JP2010505916A - DnaKの精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Nandan et al. J.、 Immunological Methods(1994)176:255−264、
Grossmann et al.、Exp.cell Res. (2004)297:108−117、
Peng et al.、J.Immunological Methods(1997)204:13−21、および
Jindal et al.、 Biotechnology(1995)13:1105−1109
を参照のこと。
・他のシャペロンタンパク質を加えなくともATPアーゼ活性を有し、
・T細胞刺激性不純物を含まない
精製された組み換え熱ショックタンパク質HSP、好ましくはDnaKによって解決される。
・最大で30μg/mLまでT細胞の増殖がみられないこと、
・最大で10μg/mLまでTNF−αの産生がみられないこと
を意味する。
a)95重量%以上の純度、
b)タンパク質1mg当たり1ng以下の残存DNA混入、
c)5重量%未満の残存宿主細胞タンパク質(HCP)混入、
d)タンパク質1μg当たり0.5E.U.未満のエンドトキシン混入
を有するDnaKである。
・タンパク質、
・ペプチド、
・核酸、
・リポ多糖類(LPS)、
の混入を有する可能性があると理解されている。
a)イオン交換クロマトグラフィー、
b)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
c)ゼラチンクロマトグラフィー、
のステップを含む。
a)本発明の組み換えDnaKとATPを、1:1〜1:10のDnaK:ATPモル比で混合するステップ、
b)少なくとも1つのペプチド、または少なくとも1つのタンパク質を添加するステップ、
c)10℃〜60℃、好ましくは20℃〜45℃の温度でインキュベートするステップ
を含む。
DnaK産生
細菌株
大腸菌株JS219/pOFXtac−1/KJ1を、大腸菌DnaKをコードするプラスミドを導入することによって、遺伝子改変する。クローニングステップおよびベクターpOFXtac−1/KJ1の構築は、Castanie MP、Berges H、Oreglia J、Prere MF、Fayet O A set of pBR322−compatible plasmids allowing the testing of chaperone−assisted folding of proteins overexpressed in Escherichia coli; Anal Biochem(1997)254(1):150−152に記述されている。
種菌(Master Seed)のバイアル1本(1.5mL)を室温まで解凍する。500mLのYES+カナマイシン培地(30g/L 酵母抽出物、5g/L 塩化ナトリウム、および50mg/L 硫酸カナマイシン)を含む3つの2L振盪フラスコに、それぞれ400μLの種菌を播種し、OD600nmが0.7単位を超えるまで、6±0.5時間、37℃で振盪(270rpm)培養する。
当該前培養液を、50LのNRJ18+カナマイシン培地(5.2g/L KH2PO4、10.7g/L K2HPO4、0.4g/L グリセロール、50g/L 酵母抽出物、30g/L 大豆ペプトン、2.5g/L MgSO4・7H2O、0.6mL/L SAG471、100mg/L 硫酸カナマイシン)を含む、予め殺菌した発酵槽に加える。温度を37℃±5℃に、圧力を360mbarに維持する。吸光度が25±1になったとき、IPTG(最終濃度1mM)を添加することによって培養液を誘導する。その後、誘導条件を4時間維持する。培養液を20℃未満に急速冷却する。培養液を50pm Sartopure PP2濾過装置を通して濾過する。細胞沈殿物を4500rpm(5000×g)、30分間、4℃の遠心分離により回収し、使用まで−20℃で凍結する。
細胞沈殿物は、室温において20mM Tris−HCI、pH8中で解凍する。次いで、細胞ペースト濃度を、緩衝液を加えることによって、1L当たり166.6gの新鮮細胞重量に調節する。細胞懸濁液を、氷上においたタンクに充填する。ホモジナイズした細胞を、Niro Soavi Panda高圧力破壊器を用いて、800および50barsの平均圧力で、2サイクル破壊する。
QセファロースHPクロマトグラフィー(QHP)
陰イオン交換クロマトグラフィーは、QセファロースHP(Amersham Biosciences)を用いて行う。高度精製水を68cm/h(33.4L/h)の線流速でカラムに充填する。充填カラムベッドの寸法は、直径250mm、断面積132cm2、ベッド高25.0cm、充填容積約12.27Lである。
第2のクロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイトII型−40μm(Bio−Rad)を用いて行う。樹脂(2000g)を、緩やかに攪拌しながら、3.2LのNa2HPO4・12H2O+NaH2PO4・2H2O 200mM、pH6.8に注ぎ入れる。Na2HPO4・12H2O+NaH2PO4・2H2O 200mM、pH6.8を、線流速175cm/h(26.9L/h)でカラムに充填する。充填したカラムベッドの寸法は:直径14cm、断面積=154cm2、ベッド高=21.5cm、充填容量=3.31Lである。
