JPH07505365A - 耐性の誘導に有用なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 耐性の誘導に有用なペプチド １９２３球は免疫応答の特異的及び非特異的の両エフェクター機構を媒介し、調 節することができる。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は抗体生産を助け、他のＴ細胞の成長 及び他の免疫細胞、例えば単球及び顆粒球の成長と分化を媒介するサイトカイン を分泌する。基礎的及び生化学的研究により、細胞免疫応答の発生が抗原提示細 胞上で発現される主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）の産物と会合した異種 タンパク質のペプチドフラグメントを認識するＴ細胞上の抗原レセプターに依存 していることが示された。

ヒト及びマウスＴ細胞クローンを用いた実験により、Ｔ細胞レセプターとペプチ ド／ＭＨＣタンパク質複合体の相互作用は、続くペプチド／ＭＨＣ攻撃（ｃｈａ ｌｌｅｎｇｅｓ）に細胞が応答する能力の活性化又は不活化のいずれかに導くこ とが示された（Ｌａｍｂ、Ｊ、Ｒ，、ｅ±一旦土、（１９８３）Ｊ、ｏｆ　Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、１５ユニ１４３４−：　３７０４−３７１２）、Ｔ細胞レセプター の関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が続いてペプチド／Ｍ）（Ｃタンパク質複合体 に応答するＴ細胞の能力を活性化するか、又は阻害するかは、抗原提示細胞によ りＴ細胞に与えられる（ｄｅ　Ｉ　ｉｖｅ　ｒｅｄ）共刺激シグナル（ｃｏｓ　 ｔ　ｉｍｕ　Ｉａｔｏｒｙ　ｓｉｇｎａｌｓ）の存在又は不在により決定するこ とができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｍ、に、、ｅｔ　ａｌ、（１９９０）Ｊ、ｏｆＩ ｍｍｕｎｏ　１．１４４　：１５８５−１５９０　：及びＪｅｎｋｉｎｓ。

Ｍ、に、　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ，Ｈ，（１９８７）Ｊ、　。

ｆ　Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ、１６５：３０２−３１９）、例はＢ７のＣＤ２８結合 によって生成されるシグナルである（Ｊ　ｅｎｋ　ｉｎｓ、　Ｍ、Ｋ、。

ｅｔ　ａｌ（１９９１）Ｔｈｅ　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７：２４６ １−２４６６；Ｌｉｎ５ｌｅｙ、Ｐ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、（１９９Ｑ）ＰＮＡＳ 　ＵＳＡ　５０３１−５０３５）。この種の共刺激現象は、Ｔ細胞レセプターが 適したＭＨＣタンパク質及びペプチドに結合する場合でもＴ細胞活性化のための 必要条件であると思われる。興味深（、ことに、第２のシグナルがないと抗原特 異的Ｔ細胞は耐性となるか、又はアネルギーの状態になる。さらに、抗原攻撃へ の生体内耐性が可溶性抗原（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ｆ、Ｍ、ａｎｄ　Ｗｅｉｇｌｅ 、Ｗ、Ｏ。

（１９６４）Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、９２：１６７−１７２：Ｍｉｔｃｈｉ ｎｓｏｎ、Ｎ、Ａ、（１９６４）Ｐｒｏｃ、Ｒｏｙ、５ｏｃＢ、１６１：２７５ −２９２Ｌ又は第２のシグナルを排除する方法で投与された免疫原性ペプチドを 用いて示された（Ｇａｍｍｏｎ、Ｇ。

ａｎｄ　５ｅｒｃａｒｚ、Ｅ、Ｅ、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：１８３ −１８５；Ｒ４ａ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３４３：３ ７１−３８３）。内在性抗原に対する末梢Ｔ細胞耐性もＭＨＣ遺伝子形質転換マ ウスにおいて生体内で示された（Ｂｕｒｋｌｅｙ、Ｌ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、　（ １９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：５６４−５５５．Ｍｉ　Ｉ　ｌｅｒ、Ｊ、Ｆ 、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、（１９９１）ｍｅｒｌｉｎｇ、Ｇ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、（ １９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｒｅｖｉｅｗｓ　１２２：４７−６７において考察）。

最近の技術の進歩は、抗原特異的ヒト及びマウスＴ細胞系ならびにクローンを試 験管内で有効に培養することを可能にした。さらに現在、組み換えＤＮＡ法又は 固相ペプチド合成を用いて大量のタンパク質抗原又はそのフラグメントを生産す ることが可能である。かくしてこの数年の間に、いくつかの研究グループがＭＨ Ｃと会合したＴ細胞により認識される抗原性タンパク質（Ｔ細胞エピトープ）の 直鎖状アミノ酸配列を決定し始めた。バクテリア及びウィルス病原体、自己抗原 、アレルゲン及び他の実験的（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）抗原、例えばニワト リ卵リゾチーム（ＨＥＬ）　、オボアルブミン（ＯＶＡ）及びラムダリプレッサ ー（ＣＩ）を含む多様なタンパク質抗原に由来するペプチドが抗原特異的Ｔ細胞 を刺激する能力に関して調べられた。広範囲のペプチドがＴ細胞エピトープとし て働くことが報告された。例えばＯＶＡアミノ酸残基３２４−３３９　（Ｓｈｉ ｍｏｎｋｅｖｉｔｚ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　、ＬＩｍｍｕｎｏ　１．．１３３　 ：　２１６７　（１９８４））　、ＨＥＬアミノ酸残基７４−９６　（Ｓｈａｓ ｔｒｉ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６４　：　８８２−８９６ 　（１９８６））及びラムダリプレッサー（ｃ　Ｉ）アミノ酸残基１２−２６　 （Ｌａｉ、　Ｍ、　−Ｚ　ｅｔ　ａｔ、　。

Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　、　１３９：３９７３−３９８０　（１９８７））は 全タンパク質−感作（Ｐｒ　ｉｍｅｄ）Ｔ細胞を刺激することが示された。

さらにＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇアミノ酸残基１９−３３）に由来するペプ チドは組み換えＢ型肝炎ワクチンで免疫化したヒト患者の大半においてＴ細胞応 答を刺激することが示された（Ｓｃｈａｄ、Ｖ、Ｃｅｔ　ａｌ、、ｓｅｍｉｎａ ｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３：２１７−２２４　（１９９１））。マイコ バクテリア主要抗原６５−　ｋ　Ｄタンパク質もエピ−ドブ−マツピングされた （Ｌａｍｂ、Ｊ、Ｒ，ｅｔ−ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、、６（５）：１２４５−１２ ４９　（１９８７））。

６５−　ｋ　Ｄタンパク質のアミノ酸残基１１２−１３２及び４３７−４５９か ら成るペプチドにおいてＴ細胞エピトープが同定された。実験的自己免疫脳を髄 炎（ＥＡＥ）を起こし、多発性硬化症（ＭＳ）における推定自己抗原であるミニ リン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）もヒト（Ｏｔａ。

Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４６：１８３　１８７（１９９０） ）及びネズミ（Ｚａｍｖｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：２５８− ２６０　（１９８６））の両系においてエピトープマ・ツピングされた。Ｏｔａ 　ｅｔ　ａｌ、はＭＳ患者により認識される主要Ｔ細胞エピトープ、ＭＢＰアミ ノ酸残基８４−１０２を同定した。ＭＳ患者からのＴ細胞により認識される微Ｊ ｉ（ｍｉｎｏｒ）エピトープ（ＭＢＰアミノ酸残基１４３−１６８．６１−８２ ．１２４−４２及び３ｌ−５０）も記載された。Ｚａｍｖｉｌ　ｅｔ　ａｔ、は ＭＢＰアミノ酸残基１−１１が感受性ネズミ株においてＥＡＥを起こす主要Ｔ細 胞エピトープを含むことを示した。

アレルゲン性タンパク質に存在するＴ細胞エピトープは極最近記載された（０° Ｈｅｈｉｒ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕとが示された（Ｔｈ ｏｍａｓ、Ｗ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ　旦ｐｉ幻」ヱＬ」ニー憂至四は−Ａ ＩｌヱＬ■ユ１」工ｌゾ至ｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｆｒｏｎ　Ｘ ＴＶ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　Ａ１１ｅ工（二土邸り以ロエ進ユ±」御二訂虱上邦ｌ・Ｂｅｒｌｉｎ　（ Ｓｅｐｔ、　１９８９）　ｐｐ、　７７−８２；Ｏ’　Ｈｅｈｉｒ。

Ｒ，Ｅ、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９：６７−９５ （１９９１）；Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｇ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎニジ宸エリヱＬ」 工Ｊ四ｏｐｉ工」■上虹１シ■−堕１シ」１ロ１工」工］包ｒｋｓ工匹り土輩皿 」娃茎」胆１Ｌヱ１ＬユＬ」亙Ｌ」！ｒｏｐｅリー入りＡμＭ二工上人月止し■ 二［」−阻工課」土しユ壓■エリユｇｙ、Ｂｅｒ　Ｉ　ｉｎ　（Ｓｅｐｔ、１９ ８９）　ｐｐ、４１−４７　；及びＹｅｓｓｅｌ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：Ｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａ ｓｅ：Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａ ｎｄ　Ｔ。

Ｉｅｒａｎｃｅ、Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　２２−２６　（Ｓｅｌ）ｔ、１９９０ ）Ｔｒｉｎｉｔｙ　ＣｏＣｏ１１ｅ、０ｘｆｏｒｄ　Ｕ、に、）。

ブタフサアレルゲンＡｍｂ　ａ　Ｉアミノ酸残基５４−６５に由来するＴ細胞刺 激ペプチドも報告された（Ｒｏｔｈｂａｒｄ、Ｊ、Ｂ、旦ニーａ　＋、、Ｃｅ　 Ｉ　１．５２　：５１５−５２３　（１９８８））。ドクムギアレルギー性患者 に由来するＴ細胞クローンのノくネルを用０、ＰｅｒｅｚＩのアミノ酸残基１９ １−２１０内に含まれることを示した（Ｐｅｒｅｚ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６５　（２７）：１６２１０−１６２１５　（１９９０ ））。

発明の概略 アレルギー性又は他の免疫応答が媒介する疾患に有効に介在するには、確立され た、又は進行中の免疫応答を変更することが必要である。本発明は、哺乳類にペ プチドを皮下投与すると、ペプチドが由来するタンパク質アレルゲン又は他の抗 原に対して哺乳類が無垢であっても、又は予備暴露されていても、同ペプチドに よるその後の攻撃に対するＴ細胞応答を低下させるという発見に基づく。本発明 は又、皮下又は他の経路の投与による耐性化に有用なペプチドに関する。そのよ うな耐性化が臨床的に有用であるためには、全タンパク質アレルゲン又は他のタ ンパク質抗原に対して環境的に暴露された時に有効でなければならない。か（し てタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原の少なくとも１つのＴ細胞エピ トープを含むペプチドを皮下投与すると、アレルゲン又は他の抗原に暴露した場 合にＴ細胞耐性化又はアネルギーを起こす。そのようなペプチド−誘導Ｔ細胞耐 性は、アレルギーなどの免疫媒介疾患の処置に用いることができる。静脈内又は 腹膜内注射でなく、ペプチドの皮下注射により耐性化できることは、より実用的 で有効な治療法を与える。

ヒトなどの哺乳類の耐性化の方法で有用なペプチドはタンパク質アレルゲンから 誘導することができる。これらのペプチドはアレルゲンの少な（とも１つのＴ細 胞エピトープを含み、免疫グロブリンＥ刺激活性が最小であることが好ましい。

さらに治療目的の場合、そのようなペプチドの免疫グロブリンＥとの結合は、ペ プチドが由来するタンパク質アレルゲンが免疫グロブリンＥと結合するより実質 的に低い程度であることが好ましい。タンパク質アレルゲンから誘導されたペプ チドは、タンパク質アレルゲンに対して感受性の患者の集団の実質的パーセンテ ージ（少なくとも約７５％）においてタンパク質アレルゲンに関して特異的な免 疫グロブリンＥと結合しないか、又はそのような結合が起こった場合、そのよう な結合が肥満細胞又は好塩基性細胞からのヒスタミンなどの媒介物放出を生じな いことがさらに好ましい。

本発明は又、インスリン、ミニリン塩基性タンパク質及びアセチルコリンレセプ ターなどの自己抗原に由来するペプチドの皮下投与にも関する。これらのペプチ ドは自己抗原に感受性の患者の集団の実質的パーセンテージ（少なくとも約７５ ％）において、自己抗原に関して特異的な免疫グロブリンと結合しないのが好ま しい。さらにタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原から誘導されたペプ チドは、本来のタンパク質の望ましくない性質（例えば酵素活性）を治療目的の ために除去できるように設計することができる。さらに治療効率を増すために、 本文に記載のペプチドは可溶性の形態で皮下により哺乳類に投与し、ペプチドが 由来するタンパク質抗原に対して哺乳類のＴ細胞を耐性化するのが好ましい。

Ｔ細胞反応性ネコタンパク質（ＴＲＦＰ）に由来し、耐性化に有用な、フェツス 　ドメスチクス（Ｆｅｌｉｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）に対する感受性を処置す るためのペプチドは本発明の範囲内である。以下のペプチドの１つ又はそれ以上 を含む組成物をフェツス　ドメスチクスに感受性の患者に投与することができる ：ＴＲＦＰのペプチドＸ（配列番号＝７）、ペプチドＹ（配列番号二８）、ペプ チドＺ（配列番号＝９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列番 号＋１１）、ペプチドＣ（配列番号：１２）、ペプチドＤ（配列番号＝１３）及 びペプチドＥ（配列番号・１４）。そのようなペプチドの少なくとも１つを含む １つ又はそれ以上の治療用組成物を治療的有効量で患者に投与することを含む、 患者においてフェツス　ドメスチクスに対する感受性を処置する方法も本発明の 範囲内である。

図面の簡単な説明 図１はリーダー配列Ａ（配列番号：１及び２）ならびにＢ（配列番号：３及び４ ）を含む、ヒトＴ細胞反応性ネコタンパク質（ＴＲＦＰ）の鎖１の核酸配列及び 推定アミノ酸配列である。

図２はリーダー配列（配列番号＝５及び６）を含むＴＲＦＰの鎖２の核酸配列及 び推定アミノ酸配列である。

図３はＴＲＦＰのペプチドＸ（配列番号ニア）、ペプチドＹ（配列番号：８）、 ペプチドＺ（配列番号＝９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ならびにペプチ ドＢ（配列番号＝１１）、ペプチドＣ（配列番号＝１２）、ペプチドＤ（配列番 号＝１３）及びペプチドＥ（配列番号：１４）のアミノ酸配列であり、それぞれ 少なくとも１つのＴＲＦＰのＴ細胞エピトープを含む。

図４はペプチドＹの皮下投与による、又はその後静脈内にペプチドＹで攻撃する することによるマウスにおけるＴ細胞耐性の誘導のグラフ図である。リンパ節細 胞を単離し、ペプチドＹと共に試験管内で培養し、ＩＬ−２の存在に関して調べ た。

図５はマウスにおいてペプチドＹの皮下投与を用いてＴ細胞耐性を誘導するのに 必要な投薬量応答のグラフ図である。

図６はマウスにおいてペプチドＸの皮下投与を用いてＴ細胞耐性を誘導するのに 必要な投薬量応答のグラフ図である。

図７はペプチドＸ及びペプチドＹの組み合わせを皮下投与し、続いてペプチドＸ 及びペプチドＹの両者で攻撃することによるマスクにおけるＴ細胞耐性の誘導の グラフ図である。リンパ節細胞を単離し、ペプチドＸとペプチドＹの組み合わせ と共に、あるいは個別のペプチドＸ又はペプチドＹと共に試験管内培養し、ＩＬ −２の存在に関して調べた。

図８はＴＲＦＰで予備免疫化したマウスの、ペプチドＹを投与した場合の応答の グラフ図である。

図９ＡはＴＲＦＰで感作し、ペプチドＹを用いて耐性化したマウスにおけるＴ細 胞耐性の誘導のグラフ図である。リンパ節細胞を単離し、ペプチドＹと共に試験 管内培養し、ＩＬ−２の存在に関して調べた。図９ＢはＴＲＦＰで感作し、ペプ チドＹを用いて耐性化したマウスにおけるＩｇＧ耐性の誘導のグラフ図である。

血清試料を得、標準的ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイにおいてペプチドＹへの結合に関 して検定した。

図１０Ａ及びＩＯＢはＴＲＦＰで感作し、ペプチドＹで耐性化したマウスにおけ るＴ細胞耐性の誘導のグラフ図である。リンパ節細胞を単離し、ペプチドＹと共 に試験管内培養し、ＩＬ−２（ＣＴＬＬ−３と共に培養）又はＩＬ−４（ＣＴ４ Ｓと共に培養）の存在に関して調べた。

図１１はＴＲＦＰの組み換え鎖１（ペプチドＹ及びペプチドＸ）、ペプチドＦｅ １３−１、ペプチドＹ１ペプチドＣ及びペプチドＤを用いたマウスにおけるＴ細 胞耐性の誘導のグラフ図である。マウスをＴＲＦＰの組み換え鎖１で攻撃した。

