CN116411050B - 一种利用斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法 - Google Patents
一种利用斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种利用斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法，具体属于中成药质量控制技术领域，本发明首次发现斑马鱼中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量的变化在控制心可舒质量中的应用；所述fosab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述serpinh1b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；心可舒样品处理斑马鱼，与空白对照组相比，fosab基因和/或serpinh1b基因表达量显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格，为探索建立一种基于斑马鱼基因表达谱的中成药质量控制方法提供新的思路，为提升中成药质量、保障其临床有效性提供实验支撑。
Description
技术领域
本发明属于中成药质量控制技术领域，具体涉及一种利用斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法。
背景技术
中成药功能主治广泛，化学成分极其复杂，为其质量控制带来巨大挑战。对于药效物质不明确或不够明确的中成药，仅用理化等方法难以精准控制其质量。生物效应检测是利用药物对试验系所产生的生物效应，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物一致性的一种方法。基于生物效应的质量控制方法能够实现不唯成分论，以生物效应水平评价中成药质量，能够为当前中成药质量评价体系提供重要补充。生物效应表达谱是近年来形成的新颖技术，是指药物在特定的条件下作用于生物体所表达出的一组特征生物学信息或图谱，通常具有时间效应或剂量-效应相关性，包括基因表达谱、蛋白质表达谱、生物自显影薄层色谱、细胞表型特征谱、代谢物表达谱等。其中，基因表达谱是通过对特定组织、细胞的cDNA进行大规模测序，定性、定量分析其mRNA组成，描绘其在特定状态下的基因表达种类和丰度信息的数据表。通过对比不同厂家、不同批次中成药对基因表达谱的影响，筛选得到的差异基因，可用于评价复杂中成药的质量。
“心可舒片”由丹参、葛根、三七、山楂、木香组成，具有活血化瘀、行气止痛的功效，常用于气滞血瘀引起的胸闷、心悸、头晕、头痛、颈项疼痛；冠心病心绞痛、高血脂、高血压、心律失常见上述证候者。《中国药典》(2020年版一部)(以下简称药典)现行质量标准包括性状、鉴别、检查、特征图谱、含量测定等项目。鉴别项主要包括三七和金丝桃苷鉴别方法。特征图谱包含丹参素钠、原儿茶醛、3’-羟基葛根素、葛根素、3’-甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸B等8个特征峰。含量测定以丹酚酸B，丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B总量，木香烃内酯，去氢木香内酯的含量为指标。由上可见，药典质量控制体系基本涵盖了心可舒片处方全部药味的控制，但是该体系涉及的实验数量繁多且复杂，质量控制指标与生物效应的相关性差，且只检测了少数几个化合物，不能准确评价心可舒片的整体质量。
斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因同源性高达87％。斑马鱼的心、肝、肾等脏器生理结构和功能与人类高度相似，且具有广泛的P450酶，拥有与人类相似的多条药物代谢途径，是国际认可的模式生物。斑马鱼体外受精、胚胎透明、成本低、易于操作，是研究早期发育的理想动物模型。以斑马鱼为模型的实验既具有体外实验快速、高效和用药量小的优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高和可观察多个器官等优点。目前，斑马鱼模型已经在新药开发、疾病建模、药物活性评价、药效物质筛选和作用机制研究等方面得到广泛应用。
转录组是指在特定的发育阶段或者生理状态下，细胞中的一套完整的RNA转录产物。转录组学技术是指对某特定条件或时期的细胞、组织或者生物体内全部RNA序列进行检测的一种技术，能够从分子水平上研究转录基因表达水平的变化，精确测定基因表达谱。它具有数据量大、测定范围广、背景噪音小、可重复性强和适用性广等优势。
