CN109180745B - 一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备n-乙酰神经氨酸的方法 - Google Patents

一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备n-乙酰神经氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N‑乙酰神经氨酸的方法,以含有聚唾液酸的物料为原料,通过除菌及固形物、除蛋白、脱色、水解、除盐、结晶等步骤获得了高纯度的N‑乙酰神经氨酸产品,经测试其纯度至少为98%,可以满足其在食品、保健、医药和化妆品等领域的要求。本发明的方法简单易操作,特别适合于工业化发酵生产N‑乙酰神经氨酸。

Description

一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸 的方法
技术领域
本发明涉及一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法,属于生化分离工程技术领域。
背景技术
微生物发酵法生产聚唾液酸,已有很多文献报道。虽然微生物发酵法生产聚唾液酸的发酵方法和工艺已有很多报道,但对于下游阶段产物的分离提纯方法却不多,而且仅有的现有技术中,一般是先离心去除菌体,然后加入大量的乙醇和络合物去沉淀聚唾液酸和蛋白质,得到的粗品聚唾液酸再水解,结晶,纯化后进一步得到,而且其中要用到离子交换柱等,整个过程复杂繁琐,工艺复杂,不利于工业生产。
目前市场需求领域如食品、保健和医药领域对N-乙酰神经氨酸产品品质要求较高,纯度均要求大于98%,而目前市场上纯度大于98%的产品价格非常昂贵。昂贵的价格和较高的品质需求,导致下游的分离提纯方法尤其重要,因为下游的分离提纯方法和工艺直接决定了产品的品质和市场价格,而微生物发酵制品的难点一般就在下游的分离提纯过程。目前N-乙酰神经氨酸的应用领域逐渐扩大,其市场需求也非常大,这就要求必须要有竞争力的制备方法,因此如何利用简单的方法从聚唾液料液中分离提纯制备高纯度N-乙酰神经氨酸是亟待研究的问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足之处,提供了一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法,本发明方法能够获得高纯度的质量稳定的N-乙酰神经氨酸,且简单易行,满足食品、保健、医药和化妆品等领域的应用需求。
本发明从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法,包括如下步骤:
步骤1:以含有聚唾液酸的物料为原料,通过添加絮凝剂絮凝菌体及固形物,然后膜过滤去除,获得含有聚唾液酸的清液物料;
步骤2:利用超滤膜过滤除去步骤1获得的含有聚唾液酸的清液物料中的二价盐离子及蛋白等杂质;
步骤3:向步骤2获得的除盐和除蛋白的料液中加入酸性溶液,调节pH值至0-5.0,再于50-100℃下加热处理,以使聚唾液酸水解,得到聚唾液酸水解液;
步骤4:利用活性炭或凹土(添加质量占料液质量的1~5wt%)对步骤3获得的聚唾液酸水解液进行吸附脱色,获得脱色料液;
步骤5:向步骤4获得的脱色料液中加入碱性溶液,中和料液至中性;
步骤6:利用纳滤膜除去步骤5中和后料液中的一价盐离子;
步骤7:将步骤6所得清液浓缩后溶剂结晶,洗涤并干燥即可获得高纯度N-乙酰神经氨酸。
步骤1中,所述絮凝剂为聚丙烯酸酰胺阳离子絮凝剂;膜过滤时使用的膜为陶瓷膜,孔径为1nm~800nm。
步骤2中,超滤膜过滤时采用有机超滤膜,截留分子量为5000~10000D。
步骤3中,所述酸性溶液为强酸、中强酸或弱酸,如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸等。
步骤5中,所述碱性溶液为强碱水溶液或弱碱水溶液,如氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或氨水等。
步骤6中,所述纳滤膜为截留分子量≥500D的有机膜。
步骤7中,浓缩后所得浓缩液的浓度为200~600g/L。
步骤7中,溶剂结晶时所用溶剂为强酸、中强酸或弱酸性溶剂,如盐酸、硫酸、磷酸或醋酸等。
本发明原料中含有聚唾液酸的物料包括以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液、以燕窝来源或其他来源的聚唾液酸物料等。
本发明的有益效果体现在:
1、本发明首先利用膜过滤方法除去聚唾液酸料液中含有的盐及杂蛋白,使后续分离提纯压力减小,有利于后续的进一步分离提纯;
2、本发明方法与现有技术方法不同,现有方法先沉淀聚唾液酸,冷冻干燥得到聚唾液酸粗品,然后再复溶,再去除杂质,然后再水解,最后再结晶提纯,工艺复杂,损失了较高;本发明方法先水解聚唾液酸,然后再去除杂质,然后浓缩结晶,步骤简单,可以通过简单的几步即可得到高纯度N-乙酰神经氨酸。
3、经高效液相色谱法检测,本发明方法所得产品的纯度高于98%,满足市场需求,且成本低。
附图说明
图1为本发明实施例1所得产品的外观形态。
图2为本发明实施例1所得产品的高效液相色谱检测图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明。但这些实施例仅用于说明本发明,而不构成对本发明范围的限制。
实施例1:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量15%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为50nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用10000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白。
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入盐酸,0.5M同体积加入,然后85℃加入2h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量1%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6
6、除一价盐:上述中和液进入500D纳滤膜进行过滤,除去一价盐;
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至500g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至0.5进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体(外观形态如图1所示)采用高效液相色谱法检测(结果如图2所示),纯度为98.5%。
实施例2:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量20%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为100nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用8000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白。
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入盐酸,0.5M同体积加入,然后75℃加入2h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量2%的活性炭,在35℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6.5.
6、除一价盐:上述中和液进入600D纳滤膜进行过滤,除去一价盐;
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至400g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至1.0进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体(外观形态如图1所示)采用高效液相色谱法检测(结果如图2所示),纯度为98.5%。
实施例3:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量25%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为200nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用8000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白。
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入盐酸,0.1M同体积加入,然后95℃加入2.5h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量3%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为7.0
6、除一价盐:上述中和液进入600D纳滤膜进行过滤,除去一价盐
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至450g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至1.5进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体采用高效液相色谱法检测,纯度为98.2%。
实施例4:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量15%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为800nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用10000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白。
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入硫酸,0.1M同体积加入,然后95℃加入1h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量4%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6.5;
6、除一价盐:上述中和液进入500D纳滤膜进行过滤,除去一价盐;
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至550g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至1.0进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体采用高效液相色谱法检测,纯度为98.2%。
实施例5:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量15%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为400nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用8000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白。
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入硫酸,0.5M同体积加入,然后85℃加入2h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量2%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6.5;
6、除一价盐:上述中和液进入500D纳滤膜进行过滤,除去一价盐。
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至500g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至1.5进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体(外观形态如图1所示)采用高效液相色谱法检测(结果如图2所示),纯度为98.0%。
实施例6:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、菌液分离:以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液为原料,加入占发酵液质量20%的聚丙烯酰胺进行菌体絮凝沉淀,然后采用孔径为500nm的陶瓷膜进行过滤,使菌体和发酵液彻底分离,获得除菌发酵液,经高效液相色谱检测,除菌前后发酵液中目标产物聚唾液酸含量几乎没有变化;
2、去除盐离子和杂蛋白:上述除菌发酵液利用6000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子和杂蛋白;
3、水解:向除蛋白和除盐发酵液中加入硫酸,0.1M同体积加入,然后85℃加入2h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸;
4、脱色:向上述水解液中加入占除蛋白发酵液质量1%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色发酵液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6.5;
6、除一价盐:上述中和液进入600D纳滤膜进行过滤,除去一价盐;
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至500g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至0.5进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体、采用高效液相色谱法检测,纯度为98.1%。
实施例7:
本实施例中从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法如下:
1、以燕窝来源的聚唾液酸物料为原料,首先对燕窝进行预处理,破碎蒸煮并过滤;
2、去除盐离子:上述料液利用6000D的有机膜进行过滤,加入大量水,直至截留液和透过液电导率一致,除去盐离子。
3、水解:向除盐料液中加入硫酸,0.1M同体积加入,然后85℃加入2h,使聚唾液酸水解成N-乙酰神经氨酸。
4、脱色:向上述水解液中加入1%的活性炭,在30℃条件下进行吸附脱色1h,获得脱色料液;
5、中和:在上述脱色液中加入氢氧化钠碱性溶液,进行中和至pH为6.5
6、除一价盐:上述中和液进入600D纳滤膜进行过滤,除去一价盐。
7、浓缩结晶:上述除一价盐后的清液进行浓缩,浓缩至300g/L,然后在浓缩液中加入盐酸调节pH至0.5进行降温结晶,晶体利用乙醇进行洗涤,然后干燥得到N-乙酰神经氨酸;烘干后的晶体、采用高效液相色谱法检测,纯度为98.1%。
下表为含有聚唾液酸的微生物发酵液利用不同的酸进行水解的结果:
Figure BDA0001868059920000071
从表中数据可以看出,盐酸和硫酸水解效果相差不多,温度是影响水解的主要因素,温度越高水解效果越好;随着水解时间的延长,水解率越来越高,但当超过一定时间时,水解率就会下降,这可能是目标产物在酸性条件下不稳定的因素导致。因此最佳水解条件酸浓度0.1M,温度为85℃左右,水解时间为2~3h。