リンパ節細胞を単離し、ＴＲＦＰの組み換え鎖１と共に培養し、ＩＬ−２の存在 に関して調べた。

図１２はＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹへのヒトＩｇＨの直接結合研究の 結果のグラフ図である。

図１３はＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹに応答した好塩基性細胞からのヒ スタミン放出の結果のグラフ図である。

図１４は以下のペプチドのアミノ酸配列を示す：Ｆｅｌ　３３、Ｆｅ１３４、Ｆ ｅｌ　３５、Ｆｅｌ　３６、Ｆｅｌ　３７、Ｆｅｌ　３８、Ｆｅ１３８−１、Ｆ ｅｌ　３９及びＦｅ１３９．１゜図１５Ａ、Ｂ及びＣはＴＲＦＰに対して試験管 内で感作し、ＴＲＦＰに由来する種々のペプチドに対する応答をＩＬ−２生産及 びＩＬ−４生産の測定により分析した、患者＃６８８からのＴ細胞の応答を示す グラフ図である。

図１６ＡＳＢ及びＣはＴＲＦＰに対して試験管内で感作し、ＴＲＦＰに由来する 種々のペプチドに対する応答をＩＬ−２生産及びＩＬ−４生産の測定により分析 した、患者＃７３０からのＴ細胞の応答を示すグラフ図である。

図１７Ａ、Ｂ及びＣはＴＲＦＰに対して試験管内で感作し、ＴＲＦＰに由来する 種々のペプチドに対する応答をＩＬ−２生産及びＩＬ−４生産の測定により分析 した、患者＃７３８からのＴ細胞の応答を示すグラフ図である。

図１８Ａ、Ｂ及びＣはＴＲＦＰに対して試験管内で感作し、ＴＲＦＰに由来する 種々のペプチドに対する応答をＩＬ−２生産及びＩＬ−４生産の測定により分析 した、患者＃８０７からのＴ細胞の応答を示すグラフ図である。

図１９ＡＳＢ及びＣはＴＲＦＰに対して試験管内で感作し、ＴＲＦＰに由来する 種々のペプチドに対する応答をＩＬ−２生産及びＩＬ−４生産の測定により分析 した、患者＃６８８、＃７３０、＃７３８及び＃８０７からのＴ細胞の応答を示 すグラフ図である。

図２０はネコアレルギー患者＃６８８、＃７３０、＃７３８、及び＃８０７から のＴ細胞系がＴＲＦＰに由来する種々のペプチドに応答することによるＩＬ−２ 生産に対するＩＬ−４生産の比率を示すグラフである。

図２１は種々の抗原をネコアレルギー患者から得たヒト血漿と共にインキュベー トした直接ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。

図２２はネコアレルギー患者から得たヒト血漿を種々の抗原に予備吸着させ、続 いて新しい抗原を塗布したプレート上でインキュベートする枯渇（ｄｅｐ　Ｉ　 ｅ　ｔ　１ｏｎ）ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明はタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原のＴ細胞エピトープを少 なくとも１つ含むペプチドを皮下投与すると、その後アレルゲン又は他の抗原に 暴露された場合にＴ細胞耐性を生ずるという発見に基づ（。皮下投与又は他の投 与経路によりヒトなどの哺乳類に耐性を誘導するのに有用なペプチドは本発明の 範囲内である。そのようなペプチドにはそれぞれ図３に示すペプチドＸ（配列番 号＝７）、ペプチドＹ（配列番号二８）、ペプチドＺ（配列番号＝９）、ペプチ ドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列番号：１１）、ペプチドＣ（配列番 号：１２）、ペプチドＤ（配列番号＝１３）及びペプチドＥ（配列番号：１４） が含まれる。そのようなペプチドは可溶性の形態で投与されるのが好ましい。

一般に耐性化の方法で有用なペプチドは標準的Ｔ細胞生物学法（ｂｉｏｌｏｇｙ 　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により決定されるヒトＴ細胞刺激活性を有し、かくし て少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。必要なら、例えば微細マツピング 法により正確なＴ細胞エピトープを決定することができる。この方法は、標準的 Ｔ細胞生物学法により限定された少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むペプ チドを、ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端へのアミノ酸残基の付加又は 欠失により修飾することを含む。修飾の後、ペプチドを調べてＴ細胞反応性にお ける変化を決定する。タンパク質抗原から誘導された２つ又はそれ以上のペプチ ドがオーバーラツプ領域を共有し、両者ともヒトＴ細胞刺激活性（標準的Ｔ細胞 生物学法により決定）を有することが見いだされたら、そのようなペプチドの全 体又は一部を含む別のペプチドを生産することができ、これらの別のペプチドを 上記の微細マツピング法により調べることができる。微細マツピングの結果、Ｔ 細胞認識に必須のアミノ酸残基を含むタンパク質アレルゲン又は他の抗原に関す る１組のヒトＴ細胞エピトープを生産することができる。

タンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原のＴ細胞エピトープが未知である か、又は限定が不十分な場合（例えばタンパク質抗原中のヒトＴ細胞刺激活性を 有するペプチド領域の一部又は全部が標準的Ｔ細胞生物学法により限定されてい ないか、又はタンパク質抗原の正確なヒトＴ細胞エピトープが微細マツピング法 により限定されていない）、皮下耐性化の方法で有用なペプチドはアレルゲン又 は他の抗原の既知のタンパク質構造を精査し、アレルゲン又は抗原を所望の長さ の少なくとも２つのペプチド領域に理論的に分割することにより得ることができ る。例えばアレルゲン又は他の抗原のタンパク質配列を所望の長さの少なくとも ２つの非オーバーラツプペプチド領域に、又は所望の長さの少なくとも２つのオ ーバーラツプペプチド領域に系統的に分割することができる。

このペプチド領域への分割は任意であることができ、アルゴリズムに従って行う ことができ、あるいはタンパク質抗原中で少な（とも１つのＴ細胞エピトープを 含むことが知られている領域に全体的に、又は部分的に基づいていることができ る。

タンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原中で少なくとも１つのＴ細胞エピ トープを含む数個のペプチド領域のみが既知である場合、又はタンパク質アレル ゲン又は他のタンパク質抗原中のヒトＴ細胞刺激活性を有するすべての領域が未 知である場合、好ましくはタンノくり質アレルゲン又は他のタンパク質抗原の全 タンパク質配列の少なくとも５０％、より好ましくはタンパク質アレルゲン又は 他のタンパク質抗原の全タンパク質配列を１つ又はそれ以上のペプチドに分割す る。続いてペプチドを組み換えにより、又は合成により製造し、ペプチドのヒト Ｔ細胞を刺激する能力を決定することができる。タンパク質アレルゲンから誘導 したペプチドは、アレルゲンに関して特異的な免疫グロブリンＥにペプチドが結 合し、肥満細胞又は好塩基性細胞から媒介物（例えばヒスタミン）を放出させる か否かを決定するために調べることができる。免疫グロブリンＥに結合し、調べ たアレルギー血清の約１０〜１５％より多くの媒介物を肥満細胞又は好塩基性細 胞から放出させることが見いだされたペプチドは、本発明の方法で用いないのが 好ましい。

ミツバチ毒からの主要アレルゲンであるホスホリパ−ゼＡ２に由来するペプチド の構築は、タンパク質抗原のタンノ（り質構造が既知であるがＴ細胞エピトープ が未知であるか、又は限定が不十分な場合の例として用いることができる。ホス ホリパーゼＡ２はｃＤＮＡクローニングにより限定された１３４アミノ酸から成 る（Ｋｕｃｈｌｅｒ、に、ｅｔａｌ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８４：２ ４９−２５４）ｏこのアミノ酸配列は領域に分割することができ、それぞれ２０ 〜３５アミノ酸残基を含むのが好ましく、各領域は約１０アミノ酸が他の領域と オーバーラツプしているのが好ましい。タンパク質の全タンパク質配列を領域に 分割することができるが、患者に皮下投与するのに有用なペプチドの決定に用い られる配列全体は全タンパク質配列より実質的に短いことができる。構築された ペプチドにＴ細胞エピトープが含まれる可能性を最大にするために、オーバーラ ツプの範囲及び各領域の長さをアルゴリズムを用いて予測されるＴ細胞エピトー プの存在が保持されるように設計することができる（例えばＲｏｔｈｂａｒｄ、 Ｊ、ａｎｄ　Ｔａｙｌルゲン内のヒトＴ細胞エピトープは既知のＨＬＡクラス１ ■結合特異的アミノ酸残基を用いて推定できるのが好ましい。既知のタンパク質 構造を有するが、Ｔ細胞エピトープが限定されていない自己抗原、例えばグルタ ミン酸デカルボキンラーゼ（例えばＳａｍａｍａ、Ｊ、Ｐ、、ａｎ（Ｊｏｓｌｉ ｎ’　ｓ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　ＭｅｌｌｉＬｕｓ、１２ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ、Ｅ ｄｓ、Ａ、Ｍａｒｂｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌｅａ＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ、Ｐｈ１ｌ ａｄｅｌｐｈｉａ、ｐ、６７　（１９８５））などに由来するペプチドの構築及 び選択に類似の方法を用いることができる。

アレルゲン又は他の抗原に由来するペプチドを調べてＴ細胞刺激活性（すなわち 増殖、リンホカイン分泌及び／又はＴ細胞アネルギー／耐性化の誘導及びかくし て少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）を決定する。例えばヒトＴ細胞刺 激活性は、タンパク質アレルゲン又はタンパク質抗原に感受性の患者（すなわち タンパク質アレルゲン又はタンパク質抗原に対する免疫応答を有する患者）から 得たＴ細胞をタンパク質アレルゲン又は抗原から誘導したペプチドと共に培養し 、例えばトリチウム化チミジンの吸収により測定されるペプチドに応答したＴ細 胞による増殖の存在又は不在を決定することにより調べることができる。本発明 の方法で有用なペプチドに対するＴ細胞による応答に関する刺激指数は、ペプチ ドに応答した最大ＣＰＭを培地標準ＣＰＭで割った値として算出することができ る。例えばタンパク質アレルゲンから誘導したペプチドは約２．０の刺激指数を 有することができる。ペプチドを免疫療法薬として有用であると定義する目的の 場合、一般に少なくとも２．０の刺激指数が陽性であると考えられる。好ましい ペプチドの刺激指数は少なくとも２．５であり、少なくとも３．５がより好まし く、少なくとも５．０が最も好ましい。

さらにタンパク質アレルゲンから誘導した好ましいペプチドは免疫グロブリンＥ （ＩｇＥ）と結合しないか、又はＩｇＥに結合する程度がペプチドが由来するタ ンパク質アレルゲンのＩｇＥへの結合の程度より実質的に低い。標準的免疫療法 の主要な合併症はアナフィラキシ−などの全身性応答である。免疫グロブリンＥ は肥満細胞又は好塩基性細胞上のＩｇＥへの抗原の結合及び交差結合ならびに媒 介物（例えばヒスタミン、セロトニン、好酸球化学走性因子）の放出から生ずる アナフィラキシ−反応の媒介物である。か（してアナフィラキシ−は、ＩｇＥに 結合しないペプチドの使用により、又はペプチドがＩｇＥに結合する場合はその 結合が肥満細胞又は好塩基性細胞から媒介物（例えばヒスタミンなど）を放出さ せないことにより避けることができる。さらに最低のＩｇＥ刺激活性を有するペ プチドは治療効果に特に望ましい。最低のＩｇＥ刺激活性は全タンパク質アレル ゲンにより刺激されるＩｇＥ生産及び／又はＩＬ−４生産の量より少ないＴｇＥ 生産を言う。

本発明の方法で有用なペプチド、ならびにＴＲＦＰに由来する好ましいペプチド （例えばペプチドＸ１ペプチドＹなど）は、そのようなペプチドをコードするヌ クレオチド配列の発現に方向付けられた核酸ベクターで形質転換された宿主細胞 における組み換えＤＮＡ法により、あるいは化学合成により、あるいはある限ら れた場合にはタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原の化学的切断により 製造することができる。

組み換え法により製造する場合、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現 に方向付けられた核酸ベクターで形質転換した宿主細胞を細胞に適した培地で培 養する。ペプチドを分泌し、細胞及び細胞培養培地の混合物から収穫することが できる。別の場合ペプチドを細胞質に保持し、細胞を収穫し、ライシスを行い、 ペプチドを単離し、精製することができる。ペプチドはイオン交換クロマトグラ フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ならびにペプチド 、ペプチドが由来するタンパク質アレルゲン又は他の抗原あるいはそれらの一部 に関して特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製を含むペプチド又はタ ンパク質の精製に関して当該技術分野で既知の方法を用いて単離することができ る。本明細書に記載のいずれのペプチドも、組み換えＤＮＡ法により製造する場 合はペプチドが実質的に細胞材料又は培養培地を含まないように、あるいは化学 的に合成する場合又はタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原の化学的切 断により得る場合は実質的に化学的原料又は他の化学品を含まないように単離す る。

本発明の特徴の１つに従い、タンパク質アレルゲン又は他の抗原に由来するペプ チドをタンパク質アレルゲン又は抗原に感受性の哺乳類（ヒトなど）に好ましく は皮下により、その後アレルゲン又は他の抗原に暴露した時に哺乳類のＴ細胞応 答を低下させるような形態で投与する。本明細書で用いられるタンパク質アレル ゲン又は他の抗原に感受性の哺乳類のＴ細胞応答の低下又は変更は、標準的臨床 法により決定される哺乳類におけるアレルゲン又は他の抗原に対する症状の非応 答（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓ　１ｖｅｎｅｓｓ）又は減少として定義することが でき（例えばＶｅｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　ＭｅｄｉｃａｌＪ ｏｕｒｎａｌ　３０２：２６５−２６９　（１９９０）を参照）、アレルゲン誘 導喘息症状の減少を含む。本明細書で言うアレルゲンに対する症状の減少は、本 明細書に記載のペプチドを用いた処置法の後のヒトなどの哺乳類のアレルゲンに 対するアレルギ一応答のいずれの低下も含む。

この症状の減少はヒトにおいて自覚的に（例えば患者がアレルゲンに暴露された 時に、より楽に感じる）、又は標準的皮膚テストなどを用いて臨床的に決定する ことができる。

本明細書に記載の研究の結果、タンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原に 由来し、Ｔ細胞刺激活性を有する（すなわち少なくとも１つのＴ細胞エピトープ を有する）ペプチド、例えばフェリス　ドメスチクスに対する感受性の処置に用 いるための、ＴＲＦＰに由来する好ましいペプチド（すなわちペプチドＸ１ペプ チドＹ１ペプチドＺ１ペプチドＡ１ペプチドＢ１ペプチドＣ，ペプチドＤ１ペプ チドＥ）が製造された。Ｔ細胞エピトープはそれぞれアレルギー又は他の疾患の 臨床的症状に対応するタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原に対する免 疫応答の開始及び継続に含まれると思われる。これらのＴ細胞エピトープは抗原 提示細胞の表面上の適したＨＬＡ分子に結合し、関連するＴ細胞下部集団を刺激 することにより、Ｔヘルパー細胞のレベルで初期の現象を開始させると思われる 。これらの現象はＴ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所的炎症反応、その部位へ の別の免疫細胞の供給及び抗体の生産に導くＢ細胞カスケードの活性化を生ずる 。これらの抗体の１つのイソタイプであるＩｇＥはアレルギー症状の発現に基本 的に重要であり、その生産は分泌されるリンホカインの性質により、現象のカス ケードの初期にＴヘルパー細胞のレベルで影響を受ける。Ｔ細胞エピトープはＴ 細胞レセプターによる認識の基本的要素又は最小単位であり、エピトープはレセ プター認識に必須のアミノ酸を含み、タンパク質のアミノ酸配列中で連続的及び ／又は非連続的であることができる。本明細書で用いられるＴ細胞エピトープは 少なくとも２．０、より好ましくは少なくとも２．５、さらに好ましくは少なく とも３５、最も好ましくは少なくとも５．０の刺激指数を有する。

本発明の方法に従い、本明細書に記載のペプチドをヒトなどの哺乳類に皮下投与 すると適したＴ細胞下部集団を耐性化又はアレルギー症し、それらはタンパク質 アレルゲン又は他の抗原に対して非応答性となり、タンパク質アレルゲン又は他 の抗原に暴露された時の免疫応答の刺激に関与しない（例Ａを参照）。さらにそ のようなペプチドの投与により、天然に存在するタンパク質アレルゲン又はその 一部に暴露した場合と比較してリンホカイン分泌プロファイルが変更される（例 えばＩＬ−４の減少及び／又はＩＬ−２の増加を生ずる）。さらにペプチドへの 暴露は、通常アレルゲンへの応答に関与するＴ細胞下部集団に影響することがで き、これらのＴ細胞が通常のアレルゲンへの暴露の部位から（例えば鼻粘膜、皮 膚及び肺）ペプチドの治療的投与の部位に引っ張られる。このＴ細胞下部集団の 再分布は、患者の免疫系がアレルゲンへの通常の暴露の部位における通常の免疫 応答を刺激する可能性を改善又は減少させ、アレルギー症状を減少させる。