现有技术中虽有利用斑马鱼模型对心可舒片进行质量控制评价的报道，但是利用转录组学技术检测基因表达谱，筛选差异基因，以对心可舒片(XKS)进行质量控制评价未见报道。
中国专利文献CN114199840A(申请号：202111478096.9)公开了一种基于生物效应的心可舒片质量控制方法，该专利文献利用斑马鱼节间血管生成障碍模型和高血脂症模型二者结合可以实现基于生物效应的心可舒片质量控制，且建立了心可舒片基于生物效应的质量控制方法，但是并未涉及利用基于基因表达谱筛选的差异基因评价心可舒片质量。
发明内容
针对现有技术的不足，一种利用斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法。
本发明以模式生物斑马鱼为模型，利用转录组学技术，研究心可舒片(XKS)对斑马鱼基因表达谱的影响，筛选能够判别XKS合格样品和不合格样品的差异基因，以期建立基于基因表达谱的XKS质量控制方法，为探索建立一种基于斑马鱼基因表达谱的中成药质量控制方法提供新的思路，为提升中成药质量、保障其临床有效性提供实验支撑。
术语说明
dpf(days post fertilization))：生物学专用术语，指受精后的天数。如1dpf指受精后1天的胚胎。
本发明的技术方案如下：
斑马鱼中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量的变化在控制心可舒质量中的应用；
所述fosab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述serpinh1b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，所述应用中，心可舒样品处理斑马鱼，与空白对照组相比，fosab基因和/或serpinh1b基因表达量显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格。
一种基于斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法，包括如下步骤：
(1)选用4dpf野生型AB系斑马鱼，将健康斑马鱼随机分配为空白对照组和心可舒样品处理组，空白对照组给予：养鱼水；心可舒样品处理组给予：养鱼水和心可舒样品提取物；孵育，制得斑马鱼样本；
(2)分析步骤(1)制备的斑马鱼样本中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量的变化，所述fosab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；serpinh1b基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
与空白对照组相比，心可舒处理组中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量都显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格。
根据本发明优选的，步骤(1)中，养鱼水的成分含有5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4。
根据本发明优选的，步骤(1)中，各组设置2个以上平行，每个平行30条以上斑马鱼；空白对照组给予：养鱼水中含体积分数为0.1％DMSO；心可舒样品处理组给予：养鱼水中含体积分数为0.1％DMSO+心可舒样品提取物换算为心可舒的终浓度为680μg/mL；孵育温度28℃，孵育24h，用水将每组斑马鱼进行清洗，制得斑马鱼样本。
进一步优选的，步骤(1)中，用DEPC水将每组斑马鱼进行清洗。
根据本发明优选的，步骤(1)中，心可舒样品提取物的制备方法，包括如下步骤：
取心可舒样品研磨成粉，加入8-10倍量的甲醇，常温浸泡28-32min，然后再超声提取28-32min，抽滤，药渣重复提取2-3次，合并滤液，减压浓缩至1/10以下体积，然后再58-60℃水浴至浸膏状，真空干燥，制得心可舒样品提取物。
进一步优选的，取心可舒样品研磨成粉，加入10倍量的甲醇，常温浸泡30min，然后再超声40Khz提取30min，抽滤，药渣重复提取2次，合并滤液，减压浓缩至1/10体积，然后再60℃水浴至浸膏状，真空干燥，制得心可舒样品提取物。
根据本发明优选的，步骤(2)中，利用实时荧光定量PCR技术，分析步骤(1)制备的斑马鱼样本中fosab基因、serpinh1b基因表达量的变化。
有益效果
