolation Kit等。在提取过程中，应按照相应试剂盒说明书进行，而不应局限前述操作步骤。
步骤三、小RNA文库构建，具体步骤如下：
1)先用1wt.％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计来检测RNA质量，用Alignent2100RNA 6000Nano Kit来检测RNA整齐度；
2)接着用含15wt.％聚丙烯酰胺的变性凝胶来分离开小分子RNA，再用小片段RNA回收的试剂盒来回收并且纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头来进行反转录合成，其中，5’为5’-RACE-Ready cDNA，3’为3’-RACE-Ready cDNA；
3)进行PCR扩增，并且构建这些小分子RNA的cDNA文库；
步骤四、小RNA测序：
利用Illumina HiSeqTM 2500平台进行单端测序。三份样品分别获得424M、364M、364M测序量(表1)。
表1三个人类粪便样品小RNA测序数据信息表
样本 TEST4044187 TEST4044191 TEST4044200
测序量(bp) 444,272,796 381,236,382 381,302,252
步骤五、针对上述数据进行小RNA数据的生物信息学分析，分析流程如下：
1)数据质量控制
利用FastQC软件进行数据的质量统计，根据统计结果，使用NGSQCToolkit软件过滤原始序列中的低质量序列(通常为测序质量值低于20)及小RNA建库过程中使用的3’和5’端的接头序列。
2)植物来源miRNA及其丰度鉴定
从PNRD数据库(http://structuralbiology.cau.edu.cn/PNRD)中下载已知植物所有小RNA成熟序列和前体序列，利用bowtie2软件将过滤后的reads比对至已知植物miRNA成熟序列(不允许错配)结合mirdeep2软件在3个人类粪便样品中分别鉴定到13、13、10个植物性miRNA，并对其丰度进行了统计(如图1-3所示)，其中cre-miR916、peu-miR2910和tae-miR2005a_1_npr 3种植物miRNA在3个样品中均有发现。结果表明，这些三位志愿者肠道的miRNA种群构成明显不同。
以上所述仅作为本发明的一个实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.通过检测粪便确定人体内植物性来源小RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以常规方法采集人类粪便样品；
(2)利用RNA提取试剂盒提取粪便样品的总RNA；
(3)按照常规小RNA建库流程和方法，构建小RNA文库；
(4)利用高通量测序技术平台对粪便样品中的小RNA进行高通量测序；
(5)对测序结果进行小RNA数据的生物信息学分析，以确定人体内植物来源的miRNA及其丰度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所用RNA提取试剂盒是下述的任意一种：BIOG RNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒、Stool RNA Kit(200)粪便RNA提取试剂盒、强力粪便RNA提取试剂盒PowerMicrobiome RNA Isolation Kit。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所用RNA提取试剂盒是BIOGRNA Stool Kit粪便RNA提取试剂盒，由吸附柱、收集管、裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ、析出液、洗涤液、洗脱液和消化液组成，另自行准备好无水乙醇、PBS和1.6mL离心管；步骤(2)的具体操作步骤如下：
(1)取出试剂盒中的析出液和洗涤液，按以下操作：
a)析出液：4.5mL加入25.5mL无水乙醇；9mL加入51mL无水乙醇；
b)洗涤液：9mL加入21mL无水乙醇；18mL加入42mL无水乙醇；
c)配制好的析出液如出现沉淀，将其在37℃溶解，摇匀后使用；
(2)取200mg的粪便于试管中，若粪便样本为液态则取200μL于试管中；加入2mL PBS充分振荡混匀，300g离心5分钟，收集上清；取收集的上清液1mL于1.5mL离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清后沉淀用1mL PBS重悬，振荡混匀后，12000rpm离心5分钟，收集沉淀；
(3)加入200μL裂解液Ⅰ，悬浮沉淀，37℃放置30分钟；
(4)加入200μL裂解液Ⅱ，20μL消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10分钟；
(5)加入600μL析出液，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取与后续实验；
(6)将吸附柱放入收集管内，取步骤(5)所得溶液600μL转入吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；
(7)将剩余400μL步骤(5)所得溶液转入上述吸附柱内，重复操作步骤(6)；
(8)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液；
(9)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；
(10)取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入30-100μL洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集RNA溶液；提取的RNA-70℃保存，或直接用于下一步实验。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：
(1)先用1wt.％琼脂糖的凝胶电泳与紫外分光光度计检测RNA质量，用Alignent2100RNA 6000Nano Kit检测RNA整齐度；
(2)用含15wt.％聚丙烯酰胺的变性凝胶分离小分子RNA，再用小片段RNA回收试剂盒回收并纯化长度为18～30bp之间的RNA，连接5’和3’接头进行反转录合成；其中，5’为5’-RACE-Ready cDNA，3’为3’-RACE-Ready cDNA；
(3)进行PCR扩增，并且构建小分子RNA的cDNA文库。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：
(a)数据质量控制
利用生物信息学软件对小RNA测序得到的原始序列进行数据质量统计，然后根据统计结果，用过滤软件过滤原始序列中测序质量值低于20的序列，及建库过程中使用的3’和5’端的接头序列；
(b)植物来源miRNA及其丰度鉴定
从公共数据库或已发表文章中下载已知植物所有小RNA成熟序列和前体序列，利用比对软件将过滤后的读序比对至已知植物miRNA成熟序列，结合miRNA鉴定软件鉴定粪便样品中植物性miRNA的种类及丰度。
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