耐性化に有用なペプチドは所望される限り多くのアミノ酸残基を含むことができ 、好ましくはタンパク質アレルゲン又は他のタンパク質抗原の少なくとも約７、 より好ましくは少なくとも約１５、さらに好ましくは少なくとも約２０、最も好 ましくは少な（とも約２５のアミノ酸残基を含む。ペプチドの長さが増すとペプ チド合成が困難になり、ペプチドとそれが由来するタンパク質アレルゲン又は他 のタンパク質抗原の間の構造的類似性が維持されるために望ましくない性質（例 えば免疫グロブリン結合又は酵素活性）が保持され得るので、約２０〜４０アミ ノ酸残基のペプチド長が好ましい。必要なら１つ又はそれ以上のペプチドのアミ ノ酸配列を製造し、リンカ−により連結して抗原提示細胞によるプロセシングに 対する感受性を向上させることができる。そのようなリンカ−はいずれの非−エ ピトープアミノ酸配列又は他の適した結合又は連結剤であることもできる。

ペプチドがタンパク質アレルゲンに感受性の患者を皮下投与により耐性化するた めに用いられる場合、ペプチドは以下の属のタンパク質アレルゲンから誘導する のが好ましい、デルマトファゴイデス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）属 、フエリス属、アンプロシア（Ａｍｂｒ。

土工り属、ロリウム（Ｌｏｌ　ｉ　ｕｍ）属、クリプトメリア（Ｃｒ　ｙ　ｐｔ 　ｏｍｅ　ｒ　ｉ　ａ）属、アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、アル デル（Ａｌｄｅｒ）属、ベック（Ｂｅｔｕｌａ）属、オウエルクス（９ｕｅｒｃ ｕｓ）属、オレア（Ｏｌｅａ）属、アルテミシア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）属、プ ランタゴ（Ｐｌａｎｔａｇｏ）Ｉｉｉ、パリエタリア（旦ａｒｉｅｔａｒｉａ） 属、カニメ（Ｃａｎｉｓ）属、ブラテラ（旦上且ｔｔｅｌｌａ）属、アピス（Ａ ｐｉｓ）属及びペリブラネタ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）属。例えば皮下耐性化 に有用なペプチドを以下のアレルゲンを含む既知の又は未知のタンパク質アレル ゲンから誘導することができる：デルマトファゴイデス　ブテロミシヌス（Ｄｅ ｒｍａｔｏｐｌ、１．Ａｍｂ　ａ　１．　２．Ａｍｂ　ａ　１．　３．Ａｍｂ　 ａ　Ｉ。

４、Ａｍｂ　ａ　ＩＩ）、クリプトメリア　ジャポニス（Ｃｒｙｐｔ。

ｍｅｒｉａ　ｊａｐｏｎｉｓ）（例えばＣｒｙ　ｊ　Ｉ、Ｃｒｙ　ｊｌｌ）、ロ リウム　ペレネ（Ｌｏｔ　ｉｕｍ　ｐｅｒｅｎｎｅ）（例えばＬｏｌ　ｐ　Ｉ、 Ｌｏｌ　ｐ　ＩＸ）、フェツス　ドメスチクス（例えばＦｅｌ　ｄ　Ｉ）及びカ ニメ　フ７ミリアリス（Ｃａｎｉｓ　ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（例えばＣａｎ　 ｆ　Ｉ、Ｃａｎ　ｆ　ＩＩ）ｏタンパク質アレルゲンの少なくとも１つのエピト ープを含むペプチドは以下の出願に記載されており、その記載事項は引用するこ とにより本明細書の内容となる：１９９２年４月９日出願のゴ　Ｃｅ１ｌ　Ｅｐ ｉｔ。

ｐｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ　ｆｒｏｍＡｍｂｒｏ ｓｉａ　Ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ”の標題のＵ、Ｓ。

Ｓ、Ｎ、８６６．６７９、及び１９９２年１０月１６日出願の“ＴＣｅｌｌ　Ｅ ｐｉｔｏｐｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｄｅ ｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ　（Ｈｏｕｓｅ　Ｄｕｓｔ　Ｍｉｔｅ）”の標題 のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、９６３．　３８１゜フェツス　ドメスチクスへの感受性の処 置に特に適したペプチドはフエリス属から誘導され、以下：ＴＲＦＰのペプチド Ｘ（配列番号ニア）、ペプチドＹ（配列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号：９ ）、ペプチドＡ（配列番号：１０ＬペプチドＢ（配列番号：１１）、ペプチドＣ （配列番号：１２）、ペプチドＤ（配列番号＝１３）及びペプチドＥ（配列番号 ＝１４）及びこれらの修飾体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）が含まれ、各ペプ チドのアミノ酸配列は図３に示されている。これらのＴＲＦＰからの好ましいペ プチドは図１及び２に示されているＴＲＦＰの核酸配列及びアミノ酸配列（配列 番号＝１〜６）に基づき、本明細書に記載の通り組み換え法により、又は化学合 成により製造することができる。

そのようなペプチドはフェツス　ドメスチクスへの感受性の処置のために治療用 組成物の形態で投与することができる。かくしてペプチドＸ、Ｙ、ＺｌＡ、ＢＳ Ｃ，Ｄ及びＥの１つ又はそれ以上を、フェツス　ドメスチクスへの感受性に関し て処置するべき患者に同時又は順次投与するための単一の組成物又は１つ又はそ れ以上の個別の組成物として合わせることができる。そのような組成物は耐性化 に適した形態で皮下により、又はこれらに限られるわけではないが静脈内及び腹 膜内を含む他の方法により投与することができる。ペプチドは可溶性の形態で投 与するのが好ましい。

抗原特異的免疫応答の変更が望ましい場合、タンパク質アレルゲン以外のタンパ ク質抗原から皮下耐性化に有用な別のペプチドを誘導することができる。例えば 自己免疫疾患の発病に含まれる既知の自己抗原を調べ、ヒトＴ細胞刺激活性を有 するペプチド又は既知のＴ細胞エピトープを有するペプチドを同定することがで きる。１つ又はそれ以上のそのようなペプチドを自己免疫疾患に罹った、又は自 己免疫疾患を現す危険にあるヒトなどの哺乳類に皮下投与し、自己抗原に対する 抗体応答を低下させ、効率を妨げ、及び／又は免疫複合体関連副作用を減少させ ることができる。自己抗原のＴ細胞反応性を保持するために、ヒトＴ細胞刺激活 性を有する自己抗原のペプチドを標準的Ｔ細胞生物学法により限定するか、又は 必要なら正確なＴ細胞エピトープを上記の微細マツピング法により限定すること ができる。

Ｔ細胞を刺激し、自己抗原に伴う望ましくない性質を持たない（例えば自己抗原 に感受性の患者の実質的パーセンテージにおいて自己抗体と結合しない）ペプチ ドを、患者を自己抗原に対して耐性化するための免疫療法薬として用いるために 選択することができる。ペプチドは治療用組成物の形態で、アジュバントの不在 下の生理学的に許容し得るビヒクル中で皮下により与えられ、ペプチドがそれが 由来する自己抗原に対する抗原特異的耐性を誘導し、損傷を与える可能性のある 免疫応答を調節することを可能にする。ペプチドの製造に有用な自己抗原の中に 、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６４１０、ＰＭ−１（６９Ｋ Ｄ自己抗原）及び糖尿病におけるカルボキシペプチダーゼ、多発性硬化症におけ るミニリン塩基性タンパク質、胎児赤芽球症におけるｒｈ因子、重症筋無力症に おけるアセチルコリンレセプター、グレージス病における甲状腺レセプター、グ ツドバスチャー症候群における基底膜タンパク質、及び甲状腺炎における甲状腺 タンパク質がある。例えばヒトＴ細胞刺激活性を有するミニリン塩基性タンパク 質（ＭＢＰ）の既知の領域は、ヒトＭＢＰのアミノ酸残基８４−１０６の全体又 は一部（好ましくはアミノ酸残基８４−１０２、より好ましくはアミノ酸残基８ ９−１０１）を含む領域、及びアミノ酸残基１４０−１７２　（好ましくはヒト ＭＢＰのアミノ酸残基１４３−１６８）の全体又は一部を含む領域を含む。これ らの領域のそれぞれを含む１つ又はそれ以上のペプチドを製造し、皮下投与して 患者における多発性硬化症を処置することができる。

ヒトなどの哺乳類のタンパク質アレルゲンに対する（ＴＲＦＰに由来する好まし いペプチドｘ、ｙ、ｚなどを含む）又は他のタンパク質抗原に対する感受性を処 置する方法で有用なペプチドは、治療用組成物の形態である。そのような組成物 はペプチド及び製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を含む。タンパク質アレル ゲン又は他のタンパク質抗原に対して患者を脱感作又は耐性化するための本発明 の治療用組成物の投与は、タンパク質アレルゲン又は池のタンパク質抗原に対す る患者の感受性を低下させる（すなわちアレルギ一応答を減少させる）のに有効 な方法を用い、有効な投薬量で、及び有効な期間行うことができる。治療用組成 物の有効量はアレルゲン又は他の抗原に対する患者の感受性の程度、年令、性別 及び患者の体重、ならびに患者における抗原応答を引き出すペプチドの能力など の因子に従って変化する。投薬法は最適の治療応答を与えるように調節すること ができる。例えば数回に分けた投薬量を毎日投薬することができ、あるいは治療 事情に示される通りに相応させて投薬量を減少させることができる。

フェリス　ドメスチクスに対する感受性の処置に用いられるＴＲＦＰに由来する ペプチド（例えばペプチドＸ、ペプチドＹなど）は、注射（皮下、静脈内など） 、経口投与、吸入、経皮適用又は直腸内投与などにより簡便な方法で投与するこ とができる。投与経路に依存して活性化合物は、酵素、酸及び化合物を不活化し 得る他の自然の条件がら化合物を保護するための材料で被覆することができる。

非経口的投与以外により本発明のペプチドを投与するために、その不活化を予防 する材料でペプチドを被覆するが、又はタンパク質又はペプチドをそのような材 料と同時投与することが必要である。例えばペプチドは適した希釈剤又はアジュ バント中で患者に投与することができ、酵素阻害剤と同時投与することができ、 あるいはリポソームなどの適した担体中で投与することができる。製薬学的に許 容し得る希釈剤には食塩水及び緩衝水溶液が含まれる。アジュバントはその最も 広い意味で用いラレ、インターフェロンなどのいずれの免疫刺激化合物も含まれ る。本明細書で意図されているアジュバントにはレゾルシノール、非イオン性界 面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−へ千すデシルポ リエチレンエーテルが含まれる。酵素阻害剤には膵臓トリプシン阻害剤、ジイソ プロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）及びトラシロールが含まれる。リポソ ームには水中油中水型ＣＧＦ乳液ならびに従来のリポソームが含まれる（Ｓｔｒ ｅｊａｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８４）Ｊ、Ｎｅｕｒｏｊｍｍｕｎｏｌ、ユニ２ ７）−Ｔ細胞アネルギーを誘導する目的の場合、治療用組成物は非免疫原性の形 態で、例えばアジュバントを含まない形態で投与するのが好ましい。

活性化合物は非経口的又は腹膜内にも投与することができる。分散液はグリセロ ール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物ならびに油中で調製する こともできる。通常の保存及び使用条件下でこれらの調剤は微生物の成長を予防 するための防腐剤を含むことができる。

注射用途に適した製薬学的組成物には無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、 及び無菌注射溶液又は分散液の即席調製のための無菌粉末が含まれる。すべての 場合に組成物は無菌でなければならず、注射が容易な程度に流動性でなければな らない。製造及び保存の条件下で安定でなければならず、バクテリア及び菌・カ ビなどの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は溶媒 又は分散媒体であることができ、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグ リセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、適 したそれらの混合物、ならびに植物油が含まれる。適した流動性は、例えばリン チンなどの皮膜を用いることにより、分散液の場合は必要な粒径の保持により、 及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、種 々の抗微生物剤及び殺菌・カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノ ール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合 等調剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化 ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。吸収を遅延させる試薬、例えばモノ ステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを組成物中に含むことにより、注射 用組成物の長期間の吸収をもたらすことができる。

無菌の注射溶液は上記で挙げた成分の必要な１つ又は組み合わせと共に適した溶 媒中に必要な量の活性化合物を挿入し、続いて滅菌濾過することにより調製する ことができる。一般に分散液は、塩基性分散媒体及び上記で挙げた中からの他の 必要成分を含む無菌のビヒクル中に活性化合物を挿入することにより調製する。

無菌の注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製のための好ましい方法は真 空乾燥及び凍結乾燥であり、それによりあらかじめ滅菌濾過された溶液から活性 成分（すなわち本発明のペプチド）と他の必要成分の粉末が与えられる。

本明細書に記載のＴＲＦＰに由来する好ましいペプチドが上記の通り適した保護 を与えられている場合、ペプチドは例えば不活性希釈剤又は同化性食用担体を用 いて経口投与することができる。ペプチド及び他の成分は硬質又は軟質殻ゼラチ ンカプセル中に封入し、錠剤に圧縮するか、又は患者の食事に直接挿入すること もできる。治療的経口投与の場合、活性化合物は賦形剤と合わせ、摂取可能な錠 剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキサ−１懸濁液、シロップ、ウェ ハースなどの形態で用いることができる。そのような組成物及び調剤は少な（と も１重量％の活性化合物を含まなければならない。組成物及び調剤のパーセンテ ージはもちろん変化させることができ、簡便に単位の重量の約５〜約８０％であ ることができる。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適し た投薬量が得られる量である。本発明に従う好ましい組成物又は調剤は、経口投 薬単位が約１０μｇ〜約２００ｍｇの活性化合物を含むように調製される。

本明細書で用いられる“製薬学的に許容し得る担体”にはすべての溶媒、分散媒 体、皮膜、抗バクテリア剤及び殺菌・殺カビ剤、等調剤及び吸収遅延剤などが含 まれる。製薬学的活性物質のためのそのような媒体及び試薬の利用は当該技術分 野で周知である。従来の媒体又は試薬が活性化合物と不適合性でない限り、治療 用組成物におけるその利用が意図される。補足的な活性化合物も組成物中に挿入 することができる。

非経口的組成物を投薬単位形態で調製するのは、投与の容易さ及び投薬量の均一 性のために特に有利である。本明細書で用いられる投薬単位形態は、処置するべ き哺乳類患者のための単位投薬量として適した物理的に分離した単位を言い、各 単位は所望の治療効果を与えるために算出されたあらかじめ決められた量の活性 化合物を必要な製薬学的担体と共に含む。本発明の投薬単位形態に関する詳細（ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、（ａ）活性化合物の独特の特性及び達成する べき特定の治療効果、ならびに（ｂ）患者における感受性の処置のためにそのよ うな活性化合物を配合する技術分野に固有の制限により指示され、直接依存して いる。

本発明の治療用組成物は、ペプチドが由来するアレルゲン又は他のタンパク質抗 原に感受性のヒトなどの哺乳類に、アレルゲン又は他の抗原に対する哺乳類の感 受性を低下させるのに有効な投薬量で、及び有効な期間で皮下投与することがで きる。例えば患者のＴ細胞を耐性化するのに有効な量の１つ又はそれ以上の同− 又は異なる治療用組成物を同時に、又は順次に皮下投与する。少なくとも２つの ペプチドを含む組成物（例えば少なくとも２つのペプチドの物理的混合物）も皮 下耐性化の方法で用いることができる。

溶解度の向上、治療又は予防効果の強化又は安定性（例えば生体外における保存 寿命、及び生体内におけるタンパク質分解に対する抵抗性）の目的のために、本 発明の方法で有用なペプチドの構造を修飾することもできる。アミノ酸配列が、 免疫原性の改変及び／又はアレルゲン性の低下のために例えばアミノ酸置換、欠 失、又は付加により変更された、あるいは同目的のために成分が付加された修飾 ペプチドを製造することができる。例えばＴ細胞エピトープ機能に必須のアミノ 酸残基を既知の方法（例えば各残基の置換及びＴ細胞反応性の存在又は不在の決 定）を用いて決定することができる。必須であることが示された残基を修飾する （例えばその存在がＴ細胞反応性を強化することが示された他のアミノ酸により 置換する）ことができ、又Ｔ細胞反応性に必要でない残基を修飾することもでき る（例えばその挿入によりＴ細胞反応性が強化されるが関連ＭＨＣへの結合を減 少させない他のアミノ酸により置換することにより）。ペプチドの修飾の他の例 は、ジスルフィド結合を介した２量化を最小にするための好ましくはアラニンに よる、又はグルタミン酸、あるいは別の場合セリン又はトレオニンによるシステ ィン残基の置換である。