本发明首次发现斑马鱼中fosab基因和/或serpinh1b基因，与空白对照组相比，心可舒处理组中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量都显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格。为探索建立一种基于斑马鱼基因表达谱的中成药质量控制方法提供新的思路，为提升中成药质量、保障其临床有效性提供实验支撑。
附图说明
图1为差异表达基因分析结果图；
图中：A为差异表达基因统计柱状图，纵坐标为差异表达基因的数量，横坐标为比较组名称，XKSM-vs-XKSC为心可舒中剂量与control比较组，XKSH-vs-XKSC为心可舒高剂量与control比较组，XKSL-vs-XKSC为心可舒低剂量与control比较组，其中Up是显著性差异的上调基因数量，Down是显著性差异的下调基因数量；B为不同比较组间的共有及特有的差异表达基因，XKSM-vs-XKSC为心可舒中剂量与control比较组，XKSH-vs-XKSC为心可舒高剂量与control比较组，XKSL-vs-XKSC为心可舒低剂量与control比较组；C为各比较组差异表达基因火山图，纵坐标为-log10pValue代表差异结果的显著性，横坐标为log2FoldChange代表差异倍数。
图2为合格样品组斑马鱼样本的14个差异基因表达量统计图；
图中：纵坐标Relative expression level为相对表达量；横坐标control为空白对照组，0110277、0110278、0110279、0110280、0110281为合格样品组；*代表与control组相比，p＜0.05；**代表与control组相比，p＜0.01。
图3为缺方阴性样本、投料减半阴性样本的13个差异基因表达量统计图；
图中：纵坐标Relative expression level为相对表达量；横坐标control为空白对照组，QDS、QGG、QMX、QSQ、QSZ、1/2DS、1/2GG、1/2MX、1/2SQ、1/2SZ、1/2SZT为不合格样品组；*代表与control组相比，p＜0.05；**代表与control组相比，p＜0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
实验所需野生型AB品系斑马鱼由山东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程技术研究中心提供，也可以由国家斑马鱼资源中心购买。
心可舒片合格药品和不合格心可舒片药品的由山东沃华医药科技股份有限公司提供。
养鱼水的成分含有5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4。
实施例1
利用转录组学技术，分析心可舒片对斑马鱼基因表达谱的影响
(1)心可舒片样品提取物的制备
5批合格样品(批号0110277、0110278、0110279、0110280、0110281)和11批不合格样品(包括5批缺方不合格样品：缺丹参样品(QDS)、缺葛根样品(QGG)、缺木香样品(QMX)、缺三七样品(QSQ)、缺山楂样品(QSZ)，6批投料减半不合格样品：丹参投料减半样品(1/2DS)、葛根投料减半样品(1/2GG)、木香投料减半样品(1/2MX)、三七投料减半样品(1/2SQ)、山楂投料减半样品(1/2SZ)、山楂提取物投料减半样品(1/2SZT))。
分别取各样品，研磨成粉，称定，转移至烧杯中，加入10倍量甲醇，常温浸泡30min，超声40Khz提取30min，抽滤，药渣重复提取2次。合并滤液，减压浓缩至1/10体积，转移至蒸发皿中60℃水浴蒸至浸膏状，真空干燥，得甲醇提取物，即心可舒片样品提取物，计算得率，如表1所示。用含体积分数10％ DMSO(二甲基亚砜)的纯净水配制浓度为100mg/mL的各样品储备液，用时根据得率计算心可舒片的浓度。
表1各样品提取率
(2)转录组测序样本的制备与收集
挑选健康的4dpf野生型AB品系斑马鱼，随机分为空白对照(Control)组，心可舒片(XKS)低、中、高(L、M、H)浓度组，每组3个重复，每个重复50条，Control组给予含体积分数为0.1％DMSO的养鱼水，XKSL、XKSM、XKSH组分别给予根据心可舒片样品提取物换算的XKS终浓度为170、340、680μg/mL的养鱼水(含体积分数0.1％的DMSO)，孵育温度28℃，处理24h。用DEPC水将每组斑马鱼清洗3遍，制得斑马鱼样本，委托上海欧易生物医学科技有限公司进行转录组测序，各组样本基因表达水平分析结果见图1。
(3)差异基因的筛选
本方法共完成12组斑马鱼样本的转录组分析，根据差异倍数＞2及差异显著性检验结果筛选差异基因。Control组与XKSL组、Control组与XKSM组、Control组与XKSH组三个差异分组的差异基因数量分别为：250、466、163，三个差异分组共有差异基因数为37个(如图1所示)。这37个共有差异基因即能够在XKS不同剂量范围内稳定表达的差异基因，基因名称及引物序列如表2所示。