30kDaメンブランでのダイアフィルトレーション、およびSephacryl S100 HR樹脂でのクロマトグラフィーによって不純物を分離することを試みた。これら二つの方法で、不純物を取り除くことはできなかった。実際、ダイアフィルトレーションの滞留物中に、不純物がDnaKとして回収される。Sephacryl S100 クロマトグラフィーにおいては、不純物がDnaKと共溶出した。
DnaKから不純物を分離するために試験した第3の方法には、ゼラチンセファロースファストフロー樹脂(GE Healthcare)でのクロマトグラフィーが含まれる。高度精製水を線流速150cm/h(19.9L/h)でカラムに充填する。充填したカラムベッドの寸法は:直径13cm、断面積133cm2、ベッド高15cm、充填容積1.99Lである。
濃縮は、2つのPLCTK pellicon 2 メンブラン(カットオフ分子量30kDa、0.1m2、Millipore)で、Proflux M 12(Millipore)を用いて行う。
ダイアフィルトレートした滞留物で行ったUVアッセイに従って、その濃度を、30mM Na2HPO4・12H2O+20mM NaH2PO4・2H2O、pH7.3緩衝液で2.5mg/mLに調節する。
実施例1によって得られたDnaKは非常に純粋である。
タンパク質純度
タンパク質に関しては、SDS−PAGEゲルのクマシー染色で決定されたように、純度は98.25%を超える(図5)。当該物質を変性し、量を減少させながら4〜12%ビス/トリスNU−PAGEゲルにロードした。タンパク質を電気泳動で分離し、クマシーブルーR250(0.1%)で染色した。産物の純度を、異なる希釈度におけるDnaKのバンド強度と、レーン2で検出可能な、混入物と考えられる各バンドの強度とを比較することで評価する。
23S染色体DNAに対する細菌DNA特異的プライマーを用いてRT−PCRで定量した残存DNA含有量は、タンパク質1mg当たり0.22ngである。定量リアルタイムPCRは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によるゲノムDNAの増幅に基づいている。この方法においては、増幅されたDNAの量を、新しく形成された二本鎖DNAに結合するSYBRグリーン色素を用いた蛍光測定によってリアルタイムで追跡する。細菌DNAに対するプライマーは、Smithらによって提案されているように23S染色体DNAから選択された(Smith et al.、BioTechnique(1999)26:518−526)。
ELISAで決定された残存宿主細胞タンパク質含有量は0.00004%である。Cygnus Technologies Inc.により開発された細菌タンパク質含有量測定は、サンドイッチELISAの原理に基づいている。簡潔に言うと、96穴プレートを、抗大腸菌捕捉抗体でコーティングする。試料に含まれる大腸菌タンパク質は、これらの抗体に捕捉され、アルカリホスファターゼと結合した別の特異的大腸菌抗体を用いて検出される。洗浄して非結合の試薬を取り除いた後、酵素の基質(p−ニトロフェニルリン酸:pNPP)を加える。吸光度測定は、反応生成物濃度、すなわち試料中に存在する宿主細胞タンパク質に比例する。
エンドトキシン含有量(LAL法で測定)は、タンパク質1μg当たり0.002E.U.である。エンドトキシンを定量するために用いた方法は、Cambrex社によって開発されたKinetic−QCL(登録商標)テストである。この方法は、グラム陰性細菌エンドトキシンが、カブトガニ血球細胞溶解物(LAL)中の酵素前駆体の活性化を触媒する次の原理に基づいている。この酵素の活性化に際し、p−ニトロアニリン(pNA−yellow)がAc−Ile−Glu−Ala−Ag−pNa(無色)から遊離される。培養中、405nmでの吸光度を継続的に測定する。吸光度は培地中のpNA濃度に比例する。試料中のエンドトキシン濃度を、その反応時間から、既知の量の大腸菌エンドトキシンスタンダードの反応時間と比較することによって計算する。
この方法で得られた精製DnaKの40%はヌクレオチドを含まないDnaKに相当し、残りの60%がDnaK−ADPである。
DnaKの機能性を確認するため、そのATPアーゼ活性を測定した。外因性のATPを加え、ADP産生を経時的に追跡した。ヌクレオチドはC18カラムを用いたイオン対逆相クロマトグラフィーによって分析する。ATP加水分解の速度は、0.05分-1であり、これは、文献(Jordan et McMacken、J.Biol.Chem.(1995)270:4563−4569)で報告された値に一致している。詳細には、外因性のATP(6モル当量)を、50mM Tris、pH7.4、3mM MgCl2、および10mM KClの存在下でDnaKに加えた。反応培地のアリコート(500μL)を5、15、30、45、および60分後に収集し、100μLの1M塩酸を加えることによって反応を停止した。10kDaフィルターで濾過してDnaKからヌクレオチドを分離し、濾液を中和した後、C18カラムでのイオン対逆相クロマトグラフィーによって分析した(図6)。溶離液は、100mMリン酸緩衝液、および20%メタノールからなり、テトラブチルアンモニウムを対試薬として用いた。
DnaKは炎症性効果を有しない:
DnaKは、全血に添加された場合、細菌リポ多糖類(LPS)と比較して、インターロイキン1β(IL−1β)、インターロイキン6(IL−6)、または腫瘍壊死因子α(TNFα)の非常に低い産生しか誘導しなかった。これらサイトカインの産生は、高濃度のDnaK(30μg/mL)でのみ検出可能であった(図7)。サイトカイン産生は、DnaKまたはLPSの存在下で24時間培養した全血で定量し、測定はELISAで行った。