安定性及び／又は反応性を増すためにペプチドを修飾し、自然の対立遺伝子変化 から生ずるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列における１つかそれ以上のタン パク質多型性を挿入することができる。さらにＤ−アミノ酸、非天然アミノ酸又 は非アミノ酸類似体を置換又は付加して本発明の範囲内の修飾ペプチドを製造す ることができる。さらにＡ、５ｅｈｏｎ及び共同研究者のポリエチレングリコー ル（ＰＥＧ）法（Ｗｉｅｅｔ　ａｌ、同上）を用いてペプチドを修飾し、ＰＥＧ と共役したペプチドを製造することができる。ペプチドの修飾には還元／アルキ ル化Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ１１ｆｔｏｎ、ＮＪ、ｐｐ１５５−１９４　 （１９８６））　、アシル化（Ｔａｒｒ、同上）、エステル化（Ｔａｒｒ、同上 ）、適した担体への化学的カップリング（Ｍｉｓｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｓｈｉｉｇ ｉ、ｅｄｓ、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＷＨＦｒｅｅｍａｎ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９８０）；米国特許第４．９３９．２３ ９号明細書）又は緩（ｍｉｌｄ）ホルマリン処理（Ｍａｒｓｈ−２１５（１９７ １））も含まれる。

精製を容易にし、おそらくペプチドの溶解度を向上させるために、ペプチド主鎖 にリポータ−基を付加することができる。例えばポリヒスチジンをペプチドに付 加し、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー上でペプチドを精製す ることができる（Ｈｏｃｈｕｌｉ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ、旦：１３２１−１２３５（１９８８））。さらに必要ならリポータ−基 とペプチドのアミノ酸配列の間に特異的なエンドプロテアーゼ切断部位を導入し 、無関係の配列を含まないペプチドの単離を容易にすることができる。患者のタ ンパク質抗原に対する脱感作に成功するために、ペプチドに官能基を付加するこ とにより、あるいは疎水性Ｔ細胞エピトープ又はペプチド中の疎水性エピトープ を含む領域を含まないことにより、ペプチドの溶解度を向上させることが必要で あり得る。

おそらくペプチド内のＴ細胞エピトープの適した抗原プロセシングを助けるため に、それぞれＴ細胞エピトープを少なくとも１つ含む領域の間に規定プロテアー ゼ感受性部位を組み換えにより、又は合成により工作することができる。例えば ＫＫ又はＲＲなどの帯電アミノ酸対をペプチドの組み換え構築の際にペプチド内 の領域の間に導入することができる。得られるペプチドをカテプシン及び／又は 他のトリプシン一様酵素切断に対して感受性とし、１つ又はそれ以上のＴ細胞エ ピトープを含むペプチドの部分を生成することができる。さらにそのような帯電 アミノ酸残基はペプチドの溶解度を向上させる。

ペプチドをコードするＤＮＡの特定部位の突然変異誘発を用い、ペプチドの構造 を変更することができる。そのような方法はＰＣＲ（Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、ヱユ：　５１−５９　（１９８９）　）又は突然変０ ６３　（１９８９）’Ｉを含むことができる。バクテリア発現を強化するために 、前記の方法を他の方法と結合させて用い、ペプチドをコードするＤＮＡ構築物 における真核コドンをＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）で優先的に用いられるコドンに 変えることができる。

本発明の他の特徴は、Ｔ細胞刺激活性を有することが示され、がくしで少なくと も１つのＴ細胞エピトープを含み、患者に治療用組成物の形態で投与してフエリ ス　ドメスチクスのアレルゲンに対する患者の応答を低下させることができるペ プチドを与える。そのような治療用組成物はそのようなペプチドを１つ又はそれ 以上含むことができる。好ましい組成物はペプチドＸ（ＴＲＦＰの鎖１からのア ミノ酸残基７−３０、Ｆｅｌ　８−３とも呼ばれ、図３に示されている）、ペプ チドＹ（ＴＲＦＰの鎮１からのアミノ酸残基２９−５５、Ｆｅ１３０−４とも呼 ばれ、図３に示されている）、ペプチドＺ　（ＴＲＦＰのｌ１ｉ２からのアミノ 酸残基１４−３９、Ｆｅ１３２−２とも呼ばれ、図３に示されている）、ペプチ ドＡ　（ＴＲＦＰの鎖１からのアミノ酸残基５１−６９であり、図３に示されて いる）、ペプチドＢ　（ＴＲＦＰの鎖２からのアミノ酸残基７４−９２、Ｆｅｌ 　２９とも呼ばれ、図３に示されている）、ペプチドＣ（ＴＲＦＰ（７）鎖１か らのアミノ酸残基５１−６６、Ｆｅｌ　２３とも呼ばれ、図３に示されている） 、ペプチドＤ（ＴＲＦＰの鎖１からのアミノ酸残基５６−６９、Ｆｅｌ　２１の 修飾形態であり、図３に示されている）、及びペプチドＥ　（ＴＲＦＰの鎮１か らのアミノ酸残基５〇−６９であり、図３に示されている）から成る群より選ば れる少なくとも１つのペプチドを含む。

例Ａで詳細に記載する通り、ペプチドＸ又はペプチドＹを別々に、又は組み合わ せて皮下又は静脈投与することにより、マウスにおいてＴ細胞耐性が誘導された 。マウスの耐性化はペプチド特異的ＩＬ−２生産、Ｉ　Ｌ−４生産及び抗体生産 の減少により証明された。ＩｇＥ生産、Ｂ細胞に関するＴ細胞ヘルパー及びＩＬ −４生産を伴うと思われるＴ細胞活性の低下が示された。さらにＴＲＦＰの組み 換え鎖１に特異的なＴ細胞がペプチドＸ及びペプチドＹの投与により耐性化した 。

他の組の実験において、（１）ＭＢＰを用いた免疫化の前にＭＢＰからの２つの 免疫優性Ｔ細胞決定基（すなわちａ、ａ、残基３５−４７及びＡｃ１−１１）の １つ又は組み合わせを投与することにより、及び（２）マウスにおける実験的ア レルギー性脳を髄炎（ＥＡＥ）の誘導の後に免疫優性Ｔ細胞決定基の１つ又は組 み合わせを投与することにより、マウスにおけるミニリン塩基性タンパク質（Ｍ ＢＰ）に対するＴ細胞耐性が誘導された。ＭＢＰを用いた攻撃の前の耐性誘導は 、ＭＰＢ免疫化の後の重症の疾患の発現を阻止した。ＭＢＰで免疫化した後１０ 日で疾患が始まったマウスを”耐性化”すると疾患の進行が阻止され、進行中の 疾患の重度が軽減した。

本発明はさらにタンパク質抗原（例えばアレルゲン、自己抗原など）に対する免 疫応答を含む疾患の処置において有用な少なくとも１つの治療用組成物を含み、 その組成物はタンパク質抗原に感受性の患者の集団の実質的パーセンテージにお いてそのような患者のタンパク質抗原に対する応答が実質的に減少するのに十分 なパーセンテージのタンパク質抗原のＴ細胞エピトープを有するペプチドを少な くとも１つ含み、但しその少な（とも１つのペプチドは全タンパク質抗原を含ま ない。

制限ではない以下の実施例により本発明をさらに例示する。

以下の実験のそれぞれにおいてタンパク質及びペプチドは以下の要領で製造した 。Ｆｅｌ　ｄ　Ｔの鎖１（本明細書でヒトＴ細胞反応性ネコタンパク質（ＴＲＦ Ｐ）鎖１と呼ぶ）（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ、Ｊ。

た１組のペプチドを、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ 化学を用いて合成した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製し、アミノ酸分析に より調べた。凍結乾燥したペプチドをＰＢＳ中に再懸濁し、ガンマ線（１０，０ ００ラド）により、又は領　２μフイルターの通過により滅菌した。

領で室内塵の抽出物から精製した。簡単に記載すると、室内Ｉ！（多数のネコを 飼っている家庭で用いた真空容器（ｖａｃｕｕｍ　Ｃ０ｎｔａｉｎｅｒＳ）から ）をＰＢＳで抽出し、続いて凍結乾燥し、水に再溶解した。抽出物を抗−ＴＲＦ Ｐモノクローナル抗体（ハイブリドーマ６Ｆ９及びＩＯ２は両者共Ｍ、Ｃｈａｐ ｍａｎの提供）を共役させたカラムに適用した。ＴＲＦＰを１００ｍＭのグリシ ン、ｐＨ２，５を用いてカラｕｍ−Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ（１ ９９２）。

ＣＲＣ−Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、（印刷中））に記載の要領で組み換えＴＲＦＰ鎖 １を発現し、精製した。ＴＲＦＰ鎖１は約９６％の純度であり、トロンビン切断 認識部位からアミノ酸グリシン及びセリン、ならびに７０アミノ酸の完全ＴＲＦ Ｐ鎖１配列が続くＮ末端を含む（Ｏｈｍａｎ。

Ｊ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９７４）１１３：１６６８− １６７７）。

皮下投与されたペプチドがＴ細胞応答に影響する能力を評価するために、５匹の ８６ＣＢＡＰＩマウスの２つのグループ（令一致Ｂ　６　Ｄ　２　Ｆ　＋ＭＥ） ６〜１０週令の雌のマウス）をＰＢＳ中のペプチドＹ又はＰＢＳのみのいずれか の皮下注射により処置した。Ｂ６ＣＢＡＦ、マウスはペプチドＹに対するその強 いＴ細胞応答の故に選んだ。続いてマウスをＣＦＡ中のペプチドＹで攻撃した。

攻撃の１０日後にペプチド特異的Ｔ細胞応答を、ペプチドＹ−特異的ＩＬ−２、 ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ生産により測定した。表１に示す通り、ペプチド耐性化 動物からの細胞において、調べたサイトカインすべてのリンパ節又は膵臓細胞に よるペプチドＹ特異的生産が減少した。それぞれのサイトカインアッセイにおい て、ペプチドＹを含まない培養における両グループの動物からの細胞を用い、類 似の低いバックグラウンドがあったことに注意されたい。この実験は、細胞が特 異的にサイトカインを生産できないことから示される通り、ペプチド皮下注射が ペプチド特異的Ｔ細胞耐性を誘導できることを示す。

ＩＬ−４の生産はペプチド−耐性動物からの培養物において減少したことに注意 されたい。さらに抗原−特異的Ｔ細胞増殖がペプチド−耐性動物において減少し た。

表１．ペプチドの皮下注射による耐性化はそのペプチドへのＴ細胞応答を減少さ せるＰＢＳ　’）ンハＤ　１５０　４９．８６（６，４６）ｉ　２．８２（０， ２９）　１．２０（０，０２）０　２．６１（０，９８）　０．５６（０，０３ ）　０．０６（０，０１）膵臓　１５０　３１．６２（４，５４）　１３．３１ （２，９６）　１．１４（０，０１）０　２．７２（０，８５）　１．１７（０ ，１４）　０．０６（０，０１）Ｉ　ＰＣ−２リンパ節　１５０　６．８２（０ ，６４）　１．０４（０，０８）　０．２６（０，１１）０　２６０（０，７４ ）　０．３９（０，０３）　０．０８（０，０１）膵臓　１５０　４．５３（０ ，３２）　１．０９（０，２０）　０．０９（０，０１）０　１．６０（０，７ ０）　１．０９（０，１１）　０．０７（０，０１）＊５匹の本来（７）Ｂ６Ｃ ＢＡＦ、マウスをＰＢＳ中ｃｖ　Ｉ　Ｐｃ−２ヘフ−１−Ｆ又はＰＢＳのみのい ずれかの皮下投与により耐性化した。続いてそれらをＩＰＣ−２で攻撃した。

↑化膿している（ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節及び膵臓を取り出して集め、細胞 を示されているＩＰＣ−２と共に培養した。上澄み液をサイトカイン生産に関し て分析した。

工各数は３重の培養からの値の算術平均プラスマイナス括弧内のＳＥＭ５匹のＢ ＤＰＩ　（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　ｘ　ＤＢＡ／２Ｊ）７ウス（雌、６〜８週令）の ５グーブに、皮下により前肢の間の１カ所の背部位に、又は尾静脈の１つを介し て静脈内に注射した。各注射部位に関し、０日及び５日で、１つのグループの動 物にホスフェート緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中３００μｇのペプチドＹを注射し 、他の動物にＰＢＳのみを注射した。

１０日に、各動物を２００μｌの完全フロインドアジュバント（ＣＦ　Ａ）中１ ００μｇのペプチドＹで、尾の根元の２つの皮下部位及びももの上の２つの皮下 部位の４部位において攻撃した。２０日に頚部脱臼により動物を犠牲にし、鼠径 節及び膝窩節を取り出し、１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む濯ぎ緩衝液であ る冷ＲＰＭ１１６４０中に入れた。節を濯ぎ緩衝液で濯ぎ、ガラス乳棒を用いて 微細ステンレススチールメツシュに通し、それを濯ぎ緩衝液に腎濁した。懸濁し た細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠心することにより２回濯ぎ、濯ぎ緩衝液で 再懸濁した。各動物からの懸濁細胞のアリコートをＣａｕｌｔｅｒカウンターモ デルＺＢ上でカウントした。

細胞（４ｘ　１０’／ｍ　＋　）を培地（１０％　ＦＢＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタ ミン、５０Ｕ／ｍｌ　ペニシリン、５０μｇ／ｍ＋　ストレプトマイノン、及び ５ｘｌＯ−５Ｍ　２−メルカプトエタノール）中で１５０μｇ／ｍｌのペプチド Ｙ（図４）と共に、又は単独でインキュベートした。

０．２ｍｌの培養を平底９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）中の３７℃及び５ ％　ＣＯ２において３重に行った。２４時間後、各ウェルからの５０μｌの培地 を別々の丸底９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ）に入れ、−２０℃で終夜凍結 して生細胞のキャリオーバー（ｃａｒｒｙ。

ｖｅｒ）を除去した。解凍後、上澄み液をＩＬ−２依存性Ｔ細胞クローンである ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣＴＩＢ＃２１４）の成長を支持するその能力に関して調 べた。対数期成長におけるＣＴＬＬ−２を１００゜ｒｐｍで１０分間遠心し、培 地を吸引し、ペレットを培地で再懸濁することにより２回濯いだ。ＣＴＬＬを温 培養上澄み液に加え（５ｘ　１０３ＣＴＬＬ細胞／ウエル）、ＩＬ−２アツセイ を３７°Ｃ及び５％ＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、１μＣｉ／ｍｌ の３Ｈ−チミジンを５０μｌ／ウエルで加え、ＣＴＬＬ細胞をさらに４〜６時間 インキユベートシ、続いてそれをＴｏｍ　Ｔｅｃの９６ウ工ル細胞収穫機を用い て収穫した。各ウェルにおける３Ｈ−挿入をＢｅｔａｐｌａｅモデル１２０５シ ンチレーションカウンターによりカウントした。バックグラウンドカウントは引 き去らなかった。

図４における６棒は１匹のマウスからの３重の生体内培養物の算術平均を示す。

ＣＦＡ中のペプチドＹを用いた生体内攻撃の後、いずれかの経路により食塩水を 投与されたマウスからのリンパ節細胞は、ＩＬ−２生産により示される通り（白 棒）試験管内のペプチドＹによる攻撃に特異的に応答した。対照的に静脈内及び 皮下によりペプチドＹを投与されたマウスから単離した化膿しているリンパ節細 胞は生体内におけるペプチドＹを用いた攻撃の後、特異的ＩＬ−２分泌の減少を 示した（黒棒）。

この実験の結果はペプチドＹの皮下及び静脈内投与が、ＩＬ−２の抗原特異的生 産における減少に示される通りＴ細胞耐性を生ずることを示し別の実験において 、ＢＤＦ、マウスをペプチドを用いた攻撃の前に種々の投薬量のペプチドＸ及び ペプチドＹで耐性化し、耐性の誘導に必要な最低の投薬量を決定した。それぞれ ３匹のＢＤＦ、マウスを含む７グループのマウスに０〜５００μｇ／ｍｌのペプ チドＹ（図５）又はペプチドＸ（図６）を含む０．２ｍｌのＰＢＳを皮下注射し た。各グループの動物は０日及び５日の両日に前肢の間の皮下の１カ所の背部位 で注射した。１０日にすべての動物に上記の通り２００μｍのＣＦＡ中の１００ μｇのペプチドＹ又はペプチドＸの攻撃注射を与えた。２０日に動物　゛を犠牲 にし、上記の通り化膿しているリンパ節を取り出した。リンパ節細胞を上記の通 り懸濁し、濯ぎ、適宜１５０μｇ／ｍｌのペプチドＹ又はペプチドＸと共に、又 は含まずに培養した。培養からの上澄み液を上記の通りＩＬ−２に関して検定し た。