表2差异基因序列
(4)各样品组斑马鱼样本中总RNA提取和cDNA制备
挑选健康的4dpf野生型AB品系斑马鱼，随机分为Control组、各批次合格样品处理组、不合格样品处理组共计17组，每组3个重复，每个重复50条。Control组给予含体积分数为0.1％DMSO的养鱼水，其余各组分别给予各样品终浓度为680μg/mL的养鱼水(含体积分数0.1％的DMSO)，孵育温度28℃，处理24h。用DEPC水将每组斑马鱼清洗3遍，收集斑马鱼样本。按说明书使用Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒提取各组斑马鱼样本的总RNA。使用/>ⅡQ RT Super Mix for qPCR(+gDNAwiper)试剂盒和梯度PCR仪进行逆转录，获得各组斑马鱼样本的cDNA，立即进行RT-qPCR检测或置于－20℃冰箱储存备用。
(5)合格样品组斑马鱼样本的差异基因表达量检测
按说明书使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒和荧光定量PCR仪，以rpl13a为内参基因，rpl13a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，上游引物序列：TCTGG AGGACTGTAAGAGGTATGC SEQ ID NO.4，下游引物序列：AGACGCACAATCTTGAGA GCAGSEQ ID NO.5；对Control组斑马鱼样本和各合格样品组斑马鱼样本进行RT-qPCR检测，使用2－ΔΔCt法(Livak法)对各组斑马鱼体内步骤(3)中筛选出的各基因表达进行相对定量。在37个差异基因中，14个差异基因能被5批次合格样品稳定调控(如图2所示)。与Control组比较，5批合格样品组斑马鱼样本中fosab、serpinh1b、abcg2b、ace2、chia.1、chia.2、chia.3、cpo、cyp2x8、LOC559107、nr0b2a、slc39a4和slc6a19a.1的表达水平均显著下调，jac1的表达水平均显著上调。
(6)不合格样品组斑马鱼样本的差异基因表达量检测
按步骤(5)中的方法，对不合格样品组斑马鱼样本中的步骤(3)中筛选出的差异基因进行相对定量。13个差异基因在不合格样品组斑马鱼样本中的相对表达如图3所示(LOC559107基因未能在不合格样品组斑马鱼样本中进行定量，将此类基因排除)。除fosab和serpinh1b外，其他11个基因在不合格样品组斑马鱼体内的表达趋势均与合格样品组相同，无法用于判别合格样品与不合格样品。
如图3中A所示，与Control组相比，1/2DS和1/2GG组斑马鱼体内的fosab的相对表达量显著下调，这2个样品组与合格样品组趋势相同；QDS、QGG、QSQ、1/2MX组斑马鱼体内fosab的相对表达量无显著性差异，QMX、QSZ、1/2SQ、1/2SZ、1/2SZT组斑马鱼体内fosab的相对表达量显著上调，这9个样品组与合格样品组趋势不同，可认定为不合格样品。如图3中B所示，与Control组相比，QSQ组斑马鱼体内serpinh1b的相对表达量显著下调，与合格样品组趋势相同；1/2SZT组斑马鱼体内serpinh1b的相对表达量无显著性差异，其他9个组斑马鱼体内serpinh1b的相对表达量均显著上调，这10个样品组与合格样品组表达趋势不同，可认定为不合格样品。
本方法中，在XKS不同剂量范围内能够稳定表达的37个差异基因中，5批合格样品能够稳定调控的有14个；这14个基因中，除fosab和serpinh1b外，LOC559107基因未能在不合格样品组斑马鱼样本中进行定量，另外11个差异基因在合格样品组与不合格样品组斑马鱼样本中的表达趋势无显著性差异，难以用于评价XKS的质量。根据fosab表达趋势，可以将除1/2DS、1/2GG外的9个不合格样品与合格样品进行区分。根据serpinh1b表达趋势，可以将除QSQ样品以外的10个不合格样品与合格样品进行区分。综合应用fosab和serpinh1b的表达趋势，可以区分本研究所用的所有合格与不合格样品。
本发明首次发现斑马鱼中fosab基因和/或serpinh1b基因，与空白对照组相比，心可舒处理组中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量都显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格。
根据所筛选的差异基因在合格样品组与不合格样品组中的差异表达，选择能用于判别合格样品和不合格样品的差异基因，用于建立基于斑马鱼基因表达谱的XKS质量控制方法，本发明为基于基因表达谱的中成药质量控制研究提供了新思路与方法，对斑马鱼在处方复杂且具有多种功能主治的中成药生物效应质量控制方法中的应用具有示范作用。