Claims (5)

1.一种从含有聚唾液酸的物料中分离提纯制备N-乙酰神经氨酸的方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤1:以含有聚唾液酸的物料为原料,通过添加絮凝剂絮凝菌体及固形物,然后膜过滤去除,获得含有聚唾液酸的清液物料;
步骤2:利用超滤膜过滤除去步骤1获得的含有聚唾液酸的清液物料中的二价盐离子及蛋白杂质;超滤膜过滤时采用有机超滤膜,截留分子量为5000~10000D;
步骤3:向步骤2获得的除盐和除蛋白的料液中加入酸性溶液,0.1M同体积加入,于85℃下加热处理2-3h,以使聚唾液酸水解,得到聚唾液酸水解液;所述酸性溶液为盐酸或硫酸;
步骤4:利用活性炭或凹土对步骤3获得的聚唾液酸水解液进行吸附脱色,获得脱色料液;
步骤5:向步骤4获得的脱色料液中加入碱性溶液,中和料液至中性;
步骤6:利用纳滤膜除去步骤5中和后料液中的一价盐离子;
步骤7:将步骤6所得清液浓缩后溶剂结晶,洗涤并干燥即可获得高纯度N-乙酰神经氨酸;溶剂结晶时所用溶剂为盐酸、硫酸或醋酸;
步骤1中,所述含有聚唾液酸的物料是以微生物发酵法生产的聚唾液酸发酵液;
步骤1中,所述絮凝剂为聚丙烯酸酰胺阳离子絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤1中,膜过滤时使用的膜为陶瓷膜,孔径为1nm~800nm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤5中,所述碱性溶液为强碱水溶液或弱碱水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤6中,所述纳滤膜为截留分子量≥500D的有机膜。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤7中,浓缩后所得浓缩液的浓度为200~600g/L。
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