図５及び６の各棒は３匹のマウスから集めたリンパ節細胞の３重の培養の平均を 示す。ＩＬ−２アツセイに関する標準培養（すなわちペプチドＸ又はペプチドＹ を含まずに培養した細胞）の場合のベースラインは約１５００ｃｐｍ（図１５） 及び約３００ｃｐｍ　（図６）であった。ペプチド特異的Ｉ　Ｌ−２生産を完全 に減少させるのに必要な注射当たりのペプチドの投薬量は２回の注射（０日及び ５日）を用いたこれらの実験の場合４〜２０μｇ／投薬である。結果はＢＤＦ、 株マウスを少量のペプチドＸ又はペプチドＹを用いてＴ細胞レベルで耐性化でき ることを示ペプチドＸ及びペプチドＹが組み合わせて注射された場合に耐性を誘 導できるか否かを決定するために、２つのペプチドの混合物を用いてＢ６ＣＢＡ Ｆ、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　ｘ　ＣＢＡ／Ｊ）を耐性化し、攻撃した。Ｂ５ ＣＢＡＦ、マウスは、いずれかのペプチドの攻撃を受けたマウスから単離したリ ンパ節細胞からのペプチド特異的ＩＬ−２生産により測定した通り、ペプチドＸ 及びペプチドＹの両者に十分応答する。

この実験では５匹のＢ６ＣＢＡＦ、マウスの１グループにそれぞれ３００μｇ／ 投薬のペプチドＸ及びペプチドＹを注射した。動物に０日及び５日に前肢の間の 皮下の１カ所の背部位で注射した。１０日に合計２７０μｌのＣＦＡ中のそれぞ れ１００ｍｇのペプチドＸ及びペプチドＹの攻撃投薬を上記の位置で動物に与え た。２０日に動物を犠牲にし、化膿しているリンパ節を上記の通り取り出した。

上記の通りリンパ節細胞を単離し、懸濁し、濯ぎ、１５０μｇ／ｍｌのペプチド Ｙ１ペプチドＸ１又はペプチドＸとペプチドＹの組み合わせと共に、あるいは含 まずに培養した。培養からの上澄み液を上記の通りＩＬ−２に関して検定した。

図７における６棒は５匹の動物の化膿しているリンパ節から集めた３重の培養の ｃｐｍ値の算術平均を示す。ペプチドＸ及びペプチドＹの組み合わせを用いた動 物の耐性化により、試験管内で別々に、又は−緒に与えられたペプチドの両方に 対するＴ細胞耐性がこれらの動物においてＴＲＦＰで予備免疫化されたマウスに おけるペプチドＹ特異的子細胞応答は、皮下投与された場合にペプチドＹにより 耐性化される感作されたマウスにおいてペプチドＹの皮下投与がＴ細胞耐性を誘 導できることを示すために、ＴＲＦＰタンパク質に由来するペプチドＹに対する Ｔ細胞応答があるように、全タンパク質ＴＲＦＰを用いてマウスを免疫化した。

本来のタンパク質構造におけるペプチドＹはタンパク質コンホーメーションによ り不明確となる。かくしてＴＲＦＰ投与の後、マウスはペプチドＹに特異的な抗 体を生産しない。

ＢＤＦＩマウスをそれぞれ２００μｌ　ＩＦＡ（不完全フロインドアジュバント ）中の１００μｇのＴＲＦＰを用い、腹膜内の１カ所で免疫化した。４力月後、 以下の通りにマウスを放血させ、その抗−ＴＲＦＰＩｇＧ抗体の量に従ってグル ープに分けた。マウスを赤外ランプで温め、カミソリの刃（Ｇｉｌｅｔｔｅ　Ｐ ｌａｔｉｎｕｍ　Ｐｌｕｓ）で静脈を切り開くことにより尾静脈の１つを介して 放血させた。血液を血清分離管（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｅｎｓ。

ｎ）中に落とし、凝固させた。続いて１３．ＯＯＯｒｐｍで遠心することにより 血餅から血清を分離した。使用するまで血清を一２０℃で保存した。ＥＬＩ　Ｓ Ａにより血清をＴＲＦＰ特異的特異的１関Ｇて検定した。

ＩｇＧアッセイのために、イムノアフィニティー精製ＴＲＦＰをＰＢＳ中２μｇ ／ｍｌのＴＲＦＰの５０μｍ／ウェルをインキュベートすることによりＮｕｎｃ 　Ｐｏ１ｙｓｏｒｐ　９６ウエルプレート上に塗布した。言及がなければ、この 案の場合の各インキュベーション段階は３７℃で１時間行った。ＰＢＳで濯いだ 後、ＰＢＳ中０．　５％のゼラチンと共にウェルをインキュベートし、プレート への過剰の結合を遮蔽した。

プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで濯いだ。血清をＰＢＳ中 で１１５００に希釈し、プレート上で３重にインキュベートした。濯いだ後、結 合したマウスの抗体をＰＢＳ中で１／１００００に希釈したビオチニル化ヒツジ 抗−マウスＩｇＧ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ ｏｃｉａｔｅｓ）と共にインキュベートすることにより検出した。プレートを濯 ぎ、ホースラディツシュパーオキシダーゼに共役させた１／１００００希釈のス トレプタビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏ、Ａｓｓ、）を２０分間加え、室温 でインキュベートした。与えられた指示に従い、ＴＭＢパーオキシダーゼ基質（ Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ）を用いた。得られたＯ、Ｄ。

値をＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋモデル＃３１０）により４５０μｍで 読み取り、プレート上でＴＲＦＰタンパク質に結合した複合体を定量した。１７ 色ｏｏ希釈の各血清を用い、発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）ＥＬＩＳＡウェ ルのＯ，Ｄ　に関してマウスを一致させ、３匹の動物の２つの一致グループに分 離した。これらの動物からの１１５００希釈の血清のＴＲＦＰ特異的特異的１関 Ｇる値の範囲は１．７〜２゜２であった。

これらのＴＲＦＰ感作マウスからのＴ細胞がペプチドＹに応答するか否かを決定 するために、３匹のＴＲＦＰ感作、抗−ＴＲＦＰ抗体陽性マウス（上記のＩｇＧ 一致グループ中ではないが類似のＩｇＧ量を有する）を頚部脱臼により犠牲にし 、肺臓を取り出して濯ぎ緩衝液に入れた。腹膜内注射は肺臓において強いＴ細胞 応答を生ずるので肺臓を用いた。リンパ節細胞に関して上記で詳細に説明した通 りに肺臓を懸濁して濯いだ。

細胞を上記の通り１５０μｇ／ｍｌのペプチドＹと共に、又は培地のみを用いて 培養した。２４時間後、上澄み液を取り出し、前記の通りにＩＬ−２の存在に関 して調べた。ペプチドＹ特異的ＩＬ−２生産は、これらのマウスがＩＦＡ中のＴ ＲＦＰで感作した４力月後にペプチドＹに応答することを示している。

さらにマウスのＴＲＦＰ　ＩｇＧ一致グループをペプチドＹで耐性化した。続い てこれらの動物のペプチドＹに対する耐性が、ペプチドＹによる生体内攻撃の後 に試験管内でＩＬ−２を特異的に分泌しないことにより示された。ＩｇＧ一致グ ループは以下の要領で耐性化し、ペプチドＹで攻撃した。２つのＩｇＧ一致グル ープの１つに０日及び５日（ＴＲＦＰ感作後感作後日０９日１４日）に３００μ ｇのペプチドＹを含む０゜２ｍｌのＰＢＳを皮下注射した。他のグループにＰＢ Ｓのみを注射した。

両グループ共前肢の間の１カ所の背部位に注射した。１０日（ＴＲＦＰ感作後感 作後日１９日グループの動物を上記の通り１００μｇのペプチドＹで攻撃した。

２０日（ＴＲＦＰ感作ｉ＆１２９日）に動物を犠牲にし、上記の通り化膿してい るリンパ節を取り出した。リンパ節を懸濁し、濯ぎ、１５０μｇ／ｍｌのペプチ ドＹと共に（図９、左パネル）、又は培地のみを用いて上記の通り培養した。２ ４時間後、培養の上澄み液を上記の通りＩ　Ｌ−２に関して調べた。

図９の左パネルの各棒は１匹のマウスの３重の培養の平均を示す。この実験はＴ ＲＦＰで予備免疫化された動物においてペプチドＹに特異的なＴ細胞を耐性化で きることを示しており、耐性化の時点のペプチドＹ特異的子細胞応答を示す。

ペプチドＹに対する抗体応答を備えることができるマウスの能力をペプチドＹ特 異的Ｔヘルパー細胞活性に関するアッセイとして用いることができる。実施例５ で示した通り、ＴＲＦＰを用いたＢＤＦ１マウスの免疫化により全ＴＲＦＰに特 異的な抗体が生成され、ペプチドＹに特異的な抗体は検出されない。上記のマウ スの２つの一致グループを犠牲にする時点で放血させた（ペプチドＹ／ＣＦＡ攻 撃の１０日後）。前記の通りに血清を分離した。両血清をペプチドＹに特異的に 結合するＩｇＧ抗体に関して検定したう　ＩｇＧアッセイのためにイムノアフィ ニティー精製ペプチドＹを、ＰＢＳ中の２０μｇ／ｍｌのペプチドＹの５０μｌ ／ウエルをインキュベーションすることによりｐＪｕｎＣＰｏ１ｙｓ。

ｒｐ　９６ウエルプレート上に塗布した。この案の場合の各インキュベーション 段階は３７℃で１時間続ける。プレートへの過剰の結合を遮蔽するためにウェル をＰＢＳ中のゼラチンと共にインキュベートした。血清を１／３００〜１／８１ ００の範囲でＰＢＳ中で希釈し、プレート上で３重にインキュベートした。濯ぎ の後、ビオチニル化ヒツジ抗−マウスＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓ。

ｃｉａｔｅｓ）と共にインキュベートすることにより結合したマウス抗体を検出 した。ホースラディツシュパーオキシダーゼに共役させたストレプタビジン（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）を加え 、抗原結合ビオチニル化抗体複合体を検出した。与えられた指示に従ってＴＭＢ パーオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｌｃｅｇａａｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ）を用い 、得られたＯ、　Ｄ、値をＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋモデル＃３１０ ）により４５０ｎｍで読み取り、プレート上でペプチドＹに結合したホースラブ 什ソシュパーオキシダーゼー含有複合体を定量した。１／９００における血清の ＥＬＩＳＡウェルのＯ，Ｄ、４５０を図９に示す。他の血清希釈からのデータは １／９００血漬希釈からのデータと一致した。ペプチドＹ耐性化動物はペプチド Ｕ／ＣＦＡ攻撃後１０日でペプチドＹに特異的な抗体をほとんど作らず、耐性化 されなかった動物よりずっと低かった。これらの結果はＴＲＦＰ予備免疫化動物 をペプチドＹで耐性化すると抗体生産のためのペプチドＹ特異的Ｔ細胞ヘルパー 活性を低下させることを示唆している。

血清をペプチドＹ特異的１ｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＧイソタイプの存在に関して検 定した。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ５　ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及び１ｇＭイソタイプ の抗原特異的結合の検出に用いたＥＬＩ　ＳＡは上記のＩｇＧアッセイと類似し ており、結合したイソタイプの検出に用いられるビオチニル化抗−免疫グロブリ ンのみが異なる。これらのアッセイではビオチニル化ヒツジ抗−１ｇＧ１　（＃ １０７０−０８）　、５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ ｏｃｉａｔｅｓ）、抗−ＩｇＧ２ａ　（＃１０８０−０８，５ＢＡ）　、抗−Ｉ ｇＧ２ｂ　（１０９０−０８，５ＢＡ）、抗−１ｇＧ２　（１１００−０８，５ ＢＡ）及び抗−ＩｇＭ　（１０２０−０８，５ＢＡ）を用いた。ＩｇＥに結合し た抗原は同様にして検出したが、マウスＩｇＥに特異的なラットモノクローナル 抗体であるビオチニル化ＥＭ９５を用いた。（Ｂａｎｉｙａｓｈ　Ｍ。

Ｅｓｈｈａｒ　Ｚ：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩｇＥ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔ ｏ　ｍａｓｔ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｂａｓｏｐｈｉｌｓ　ｂｙ　ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｍｕｒｉｎｅ　ＩｇＥ、Ｅｕｒ　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４ニア９９．１９８４）。

ビオチニル化ヒツジ抗−ラソトＩｇをＩｇＥ　ＥＬｒＳ八における追加のシグナ ル増幅段階として用いた。ペプチドＹ特異的１ｇＧ２ａ、ＩｇＧ３又はＩｇＥに 関するアッセイにおいてバックグラウンド以上の結合は検出されなかった。Ｉｇ Ｇ１は食塩水のみを注射された動物において見られる主要イソタイプであり、３ 匹の動物すべての場合に１／２７００の力価であった。ペプチドＹ耐性化動物の 中の２匹が１／３００の！ｇＧｌ力価を有し、１匹がバックグラウンド以上の結 合を有していなかった。ＩｇＭ及びＩｇＧ２ｂの力価は類似の影響を受けた。す べての耐性化動物からの血清はバックグラウンド以上のＩｇＧ２ｂ結合を有して いなかったが、食塩水標準動物のそれぞれは１／３００の血清力価を有した。ペ プチドＹ耐性化動物の血清１ｇＭ力価はすべて１／３００であったが、食塩水標 準の血清１ｇＭ力価はすべて１／９００であった。

かくして食塩水中で皮下注射されたペプチドはこれらの感作動物において抗−ペ プチド抗体のイソタイプ分布を変更せずに抗体応答を低下させる。

実施例７ ＴＲＦＰで予備免疫化したマウスに対するペプチドＹの投与はＴＲＦ　Ｐに関し て特異的な抗体に影響を与えないペプチドＹに対して耐性化された実施例６に記 載の動物は全ＴＲＦＰタンパク質に対する既存の抗体応答を有する。“耐性化” 注射（すなわちＰＢＳのみに対するＰＢＳ中のペプチドＹ）及び攻撃注射（すな わちＣＦＡ中のペプチドＹ）の前後のこれらの動物の抗−ＴＲＦＰ　ＩｇＧ応答 を比較した。この比較によりこのＴ細胞耐性化がＴＲＦＰ特異的夏ｇＧｆｃに直 接影響を有するか否かを決定することができる。抗−ＴＲＦＰ抗体アッセイは上 記の詳細な記載に従った。このアッセイの場合マウスの血清は１１５００〜１／ １３，５００に希釈した。１／４５００血清希釈からのデータを表２に示す。各 血清は２重のウェルで検定し、値を平均した。このアッセイにおけるバックグラ ウンドは約０．１であった。データはこの時間枠内でこれらのマウスのいずれに おいてもＴＲＦＰに特異的な抗体の量の有意な変化がなかったことを示している 。かくしてペプチドＹに特異的なＴ細胞の耐性化は耐性化の後２０日間、抗−Ｔ ＲＦＰ抗体に影響を与えない。

表２ ＴＲＦＰに対するマウス血清の特異的１ｇＧ結合のＥＬＩ　ＳＡ分析−マウス＃ １　０．８４２　０．７８２−マウス＃２　０．５８０　０．５０３−マウス＃ ３　０．７２５　０．６９３−マウス＃１　０．６７０　０．４９２−マウス＃ ２　０．６８７　０．６５４−マウス＃３　０．６８６　０．５８５示されてい る値は血清の１／４５００希釈の２重のウェルの平均である。

実施例８ ペプチドＹの皮下投与はＴＲＦＰで感作したマウスにおいてＩＬ−２及びＩＬ− ４生産Ｔ細胞における耐性を誘導するＴヘルパー細胞にはい（つかの表現型の種 類があり、それらはそのリンホカインの生産により区別することができる。Ｔｈ 、細胞はＩＬ−２及びγ−インターフェロン、ならびに他のリンホカインを生産 する。Ｔｈ２細胞はＩＬ−４及び他のリンホカインを生産する。ＩＬ−２生産は 試験管内リンパ節−次培養からＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞系を介して容易 に測定することができる。同様にしてＩＬ−４はＩＬ−４依存性ＣＴ４５細胞（ Ｗ、Ｐａｕｌにより提供）の培養を用いて測定することができる。しかし試験管 内−次培養からのＩ　Ｌ−４の生産は低く、再現性ではない。ペプチドＹを用い た耐性化が両型のＴヘルパー細胞に影響を与えるか否かを決定するために我々は ２グループのマウス（前記）からリンパ節細胞を集め、耐性化し、攻撃し、Ｔ細 胞耐性に関して検定した。細胞（合計２ｘｌＯ’）を３０μｇ／ｍｌのペプチド Ｙを含む５ｍｌの培地中で培養した。３７℃及び５％ｃｏ、において２１日間イ ンキュベートした後、細胞を培地で２回濯ぎ、ＩＬ−２生産アツセイ及びＩＬ− ４生産アツセイの両方のために１５０μｇ／ｍ１のペプチドＹと共に、又は含ま ずに３重の０．２ｍｌウェル中で４Ｘ１０’細胞／ｍ＋において再度平板培養し た。２４時間後にＩＬ−２アツセイのための上澄み液の試料（それぞれ５０μｌ ）を取り出し、上記で詳細に記載した通りに検定した。ＩＬ−４アツセイのため の試料は４８時間後に取り出し、使用するまで４℃で保存した（最低２日）。Ｉ 　Ｌ−４含有量は上澄み液がＣＴｄＳ系の成長を支持する能力により検定した。