Claims (7)
1.检测斑马鱼中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量变化的试剂在控制心可舒质量中的应用；
所述fosab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述serpinh1b基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述应用中，选用4 dpf野生型AB系斑马鱼，将健康斑马鱼随机分配为空白对照组和心可舒样品处理组，空白对照组给予：养鱼水；心可舒样品处理组给予：养鱼水和心可舒样品提取物，养鱼水中心可舒样品提取物换算为心可舒的终浓度为680 μg/mL；孵育24h，制得斑马鱼样本；
心可舒样品提取物处理斑马鱼，与空白对照组相比，fosab基因和/或serpinh1b基因表达量显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格；
心可舒样品提取物的制备方法，包括如下步骤：
取心可舒样品研磨成粉，加入8-10倍量的甲醇，常温浸泡28-32 min，然后再超声提取28-32 min，抽滤，药渣重复提取2-3次，合并滤液，减压浓缩至1/10以下体积，然后再58-60℃水浴至浸膏状，真空干燥，制得心可舒样品提取物。
2.一种基于斑马鱼基因表达谱筛选的差异基因控制心可舒质量的方法，包括如下步骤：
（1）选用4 dpf野生型AB系斑马鱼，将健康斑马鱼随机分配为空白对照组和心可舒样品处理组，空白对照组给予：养鱼水；心可舒样品处理组给予：养鱼水和心可舒样品提取物；孵育24h，制得斑马鱼样本；
（2）分析步骤（1）制备的斑马鱼样本中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量的变化，所述fosab基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；serpinh1b基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
与空白对照组相比，心可舒处理组中fosab基因和/或serpinh1b基因表达量显著下调，判断心可舒样品合格，否则判断心可舒样品不合格；
步骤（1）中，心可舒样品提取物的制备方法，包括如下步骤：
取心可舒样品研磨成粉，加入8-10倍量的甲醇，常温浸泡28-32 min，然后再超声提取28-32 min，抽滤，药渣重复提取2-3次，合并滤液，减压浓缩至1/10以下体积，然后再58-60℃水浴至浸膏状，真空干燥，制得心可舒样品提取物；
步骤（1）中，养鱼水中心可舒样品提取物换算为心可舒的终浓度为680 μg/mL。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，养鱼水的成分含有5.0 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.4 mM CaCl2，0.16 mM MgSO4。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，各组设置2个以上平行，每个平行30条以上斑马鱼；空白对照组给予：养鱼水中含体积分数为0.1%DMSO；心可舒样品处理组给予：养鱼水中含体积分数为0.1%DMSO+心可舒样品提取物换算为心可舒的终浓度为680 μg/mL；孵育温度28℃，孵育24 h，用水将每组斑马鱼进行清洗，制得斑马鱼样本。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，用DEPC水将每组斑马鱼进行清洗。
6.如权利要求1所述的应用或权利要求2所述的方法，其特征在于，心可舒样品提取物的制备方法，包括如下步骤：取心可舒样品研磨成粉，加入10倍量的甲醇，常温浸泡30min，然后再超声40 Khz提取30 min，抽滤，药渣重复提取2次，合并滤液，减压浓缩至1/10体积，然后再60℃水浴至浸膏状，真空干燥，制得心可舒样品提取物。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，利用实时荧光定量PCR技术，分析步骤（1）制备的斑马鱼样本中fosab基因、serpinh1b基因表达量的变化。
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2023
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