ヒトPBMC(末梢血リンパ球)をDnaKのみの存在下で培養(6日間)したとき、TH1タイプのリンパ球の活性化を示すインターフェロン−γ(IFN−γ)は産生されなかった(図8)。TH1リンパ球の活性化およびIFN−γ産生は、炎症性応答を活性化する。
ヒト血液から精製したPBMCを、DnaK(1〜9μg/mL)または水痘帯状疱疹ウイルス抗原(ポジティブコントロールとして、1CPAU/mL)の存在下で、96穴プレートで5日間培養した。100μLの培地を、1μCiのトリチウム標識チミジンを含む新鮮培地に置換し、細胞をさらに16時間培養した。第6日目、トリチウム標識チミジンの取り込みを、液体シンチレーションを用いたベータ計数器で測定した。
ヒトPBMCを、カンジジンのみ、またはカンジジンと濃度を増加させたDnaK(1〜20μg/mL)の存在下で3日間培養した。培地中のIFN−γをELISAで定量した。結果は4回測定の平均±SDとして表す。
IL−10は、寛容のひとつのメディエーターである。IL−10は、細胞表面にCD25を強く発現するいくつかのTreg細胞(これらはCD25+細胞である)によって産生される。
ELISA試験を用いて、ヒト血清中に抗DnaK IgGが存在することを指摘した。(健康なボランティア、およびアレルギー患者からの)試験試料の40%において、OD405nmは、BSAの場合よりもDnaKの場合のほうが大きかった(図11)。これは、BSAに対してよりもDnaKに対してのほうがよりIgGの力価が高いことを示している。
Claims (18)
- 精製された組み換えDnaK調製物であって、
他のシャペロンタンパク質を加えなくともATPアーゼ活性を有し、
本質的にT細胞刺激性不純物を含まない
調製物。 - a)95重量%以上の純度、
b)タンパク質1mg当たり1ng以下の残存DNA混入、
c)5重量%未満の残存宿主細胞タンパク質(HCP)混入、
d)タンパク質1μg当たり0.5E.U.未満のエンドトキシン混入
を有する請求項1に記載の精製された組み換えDnaK調製物。 - 純度が98%以上、好ましくはペプチド含有量がモル基準で1%未満である請求項1または2に記載の組み換えDnaK調製物。
- 残存DNA混入が、0.5ng/mg以下、および/またはHCPが0.1重量%未満、より好ましくは0.0001重量%未満である請求項1〜3のいずれか1項に記載の組み換えDnaK調製物。
- DnaKが加水分解されている請求項1〜4のいずれか1項に記載の組み換えDnaK調製物。
- エンドトキシン混入が、タンパク質1μg当たり0.01E.U.未満である請求項1〜5のいずれか1項に記載の組み換えDnaK調製物。
- DnaKが、本質的にヌクレオチドを含まないか、ADPとの複合体の形であるか、ATPとの複合体の形であるか、またはそれらの混合物である請求項1〜6のいずれか1項に記載の精製された組み換えDnaK調製物。
- DnaKが、少なくとも98重量%の純度を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載の精製された組み換えDnaK調製物。
- 細胞溶解物から請求項1〜8のいずれか1項に記載の組み換えDnaK調製物を精製する方法であって、
a)イオン交換クロマトグラフィー、
b)ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
c)ゼラチンクロマトグラフィー
のステップを含む方法。 - DnaKが、腐生細菌由来、好ましくは大腸菌由来である請求項9に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィーが、陰イオン交換クロマトグラフィーである請求項9〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、ヒドロキシアパタイトII型クロマトグラフィーである請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ゼラチンクロマトグラフィーが、ゼラチンセファロースで行われる請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換えDnaKと少なくともひとつのペプチドまたは少なくともひとつのタンパク質との間の複合体を形成する方法であって、
a)請求項1〜8のいずれか1項に記載の組み換えDnaKとATPを、1:1〜1:10のHSP:ATPモル比で混合するステップ、
b)少なくとも1つのペプチド、または少なくとも1つのタンパク質を加えるステップ、
c)10℃〜60℃、好ましくは20℃〜45℃の温度でインキュベートするステップ
を含む方法。 - 請求項1〜8に記載の組み換えDnaKと、少なくとも1つのペプチドまたは少なくとも1つのタンパク質との混合物であって、好ましくは複合体の形である混合物。
- インビボおよび/またはインビトロ診断のための、請求項1〜8に記載のDnaKまたは請求項15に記載の混合物もしくは複合体の使用。
- アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶もしくは神経変性疾患の寛容、治療もしくは予防を誘発するための医薬組成物の調製のため、または液性応答もしくは調節性T細胞応答を誘発する免疫賦活剤としての、請求項1〜8に記載の精製された組み換えDnaKまたは請求項15に記載の混合物もしくは複合体の使用。
- 請求項1〜8に記載の精製された組み換えDnaK調製物または請求項15に記載の混合物もしくは複合体を含む、医薬品。
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