ＣＴ４５細胞（ＩＸＩＯ’／ウェル）を温めた培養上澄み液に加え、３７℃及び ５％ＣＯ２で４０時間インキュベートした。３Ｈ−チミジン（１μＣ１１５０ｍ １培地／ウェル）“を加えてさらに８時間培養し、ＤＮＡ中へのチミジンの挿入 を介してＣＴ４５成長を定量した。プレートを凍結してわずかに接着したＣＴ４ ５細胞を除去した後に細胞を収穫した。プレートを収穫し、上記に詳細に記載し たＩ　Ｌ−２アツセイと同様にしてカウントした。

二次ＩＬ−２及び二次ＩＬ−４アッセイの両方に関しく図１０）、３重の１５０ μｇ／ｍｌのペプチドＹのウェルからのカウントの平均数をペプチドＹを含まな いウェルからのカウントの平均数で割り、刺激因子を決定した。二次培養におけ る無抗原バックグラウンドは一次培養より変動が大きいのでこれが必要である。

ペプチド耐性化はこれらの試験管内二次培養においてＩＬ−２及びｒＬ−４の両 方のペプチド特異的生産を減少させた。これらのデータはペプチドＹを用いた耐 性化がＩ　Ｌ−２及びＩＬ−４の両方の抗原特異的生産を減少させることを示唆 している。

効果は両方の型のＴヘルパー細胞へのペプチドＹの投与による寛容性（ｔｏ　Ｉ 　ｅ　ｒｏｇｅｎ　ｉ　ｃ）効果を示す。

実施例９ ペプチドＸ及びペプチドＹの皮下投与はＴＲＦＰの組み換え鎖１へのＴ細胞応答 を低下させる ４グループのＢ６ＣＢＡＦ、マウスをＰＢＳのみ、あるいはＴＲＦＰの組み換え 鎖１を含むＰＢＳ、ペプチドＸ及びペプチドＹを含むＰＢＳ。

又はペプチドＦｅｌ　３　１、ペプチドＹ５ペプチドＣ及びペプチドＤを含むＰ ＢＳを皮下注射することにより°゛耐性化”した。マウスに１５０μｇ／投薬の ＴＲＦＰタンパク質又は各ペプチドのいずれかを注射した（０日及び５日）。Ｐ ＢＳのみ及びＰＢＳ／ペプチドは３００μＩ／投薬で注射した。ＰＢＳ／ＴＲＦ Ｐタンパク質の鎖１は１００μｍ／投薬で注射した。すべての耐性化投薬は前肢 の間の背皮膚下の１カ所で行った。１０日にすべての動物に上記の通り２００μ ｍのＣＦＡ中の１００μｇのＴＲＦＰの組み換え鎖１の攻撃注射を与えた。２０ 日に動物を犠牲にし、化膿しているリンパ節を上記の通り取り出した。リンパ節 細胞を懸濁させ、濯ぎ、１５０μｇ／ｍＩ　ＩｃＴＲＦＰの組み換え鎖１と共に 、又は含まずに培養した。この実験の場合のリンパ節細胞培養はそれぞれ０．１ ｍｌであった。培養からの上澄み液を上記の通りＩＬ−２に関して検定した。

図１１における各捧は５匹の各マウスからのリンパ節細胞の３重の培養により生 産されたＩＬ−２の平均を示す。ペプチドを含まないこれらのリンパ節細胞の培 養からのＩＬ−２アツセイは約５００ｃｐｍであった。結果はペプチドＸ及びペ プチドＹを用いた耐性化、ならびにＴＲＦＰの鎖１を用いた耐性化が鎖１タンパ ク質ＴＲＦＰを用いた生体内攻撃の後のＴＲＦＰの鎖１に特異的なＩＬ−２の生 産の減少に有効であることを示す。結果は、鎖１からの２つのペプチド（ペプチ ドＸ及びペプチドＹ）を用いた耐性化が鎖１からの４つのペプチド（Ｆｅ１３− １、ペプチドＹ１ペプチドＣ及びペプチドＤ）を用いた耐性化と同様に有効であ るか、あるいはＴＲＦＰ鎖１自身を用いた耐性化と同様に有効であることを示し ている。

この研究の目的は、ＴＲＦＰ鎖１配列から誘導されたペプチドＸ及びペプチドＹ へのヒトＩｇＥ結合の量の分析である。ＥＬＩＳＡアッセイは以前にＩｇＥ供給 源としてネコアレルギー患者の血漿を用いてＴＲＦＰへのＩｇＥ結合を定量する ために行われた。このアッセイ型式を抗−ＴＲＦＰ　ＩｇＥがペプチドＸ及びＹ に結合する可能性の分析に拡張した。これらのアッセイも２つのペプチドの同量 の混合物、及びＨ３Ａ　（ヒト血清アルブミン）に別々に共役させた各ペプチド を含んだ。これらの抗原のいくつかに関するドツトプロットアッセイも、ＩｇＥ 結合検出のための別の手段として行った。臨床的意味は、これらのペプチドが有 意な割合の抗−ＴＲＦＰ　ＩｇＨに結合する場合、アレルギー患者の処置の間に 不利なアレルギー反応が起こり易いということである。

ＥＬＩＳＡ これらのＥＬＩＳＡアッセイの基本的型式は直接結合アッセイであり、抗原を９ ６ウエルのミクロタイタープレート皿上に塗布し、続いて溶液中の抗体を加え、 結合能力に関して検定する。これらのアッセイの案は以下の通りである： Ｃｏｒｎｉｎｇアッセイプレート（＃２５８８２−９６）に１０μｇ／ｍｌの各 塗布抗原、ＰＢＳ（ホスフェート緩衝食塩水）中のアフィニティー精製ＴＲＦＰ 、ペプチドＸ、又はペプチドＹ、ペプチドＸとペプチドＹの混合物、ペプチドＸ ／ＨＳ　ＡあるいはペプチドＹ／Ｈ３Ａを５０μｇ／ウェルで塗布し、４°Ｃで 終夜インキュベートする。ペプチドはその化学構造に基づき２通りの方法でＨ３ Ａ　（ヒト血清アルブミン）に共役させた。ペプチドＸとの共役反応はＰｉｅｒ ｃｅ　ＩｍｊｅｃｔＩｍｍｕｎｇｅｎ　ＥＤＣ共役キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏ ｃｋｌａｎｄ、ＩＬ）の試薬及び案を用いた。ペプチドＹはｓ　ｉ　ｌ　ｆ　ｏ −３ＭＣＣ試薬（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ｃ　ｃ）を用いてそのシスティン残基を介し てＨ８Ａに共役させた。両共役体をフィルター精製し、ＰＢＳに対して透析した 。ＥＬＩＳＡアッセイでは、非結合塗布抗原を除去し、ウェルをＰＢＳ中の０． ５％ゼラチン２００μｍ／ウェルで室温において２時間遮蔽した。

抗体溶液は、市販のネコ抽出物に皮膚テスト陽性であった２０の患者かう集メタ 血漿試料であり、それをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０　（０，０５％の非オン性界面 活性剤Ｔｗｅｅｎ−Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　ＭＯを含むＰＢＳ）で順次 希釈し、１００μｌ／ウエルを加え、４℃で終夜インキュベートした（血漿希釈 液は２重に調べた）。この血漿収集物からプロティンＧ−アガロース（Ｇａｍｍ ａＢｉｎｄ　Ｇ−Ａｇａｒｐｓｅ、Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、ＭＤ）を用いた抽出によりほとんどのＩｇＧ抗体を枯渇させた。二次抗 体（ビオチニル化ヒツジ抗−ヒトＩｇＥ、１：１０００Ｋ１０００Ｋｉｒｋｅ　 ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、Ｇａ１ｔｈｅｒｓｂ　ｕ　 ｒ　ｇ、　ＭＤ）を１００μｍ／ウェルで室温において１時間加えた。

この溶液を取り出し、続いてストレプタビジン、１　：　１０００、（Ｓ。

ｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ。

Ｉｎｃ、、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を１００／μｌ／ウエルで室温におい て１時間加えた（各インキュベーション段階の間にすべてのウェルをＰＢＳ−Ｔ ｗｅｅｎで３回洗浄した）。ＴＭＢ膜パーオキシダーゼ基質系（ＴＭＢ　Ｍｅｍ ｂｒａｎｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ）　（ Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を新しく混 合し、１００μｍ／ウェルで加えた。２〜５分間発色させた。１００μｌ／ウエ ルのＩＭ　リン酸を加えることにより反応を止めた。プレートをＭｉｃｒｏｐｌ ａｔｅ　ＥＬ　３１０　Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎ　ｔ　ｓ、Ｗｉ　ｎｏｏｄｋ　ｉ、ＶＴ）上で４５０％ｍのフィルターを用 いて読み取った。２重のウェルの吸収量を平均した。ＥＬＩ　ＳＡアッセイの結 果をグラフ化（吸収に対する希釈の対数）し、図１２に示す。

図１２はＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹ　ＩｇＥ結合に関するＥＬＩＳＡ アッセイのグラフ図である。ＩｇＥ抗体はヒト血漿における存在量の最低の抗体 なので、第１の希釈、ＰＢＳ中の１＝２がＴＲＦＰ結合に関する０、６５の吸収 読み取り値を示す。結合に関して明らかに陽性であるが、これはやはり初期吸収 読み取り値として低い。陽性の結合は、バックグラウンドの２倍より大又は等し い吸収読み取り値として定義する。いくらかの患者は抗−ＴＲＦＰ　ＩｇＥ量が 非常に高く、それは高い読み取り値に反映される（データは示していない）。こ のＩｇＥ枯渇血漿収集物は、すべての異なる患者の抗−ＴＲＦＰ　ＩｇＥの平均 を示す。このアッセイは塗布ＴＲＦＰ抗原と反応性の抗−ＴＲＦＰＩｇＥの相対 的量を正確に検出することができる。２つのペプチド抗原、ペプチドＸ及びペプ チドＹは調べたいずれの希釈においても特異的ＩｇＥ結合を示さなかった。これ らの結合アッセイの場合の負の標準は抗原を塗布しなかったウェルへの結合量で ある。ウェルに塗布されたペプチドの存在に関する正の標準のために、ペプチド Ｘ又はペプチドＹのいずれかに対する抗−ペプチド抗血清を用いたＥＬＩＳＡを 用いた。

表３（ｊ異なる数のネコアレルギー患者からまとめたデータとしてのパーセント 陽性結合を示す。少ない方の組の患者をペプチドの混合物及びＨＳ　Ａに共役さ せたペプチドに対するＩｇＥ結合に関して調べた。この場合もペプチド又はペプ チド共役体の存在に関する陽性の標準は抗−ペプチド抗血清の結合であった（今 回は示した）。

表３ ペプチドＸ及びペプチドＹの直接１ｇＥ認識の分析のまとめＥＬＩＳＡ＊ 調べた抗原：　陽性結合　Ｎ ＴＲＦＰ　１００％　１２ ペプチドｘ　０％　１２ ペプチドＹ　０％　１２ ペプチドＸ＋１ＰＣ−２０％　４ ペプチドＸ／ＨＳ　Ａ　０％　３ ペプチドＹ／Ｈ３Ａ　０％　３ ドツトプロツト 調べた抗原：　陽性結合　Ｎ ＴＲＦＰ　１００％　８ ペプチドｘ　０％　８ ペプチドＹ　０％　８ 上記と同様の案を用いたＩｇＥ結合研究をペプチドＦｅ１８−１、Ｆｅｌ　３１ 　１、Ｆｅｌ　３１　２、Ｆｅ１３１−４及びＦｅ１３１−３を用いて行った。

これらのペプチドのいずれもＩｇＥ結合を示ドツトプロットアッセイは、それが 固相７１〜リツクスに結合した抗原を用いた直接アッセイである点でＥＬＩＳＡ と類似している。ドツトプロットアッセイの場合、マトリックスはニトロセルロ ース紙であり、結果はビオチン標識二次抗体への１２５Ｉ−ストレプタビジン結 合を用いたオートラジオグラフィーに基づく。

ドツトプロット案：抗原、ＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹを９６ウエルド ツトブロソトマニホルド（Ｂｉｏｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

ＣＡ）を用い、１００μｍの試料量で室温において４５分間、０．　１μｍのニ トロセルロースシートに塗布した。ＴＲＦＰは２．０２及ＵＱ。

０２μｇ／ドツトで塗布し、ペプチドは１ｏ１１及び領　１ｎｇ／ドツトで塗布 した。続いてウェルを２００μｍのＰＢＳで洗浄した。Ｔｗｅｅｎ溶液（Ｔｒｉ ｓ−ＨＣＩ；Ｐｈ７．５　０．０２５Ｍ　ＮａＣｌ０．１７ｍ　Ｔｗｅｅｎ−２ ００，５％）を用いてプロットを平衡化した後、すべての断片を１％無脂肪ドラ イミルク、１％ウシ胎児血清／Ｔｗｅｅｎ溶液で１〜１．５時間遮蔽した。患者 の血漿は１％ｍ１ｌｔ／Ｔｗｅｅｎ溶液中の１０％（Ｖ／Ｖ）で用い、ニトロセ ルロースのブランクストリップに１時間予備吸着させた。予備吸着の後、希釈し た患者の血漿試料を抗原塗布ドツトプロットと共に室温（ＲＴ）で終夜インキュ ベートした。ニトロセルロースドツトプロットをＴｗｅｅｎ溶液中のビオチニル 化ヒツジ抗−ヒトＩ　ｇＥ　（１：　２５００）中でＲＴにおいて２時間インキ ュベートした。洗浄後、断片を１μＣｉの１２Ｊ−ストシブタビジン中で１時間 インキュベートした。強力な洗浄により非結合標識を除去した後、プロットをフ ィルムに１６時間露光した。

ドツトプロットアッセイの結果をまとめて表３に示す。すべての濃度において、 ペプチド抗原は特異的ＩｇＥ結合に関して陰性であり、この唐音の組の場合はす べてＴＲＦＰ結合に関して陽性であった。

糀艙： 直接結合ＥＬＩＳＡ法を用いることにより、我々はアフィニティー精製ＴＲＦＰ へのＩｇＥ結合を明らかに示した。これの同一のアッセイを用い、我々はネコア レルギー１ｇＥのペプチドＸ及びペプチドＹへの特異的結合を検出しなかった。

ペプチド結合の欠如をさらに示すために、塗布抗原として２つのペプチドの混合 物を調べた。この混合物はヒト血清アルブミンに共役させた個別のペプチドの場 合と同様に検出可能な特異的１ｇＥ結合に関して陰性であった。これらの型式を 含むことの理論的説明は、結合の欠如がペプチドがプレートに直接結合する時の あるコンホーメーションの故ではないことを調べることである。これらの結果は 、異なる終点読み取りを含む明確に異なるマトリックスを用いた（すなわち酵素 的発色に対するオートラジオグラフィー）ドツトプロットアッセイからの結果と 関連した。Ｆｅ１８−３及びＦｅ１３０−４への直接ＩｇＥ結合は検出されなか った。

実施例１１ ペプチドＸ及びペプチドＹに対してＴＲＦＰを比較したヒスタミン放出分板 ヒスタミン放出分析の目的は、試験管内アレルギ一応答系におけるペプチド又は ＴＲＦＰの効果を直接検定することである。ＴｇＥ認識及び生細胞へのＩｇＥレ セプター架橋を介したヒスタミンの放出は、タンパク質抗原のアレルギーポテン シャルを直接検定する。この研究の目的はこのアレルギーポテンシャルを既知の アレルゲンＴＲＦＰとペプチドＸ及びペプチドＹの間で比較することである。

これらの研究に用いられたヒスタミン放出アッセイは、特異的モノクローナル抗 体を用いたヒスタミンのアシル化誘導体の検出に基づ＜　（Ｍｏｒｅｌ、Ａ、Ｍ 、ａｎｄ　Ｄｅｌａａｇｅ、Ｍ、　′Ａ、；　１９８８．Ｊ。

Ａｌｌｅｒｇ’ｙ　Ｃ１１ｎ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、８２：６４６−６５４）。

このアッセイは２つの分離した案として行った：１）異なる濃度の抗原の存在下 における、ヘパリン化全血に存在する好塩基性細胞からのヒスタミンの放出、及 び２）遠心による細胞の除去の後に放出反応の上澄み液中に存在するヒスタミン の実際のアッセイ。このヒスタミン　ラジオイムノアッセイのための試薬はＡｍ ａｃ　Ｉｎｃ、（Ｗｅｓｔｂｒｐｐｌ、ＭＥ）によりキットとして商業的に供給 される。

ヘパリン化シリンジ又はバキュテーナーを用いて全血をネコアレルギー壱者から 採取した。抗原、アフィニティー精製ＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹをそ れぞれ１．５ｍｌのポリエチレン管においてＰＡＣＭ（ＰＩＰＥＳ緩衝液２５ｍ Ｍ、ＮａＣｌ　１１０ｍＭ、ＫＣＩ　５゜ＯｍＭ、ヒト血清アルブミン０．００ ３％、ＣａＣｌ２５ｍＭ、ＭｇＣ＋　２　２ｍＭ、ｐｉ（’７．　３）緩衝液を ０．２ｍｌ用いて２倍の濃度に希釈した。０．２５ｍ１の同体積の血液を容管に 加え、反転させることにより反応を開始した。緩衝液標準は緩衝液のみと共に全 血を含み、抗原を加えなかった。続いて放出反応を３７℃で３０分間行った。こ のインキュベーションの後、管を１５０ＯＲＰＭで３分間遠心し、上澄み液を注 意深く取り出した。穏やかに回転して読み取り誤差を与える細胞ライシスがない ようにすることが重要であった。合計ヒスタミン放出値のために、１００μｌの 血液試料をＰＡＣＭ緩衝液と共に合計１ｍｌの体積で３分間煮沸した。この時点 で上澄み液を後の分析のために一２０°Ｃで凍結するか、又はすぐにプロセシン グした。

ＲＩＡ分析のために、放出上澄み液の５０μｌのアリコートをヒスタミン放出緩 衝液（Ａｍａｃ　Ｉｎｃ、からキットと共に供給）で１：４に希釈した。続いて １００μｌの各希釈上澄み液をアシル化試薬（凍結乾燥粉末）を含む管に加えた 。各上澄み液を加えた直後に５０μｍのアシル化緩衝液を加え、反応物が完全に 溶解するまで渦動により管を混合した。室温で３０分間以上、アシル化反応を完 結させる。ヒスタミン標準のセットがキットと共に供給され、これらすべてをア シル化反応によりプロセシングする（すなわち各アシル化反応管中で１００μｌ の各標準及び５０μｍのアシル化緩衝液）。続いて５０μｌの各アシル化反応物 をモノクローナル抗体を塗布した１２ｘ７５ｍＭのプラスチック管の底に加えた 。このモノクローナル抗体はアシル化ヒスタミン誘導体をそのエピトープとして 認識する。最後に５００μＩｓの１１３１標識トレーサーを氷上で容管に加え、 結合反応を４°Ｃで終夜（１８時間以上）行った。容管から溶液を吸引すること により結合反応を止めた。続いてそれらをガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ　５０ ０５．Ｂｅｃｋｍａｎ　ＩｎＣ，）上で２分／管の間、カウントした。

＋２５■標識／管の定量の後、ヒスタミン標準カウントから標準曲線を形成し、 片対数紙にプロットした。これは標識１２５１トレーサーが標準又は未知試料と 細胞上澄み液に関して競争する競争反応なので、記録されるカウントが低い捏、 結合アッセイにおける冷アシル化ヒスタミンの量が多い。続いてプロットされた ヒスタミン濃度（ｎＭ）に対するカウントの樟準曲線上の値を読み取ることによ りデータ点を形成した。

ヒスタミンに関するこの種の分析は非常に敏感であり、正確な測定法である。

図１３は種々の濃度のアフィニティー精製ＴＲＦＰ、ペプチドＸ及びペプチドＹ と共に培養した後のヒスタミン放出を比較した８人の別々のネコアレルギー患者 の結果をまとめてグラフ化した結果を示す。グラフは各患者の場合に放出された パーセント合計ヒスタミンに対するナノモルで表した種々の抗原の濃度を示す。

グラフは各濃度点における平均パーセント放出を示し、平均の標準偏差を誤差棒 を用いて示しである。ＰＡＣＭ緩衝液のみを用いた場合は１反応／患者しが行っ ていないが、抗原放出量との比較のために線として示す。

合計ヒスタミン量において患者間で変動が大きいので、結果はパーセント合計ヒ スタミン放出として示す。この変動の源は、患者による単位血液当たりの好塩基 性細胞の数、及び好塩基性細胞当たりのヒスタミンの量の変動に関連する。ＴＲ ＦＰペプチド抗原の場合は６の濃度点（５倍）しかなく、濃度曲線のより高い終 点を強調している。ＴＲＦＰ濃度は、完全な応答範囲を得るためにＴＲＦＰの場 合に用いられた３つの低い方の濃度を含み、８つの５倍希釈である。

図１３に示されたヒスタミン放出プロファイルは、最低の濃度を除いたすべての 濃度におけるＴＲＦＰが明確な放出シグナルを与えることを示す。しかし低い方 の濃度で放出のプラトーが現れ、高い抗原濃度で放出が増加する。単一の精製ア レルゲンを用いた典型的ヒスタミン放出プロファイルは理論的にベル形の曲線を 示し、架橋がないために高濃度でヒスタミン放出が低い（すなわち細胞表面レセ プターに結合した各１ｇＥ分子が別のアレルゲン分子に結合する）。これはＴＲ ＦＰを用いた本実験の場合は当てはまらなかった。ペプチドＸ又はペプチドＹの いずれに対してもヒスタミン放出は認識されない。

ＩｇＥ反応性を増し、本来のＦｅｌ　ｄ　Ｉにさらに酷似し、特に大量の材料が 必要なアッセイでその代わりに用いることができる試薬を生成する手段としてＴ ＲＦＰの２つの組み換え鎖を試験管内で再会合させた。再会合ＴＲＦＰは診断試 薬として有用であり得る。

再会合に用いた案は、以下の条件下で混合した１ｍｇの各組み換え鎖（ｒ鎮）を 必要とした； 反応条件 １）１ｍｇのｒ鎖１及び２．２）６．５６Ｍのウレア（最終濃度）、３）５重ｍ Ｍ　ＤＴＴ、４）０．２Ｘホスフ工−ト緩衝食塩水ＣＰＢＳ）。

最終体積は５ｍＬｓであり、それを振りながら５５℃に３分間加熱し、続いて５ ｍＬｓのＨ，Ｏを加え、混合物を室温に冷却した。この後分子量カットオフが３ ．５００の膜を用い、室温でＩＸ　ＰＢＳに対して拡大（ｅｘｔｅｎｓ　１ｖｅ ）透析を行った。

再会合ＴＲＦＰを直接ＥＬＩＳＡ及びその後枯渇ＥＬＩＳＡにより分析した。Ｅ ＬＩ　ＳＡに関する案は以下の通りである：ミクロタイタープレートにＰＢＳ中 の５．０重ｇ／ｍＬの塗布抗原（Ｆｃｌ　ｄ　Ｉ、組み換えＴＲＦＰ　（ｒＴＲ ＦＰ）鎖１、ｒＴＲＦＰ鎖２、ｒＴＲＦＰ鎖１＋２の混合物、又は再会合ｒＴＲ ＦＰ鎖１＋２）を１００μＬ／ウエルで塗布し、４℃で終夜インキュベートした 。プレートを各段階の間にＰＢＳ−Ｔ　（ホスフェート緩衝食塩水＋０．０５％ 　Ｔｗｅｅｎ　２０）で３回洗浄した。非結合抗原を除去し、ＰＢＳ−Ｔ中の１ ％ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）を３００μＬ／ウエルで用いて室温におい て１時間プレートを遮蔽した。続く試薬はすべて１００μＬ／ウエルで加えた。

直接ＥＬＩＳＡの場合、順次希釈したヒト血漿を２重のウェルに加え、４℃で終 夜インキュベートした。この後、ビオチニル化ヒツジ抗−ヒトＩｇＥ　（１：　 １．０００）を室温で１時間加え、続いてストレブタビジンーＨＲＰＯ（１：　 １０，０００）を室温で１時間加えた。ＴＭＢ基質及びＨ２Ｏ２を新しく混合し 、加えた。２〜５分間発色させた。ＩＭのリン酸を加えることにより反応を止め た。プレートをＤｙｎａｔｅｃｈプレートリーダー上で４５０ｎｍにおいて読み 取り、２重のウェルの吸収を平均した。枯渇ＥＬＩ　ＳＡの場合、患者の血漿を 抗原又はＰＢＳを塗布したウェル上で予備インキュベートし、血漿を集め、新し ぐ塗布したウェル上で再インキュベートした。続いて上記で概述した通りにＥＬ ＩＳＡを行った。

図２１に示す直接ＥＬＩＳＡの結果は、再会合したＴＲＦＰが本来のＦｅｌ　ｄ 　ｌ、２つの分離した組み換えＴＲＦＰＭならびにｒ鎖１及びｒ鎖２の混合物と 類似の結合特性を有することを示した。図２２に示す通り、枯渇ＥＬＩＳＡは再 会合した材料の特性が分離の、又は混合さ大の枯渇を示しく最低の結合曲線）、 再会合錆止への予備吸着は、鎖の混合物又は個別の錆止への予備吸着より有意に 大きなＦｃｌ　ｄ　ｌ特異的ＩｇＥの減少を示した。再会合した組み換え鎖はＩ ｇＥ結合に関する、より多くのエピ）・−プ（ｒ鎖１及び「鎖２の混合物より） を有するか、及び／又はエピトープに対する結合のアフィニティーが増したと思 異なる方法に従う別の組の実験において、４人のネコアレルギー患者に関するＴ 細胞増殖、ＩＬ−２生産及びＩＬ−４生産を研究した。これらの実験では、ＴＲ ＦＰのエピトープを含むペプチドのネコアレルギー患者からのＴ細胞の試験管内 増殖を誘導する能力、及びこの増殖をサイトカイン、インターロイキン２　（Ｉ Ｌ−２）及びインターロイキン４（ｒＬ−４）の合成と結び付けることができる か否かを調べた。

表４及び５に示すペプチドの他に、図１４に示す通りペプチドＦｅｌ〜３２、Ｆ ｅ１−３３、Ｆｅｄ−３４、Ｆｅ１−３５、Ｆｅ　１−３６、Ｆｅ１−３７、Ｆ ｅｌ−３８−１、Ｔｅ１−３９及びＦｅｌ−３９−１をこれらの実験に含んだ。

表４ 鎖ＩＴＲＦＰペプチドへのネコアレルギー患者の応答ペプチド　アミノ酸　ＰＩ ’　Ｓｌ’　Ｎ５Ｆｅｌ　１’　１−１７．３Ｔ　３９２　５．６　１２１１− ２　１−１７　３１１　７．４　８３１−３　４〜１７　４２２　６．２　２６ １−４　６−１７　８１６　９．６　３２１−５　８−１７　２８６　５．２　 ２５１−６　１０−１７　３１２　５．２　２６Ｆｅｌ　２　９−２５　４１６ 　７．３　３０Ｆｅｌ　３’　１８−３３．　６７４　９．５　１２３３１Ｐ、 ３２Ｄ ３−１　１８−３３　６３８　９．４　４０３−１０　１８−３１　５０４　６ ．９　２８３−１１　１８−３０　８６３　１０．４　１２３−１５　１８−２ ９　１０４０　１０．４　１３３−１３　１８−２８　６９０　１１．５　１４ ３−１４　１８−２７　２６０　６．２　１０Ｆｅｌ　８　１−３０　１３９３ 　１８．１　８６８−１　５−３３　１３７４　１５．１　４７８−２　６−３ ３　１３５３　１５．２　４７８−３　７−３３　１４３７　１６．９　４７Ｆ ｅｌ　１４　１８−４３　１０５４　１３．７　１２５１４−１　２３−３６　 ８７１　９．９　８８１４−３　２５−３６　６２１　６．９　９０１４−４　 ２６−３６　４７４　６．０　７９１４−５　２７−３６　２８６　５．４　５ ３１４−２　２９−４２　３３６　４．６　６０Ｆｅｌ　４　３７−５５　６０ １　７．７　１２０４−１　３７−５２　８２２　９．９　２０４−２　３７− ４９　３７８　６．２　１５４−３　３７−４６　１８５　３．７　１３Ｆｅｌ 　３０−１　２５−４９　２６８　５．６　２３３０−２　２５−４８　２４８ 　４．２　２２３０−３　２５−４７　２３０　．４．８　２３３０−４　２９ −５５　、　１０７９　１１．６　４４３０−５　２９−５４　７９２　１１． ０　４３３０−６　２９−５３　４１５　６．２　４３３０−７　２６−５５　 ３３９　５．３　１４３０−８　２８−５５　２６２　４．１　１４Ｆｅｌ　１ ５　４４−６０　’　４４０　１１．０　６０Ｆｅｌ　２３　５１−６６　３４ ３　６．６　６３Ｆｅｌ　２１５　５６−７０．７０Ｒ３６０５，８６６ＰＩＥ ’　調べて応答した患者すべての平均に、陽性の応答をした患者のパーセンテー ジを掛は合わせた値 ｓｒ：ｚ　抗原に対するＴ細胞及び抗原提示細胞増殖のｃｐｍの平均を応答患者 からのＴ細胞及び抗原提示細胞のみのｃｐｍで割った値。２゜５以上のＳ■が陽 性であると考えれる。

Ｎ　、　３　調べた患者の数。

アミノ酸３をＴに変更。

アミノ酸７０をＲに変更。

アミノ酸３１及び３２をそれぞれＰ及びＤに変更。

表５ 鎖２ＴＲＦＰペプチドへのネコアレルギー患者の応答ペプチド　アミノ酸　ＰＩ ＳＩＮ Ｆｅｌ　１６　１−２２　２８３　５．９　５２Ｆｅｌ　１７　１２−３３　４ ２１　６．１　１１４Ｆｅｌ　３２−１　１２−２４　４４２　６．６　２１３ ２−２　１４−２４　４２４　５．３　２０３２−３　１６−２４　２７０　３ ．７　２２Ｆｅｌ　１８　２３−４８　４６６　６．３　９９Ｆｅｌ　３３−１ 　２６−３６　３４０　５．４　６３３３−２　２６−３８　２１０　４．２　 ５０３３−３　２６−４０　２３５　５．０　４７Ｆｅｌ　３１−１　１４−４ ０　７３３　９゜４　３６３１−２　１４−３９　５９９　８．１　３５３１− ３　１４−３８　５９８　８．３　３６３１−４　１４−３７　６２２　８．４ 　３５３１−５　１４−３６　５３９　７．６　３７３１−６　１５−４０　２ ９５　４．４　３３３１−７　１５−３６　２６７　５．８　３３Ｆｅｌ　２０ −１　３４−５９　３９５　５．９　７９Ｆｅｌ　２５　４９−６８　３５０　 ７．６　５６Ｆｅｌ　２８　６０−８２　９４　３．６　４３Ｆｅｌ　２８−１ ’　６０−８２　１７６　５．５　４４Ｆｅｌ　２９　７４−９２　２５９　５ ．５　４７１　単形態（ｓ１１ｒ□ｔ　ｆｏｒｍ）鎖２配列（Ｃ２Ｓ）に基づく 。

４人のネコアレルギー患者（患者６８８．７３０．７３８及び８０７）からのヒ トＴ細胞系を単離した。ネコアレルギー患者からヘパリン化末梢血試料を得、単 核細胞画分をＦｉｃｏｌ　Ｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心により精製した。これらの細 胞のアリコート（２ｘｌＯ’）を、精製した本来のＴＲＦＰ　（１０Ｒｇ／ｍｌ ）を用いて試験管内で刺激し、組み換えＩＬ−２及びＩ　Ｌ−４の存在下で成長 させた。続いてＴ細胞系を二次増殖アッセイの準備ができるまで培養中で休止さ せた。

２ｘｌＯ’細胞を、種々の濃度の試験抗原を含む２００μｍの培地中で、抗原提 示細胞として５ｘｌＯ’のγ線照射したオートロガス　エプスタインパールウィ ルス形質転換細胞を用いて培養した。３日間培養した後、各ミクロウェルに１μ Ｃｕｒｉｅのトリチウム化チミジンを終夜パルスし、挿入された放射性の量を液 体シンチレーションカウンティングにより測定した。続いて各抗原に関する刺激 指数、（Ｓ、１．　）を算出した。ｓ、ｒ、は各抗原性刺激に関する最大カウン ト７分を培地標準のカウント７分で割ったものとして定義する。

２ｘｌＯ’の休止Ｔ細胞を、２０Ｒｇ／ｍｌの試験抗原を含む１ｍｌの培地中で 、抗原提示細胞として２ｘｌＯ’のγ線照射したオートロガス　エプスタインパ ールウィルス形質転換細胞を用いて培養した。同一の標準には抗原を与えなかっ た。２０時間インキュベートした後、遠心により細胞を培地から分離した。ＩＬ −２依存性Ｔ細胞系であるＣＴＬＬ−３の増殖により培地中のＩＬ−２を測定し た。１ｘｌＯ’のＣＴＬＬ−３の培養を、試料の上澄み液の３つの希釈液（２５ ％、５％、１％）に暴露し、２０時間インキュベートし、１μＣｕｒｉｅのトリ チウム化チミジンを４時間パルスした後に収穫した。Ｉ　Ｌ−２バイオアツセイ は２ｐｇ／ｍ　ｌのＩＬ−２まで感応性である。ＩＬ−４はＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅ ｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ　ｉｓ、ＭＮから購入したＥＬＩＳＡにより測定した 。ＩＬ−４ＥＬＩＳＡは１６ｐｇ／ｍ］のＩ　Ｌ−４まで感応性である。刺激Ｔ 細胞からの培地中に含まれるＩＬ−２又はＩ　Ｌ−４の量を非刺激Ｔ細胞により 放出されたＩＬ−２又はＩ　、Ｌ　Ｏ４の量で割ることによりＩＬ−２及びＩＬ −４生産に関する刺激指数を算出した。

これらの実験の結果を図１５〜２０に示す。結果は、ネコアレルギー患者からの Ｔ細胞がＴＲＦＰ分子に由来する種々のペプチドに応答することを示す。Ｔ細胞 増殖に関する刺激指数（Ｓ、１．　）プロファイルは、それぞれの患者の場合に ＩＬ−２生産プロフアイル及び！Ｌ−４生産プロファイルの両方に類似している （すなわちＴ細胞増殖を誘導することが示されたペプチドと同一のペプチドがＩ Ｌ−２及びＩＬ−４生産を誘導することが見いだされた）。これらの結果は、Ｔ 細胞増殖、Ｉ　Ｌ−２及びＩＬ−４生産がＴ細胞刺激活性を有するペプチドを限 定するために適した方法であることを示す。

さらに、エピトープのいずれもＩＬ−２の排除に対してＩＬ−４を刺激しなかっ た。ＩｇＥ合成及びその後のアレルギー性症状に対応するサイトカインであるＩ Ｌ−４のみを刺激するエピトープを含むペプチドはないと思われる。しかし１つ のペプチドＦｅｌ　４は４人の患者のこのパネルにおいてＩＬ−２よりＩＬ−４ をより多く誘導する。図１５〜２０に示されているデータは、ネコアレルギー患 者からのＴ細胞系をＴＲＦＰにより培養するとインターロイキン生産はＩＬ−２ よりＩＬ−４の生産が優先されることも示している。

同等事項 当該技術分野における熟練者は、日常的実験のみを用いて本明細書に記載の特別 な実施態様に対する多数の同等事項を認識、又は突き止めることができるであろ う。そのような同等事項は本発明の範囲内であると考え、以下の請求の範囲に含 まれる。

配列表 配列番号＝１ 配列の長さ：４２２ 配列の型：核酸 鎮の数：１本鎮 トポロジー−直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：８．．２８６ 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ存在位ｆ！ｉニア４．．２８６ 配列 “１”ｕｗ　’　２２ 配列番号＝２ 配列の長さ、９２ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：＠鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ　４２８ 配列の型：核酸 鎮の数＝１本鎖 トポロジー　直鎖状 配列のｆｉＢ：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２６．．２９２ 配列 入τλ　ＣＴＧ　ＪＩＡＧ　ＡＪ、ＣｒＧｃ　Ｇ’ｒ’ｒ　ＧＪ、Ｔ　Ｇ（Ｉｋ 　ＪｊＪ　Ｊ、Ｔ（ｉ　ＡＣＡ　Ｇ六λ　ＧＪ、に　Ｇ入τ@入λＧ　ＧＪＣ； 　２＜＜ λＧＣ入ｃｃｃ入τＣ＆ＣＴＧＣＣ入ＧＧ入　ＣＣＣＣＴ入＾ｃｃ入　λｃｃｃ ＾Ｃ丁Ｇ入入　ＣＦＧλτＣ入Ｃτ入　入ＧτλＧＴＣτＣ`　コ５２ ＣＣ＆ＧＣＣＴＧＣＣ１ＴＧＴＣＣｋＧＧＴ　ＧＴＣＴＴＪ、ＣＴＡＧ　Ｊ、に （’、ＴｒＣＣＡＧ　Ｃ入λＴＪＪＪＪ−ＧＣＣａａＧＣ入`ＴＴＣＧ２ ＪＪＪ、Ｃ琺易刀ｄ人状島　＜２８ 配列番号＝４ 配列の長さ：８８ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ　Ｌｔｕ　入ｓｐ　入１ａ　入１ａ　Ｌｅｕ　ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ 　Ｐｒｏ　τｈｒ　Ｖａｌ　Ｊ、ｌａ　Ａｌｍ　Ｔ’＝ｒ　`ｌｍ −１ｇ　−’１５　−４０　−５ Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｘｌｅ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　入ｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　 Ａｒ９　人ｓｐ　ＶａＩ　Ｊ、ｓｐ　Ｌｅｕ　？ｈ＠　Ｌｅ■ ｌ　Ｓ　ｉ。

Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　のＵ　入ｓｏ　入１ａ　入ｒｇ　Ｉ ｌｅ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　入ｓ＊　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　入１ｐＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｈａ ｔ　τｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　入ｓｏ　入１ａ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　入＄ＰＳｏ　５５　６０ ′　配列番号：５ 配列の長さ二４８５ 配列の型：核酸 観の数−１本鎖 トポロンーー＠鎖状 配列の種！Ｉ：ＣＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置　８．．３３７ 特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐＬｉｄｅ存在位置：５９．．３３７ 配列 τ入入ＣτＧＣ入τＣτ丁入Ａ＾Ａ）Ｊ−ζ＾　入＾スｍ入入　、ａ５配列番号 ＝６ 配列の長さ：１０９ 配列の型二アミノ酸 トポロジー二直鎮状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号；７ 配列の長さ＝２７ 配列の型、アミノ酸 トポロジー、直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型；中間部フラグメント 配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直鎮状 配列の種類・ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ｌｙｊ　人１ａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ムｓｏ　 λ１８　人ｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　入５ｎ　Ｃｙｓｌ　Ｓ　ｌｏ　ｉｓ 配列番号　９ 配列の長さ＝２６ 配列の型・アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　入１ａ　入ｓｏ　Ｇｉｙ　入ｓｎ　Ｇｌｕ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｖｌ　Ｓ　１０　ｉｓ 配列番号：１０ 配列の長さ：１９ ・　配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ａｓｏ　入１ａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｒｌｅ　丁ｙｒ　τｈｒ１　５　１０　ｉｓ 配列番号＝１１ 配列の長さ＝１９ 配列の型；アミノ酸 トポロジー、直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型；中間部フラグメント 配列 Ｈｅｍ　にｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ｋｓｎ　Ｔｈｔ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　入ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　入ｓｎ　τｈｒｌ　Ｓ　１０　Ｘ５ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　入ｒ９ 配列番号：１２ 配列の長さ＝１６ 配列の型；アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Ｇｌｕ　にｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　入ｓｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｌｔｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｉｌ＊　τｙｒ　丁ｈｒｌ　Ｓ　１０　ｉｓ 配列番号・１３ 配列の長さ：１４ 配列の型、アミノ酸 トポロジー；直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 ＾ＳＩＩ　入１ａ　Ｌｃｕ　５ｅｒ　Ｌ、ｅｕ　ｔ、ｅｕ　入ｓｐ　Ｌｙｓ　ｌ １ＩＪｙｒ　τｈ：　Ｓｅｒ　？ｒｏ　Ｌｅｕｌ　５　１０ 配列番号；１４ 配列の長さ、２０ 配列の型二アミノ酸 トポロジー二重鎖状 配列の種類二ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント ｅ　ｇ＋　ｓｅ　ｔ’３” ｌｅ　ｗ　Ｐ＋Ｉ＃Ｖ　＋Ｉ　ＣＤ Ｉ′１　＋Ｉ　Ｎ　肖　ｑ＋　臂 配　列 ＣＥＥＤＫＥＮＡＬＳＬＬＤＫＩＹτ Ｄ　ＮＡＬＳＬＬＤＸＩＹτ５ＰＬ Ｅ　ＴＥＥＤｈＤｔＡＬ５Ｌ］Ｊ）ＦＣ［ＹＩＳＱＬ（ｕｌ（Ｉつ）翼γ３−］ ■ 特表千７−５０５３６５　（２５） ｕｕｕ□Ｓν　Ｓ日Ｖ ！：Ｉｌ？専〈ミロＹＩせ♀％ Ｆｅｌ　３２　、、Ｖ）ＣＭＡＥＴＣＰＩＦＹＤＶＦＦＡＶＡＦｅｌ　３３　Ｆ ＹＤＶＦＦＡ’ＶＡＮＧＮＥＬＩ、ＬＤＦｅｌ　３６　ＥＲＴＡＭＸ）Ｃ！ＱＤ Ｃ！ＶＥＮＧＬＦｅｌ　３７　ＱＤＣＹＶＥＮＧＩＪＳＲＶＬＤＧＬＶＦｅｌ　 ３Ｅｌ°　ＸＳＲＶＬＤＧＬＶＭＴＴ！ＩＳＳＳＫＤＣＭｔｅｌ　３Ｂ−Ｉ　Ｉ ＳＲＶＬＤＧＬＶＭＩＡ！ＨＥ”ＤＣＭＦｅｌ　３９　ＭＴＴＩＳＳＳ）ＣＤＣ ＭＧＥＡＶＯＮＴＥＶＥＬＤ）ＣＬＮＴＬＧＦＦｅｌ　３９．Ｉ　ＭｍＡ！ＮＥ ”ＤＣＭＧＥＡＶＱＮＴＥＶＥＬＤＫＬＮＴＬＧＦ患者　６８８ ′ｆｌ（ｙ−＋”；− 患者　７３０ ビｌ（、、Ｊ（ｐ 患者　７３Ｂ 何６．　＋？ Ｆ″Ｉ（、、、Ｉ’Ｓ ＩＬ−４／ＩＬ−２比　（Ｎ　＝　４）Ｆｅｌ特異的１ｇＥ　ＥＬＩＳＡ −次抗体：患者血漿＃２８８ １／希釈 Ｆｅｌ特異的ＩｇＥ　ＥＬＩＳＡ −次抗体：患者血漿＃２８８ 塗布抗原：５μｇ／ｍｌ　Ｆｅｌ　ｄ　１１：ｒ（ｙ、２２ 補正口の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成６年９月２６（ 至）

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＴ細胞反応性ネコタンパク質に由来し、それぞれ図３に示されるペプチ ドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号： ９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列番号：１１）、ペプチ ドＣ（配列番号：１２）、ペプチドＤ（配列番号：１３）及びペプチドＥ（配列 番号：１４）から成る群より選ばれるペプチドを少なくとも１つ含む組成物。
2. ２．少なくとも１つのペプチドがペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配 列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、 ペプチドＢ（配列番号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群よ り選ばれることを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
3. ３．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）を含むことを特徴とする請求の範囲２ に記載の組成物。
4. ４．組成物がペプチドＹ（配列番号：８）を含むことを特徴とする請求の範囲２ に記載の組成物。
5. ５．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配列番号：８）、ペプ チドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列番 号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群より選ばれる少なくと も２つのペプチドを含むことを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
6. ６．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）及びペプチドＹ（配列番号：８）を含 むことを特徴とする請求の範囲５に記載の組成物。
7. ７．製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、及びヒト丁細胞反応性ネコタンパク 質に由来し、それぞれ図３に示されるペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ （配列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０ ）、ペプチドＢ（配列番号：１１）、ペプチドＣ（配列番号：１２）、ペプチド Ｄ（配列番号：１３）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群より選ばれ るペプチドを少なくとも１つ含む治療用組成物。
8. ８．少なくとも１つのペプチドがペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配 列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、 ペプチドＢ（配列番号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群よ り選ばれることを特徴とする請求の範囲７に記載の治療用組成物。
9. ９．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）を含むことを特徴とする請求の範囲８ に記載の治療用組成物。
10. １０．組成物がペプチドＹ（配列番号：８）を含むことを特徴とする請求の範囲 ８に記載の治療用組成物。
11. １１．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配列番号：８）、ペ プチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列 番号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群より選ばれる少なく とも２つのペプチドを含むことを特徴とする請求の範囲８に記載の治療用組成物 。
12. １２．組成物がペプチドＸ（配列番号：７）及びペプチドＹ（配列番号：８）を 含むことを特徴とする請求の範囲１１に記載の治療用組成物。
13. １３．治療的有効量の請求の範囲７に記載の組成物を患者に投与することを含む 、患者におけるフェリスドメスチクスに対する感受性の処置の方法。
14. １４．治療用組成物を皮下投与することを特徴とする請求の範囲１３に記載の方 法。
15. １５．治療用組成物を溶解性の形態で投与することを特徴とする請求の範囲１３ に記載の方法。
16. １６．治療的有効量の請求の範囲８に記載の組成物を患者に投与することを含む 、患者におけるフェリスドメスチクスに対する感受性の処置の方法。
17. １７．治療用組成物を皮下投与することを特徴とする請求の範囲１６に記載の方 法。
18. １８．治療用組成物を溶解性の形態で投与することを特徴とする請求の範囲１６ に記載の方法。
19. １９．治療的有効量の請求の範囲１２に記載の組成物を患者に投与することを含 む、患者におけるフェリスドメスチクスに対する感受性の処置の方法。
20. ２０．治療用組成物を皮下投与することを特徴とする請求の範囲１９に記載の方 法。
21. ２１．治療用組成物を溶解性の形態で投与することを特徴とする請求の範囲１９ に記載の方法。
22. ２２．それぞれペプチドＸ（配列番号：７）、ペプチドＹ（配列番号：８）、ペ プチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番号：１０）、ペプチドＢ（配列 番号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４）から成る群より選ばれるペプチ ドを少なくとも１つ含み、それぞれ製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤を含む 少なくとも２つの治療用組成物を治療的有効量で患者に投与することを含む、患 者におけるフェリスドメスチクスに対する感受性の処置の方法。
23. ２３．治療用組成物の１つがペプチドＸ（配列番号：７）を含み、治療用組成物 の１つがペプチドＹ（配列番号：８）を含むことを特徴とする請求の範囲２２に 記載の方法。
24. ２４．各組成物を溶解性の形態で投与することを特徴とする請求の範囲２２に記 載の方法。
25. ２５．タンパク質抗原に感受性の患者の集団の実質的パーセンテージにおいてそ のような患者のタンパク質抗原に対する応答を実質的に減少させるのに十分なパ ーセンテージで該タンパク質抗原のＴ細胞エピトープを含み、但し全タンパク質 抗原を含まないペプチドを少なくとも１つ含み、タンパク質抗原に対する免疫応 答が含まれる疾患の処置に有用な治療用組成物。
26. ２６．該タンパク質抗原に対するそのような患者のＴ細胞の応答が実質的に減少 することを特徴とする請求の範囲２５に記載の治療用組成物。
27. ２７．タンパク質抗原がアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲２５に記 載の治療用組成物。
28. ２８．該治療用組成物が少なくとも２つの組成物を含むことを特徴とする請求の 範囲２５に記載の治療用組成物。
29. ２９．タンパク質抗原に由来するペプチド及び製薬学的に許容し得る担体を含む 治療用組成物を、タンパク質抗原に対する哺乳類のＴ細胞の耐性化に有効な量で 哺乳類に皮下投与することを含み、ペプチドがタンパク質抗原のＴ細胞エピトー プを少なくとも１つ含むことを特徴とする、タンパク質抗原に対する免疫応答が 含まれる疾患の処置の方法。
30. ３０．哺乳類がヒトであることを特徴とする請求の範囲２９に記載の方法。
31. ３１．タンパク質抗原がアレルゲンであることを特徴とする方法。
32. ３２．アレルゲンがデルマトファゴイデス属、フェリス属、アンブロシア属、ロ リウム属、クリプトメリア属、アルテルナリア属、アルデル属、ベツラ属、オウ エルクス属、オレア属、アルテミシア属、プランタゴ属、パリエタリア属、カニ ス属、ブラテラ属、アピス属及びペリプラネタ属から成る群より選ばれる属から のものであることを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。
33. ３３．アレルゲンがＤｅｒ　ｐ　Ｉ：Ｄｅｒ　ｆ　Ｉ：Ｄｅｒ　ｆ　ＩＩ：Ａｍ ｂ　ａ　Ｉ：Ａｍｂ　ａ　ＩＩ：Ｌｏｌ　ｐ　Ｉ：Ｌｏｌ　ｐＩＸ：Ｃｒｙ　ｊ 　Ｉ：及びＣｒｙｊＩＩから成る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲３ ２に記載の方法。
34. ３４．ペプチドの免疫グロブリンＥ刺激活性が最低であることを特徴とする請求 の範囲３１に記載の方法。
35. ３５．ペプチドの免疫グロブリンＥへの結合の程度が、それが由来するタンパク 質アレルゲンの該免疫グロブリンＥへの結合の程度より実質的に低いことを特徴 とする請求の範囲３１に記載の方法。
36. ３６．ペプチドが、それが由来するタンパク質アレルゲンに特異的な免疫グロブ リンＥに結合しないか、あるいは該免疫グロブリンへのペプチドの結合が起こる 場合はそのような結合により該タンパク質アレルゲンに感受性の患者の実質的パ ーセンテージにおいて肥満細胞又は好塩基性細胞からの媒介物の放出が起こらな いことを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。
37. ３７．ペプチドがそれぞれ図３に示されているペプチドＸ（配列番号：７）、ペ プチドＹ（配列番号：８）、ペプチドＺ（配列番号：９）、ペプチドＡ（配列番 号：１０）、ペプチドＢ（配列番号：１１）及びペプチドＥ（配列番号：１４） から成る群より選ばれることを特徴とする請求の範囲３１に記載の方法。
38. ３８．タンパク質抗原が自己抗原であることを特徴とする請求の範囲３０に記載 の方法。
39. ３９．自己抗原がインスリン、ミェリン塩基性タンパク質、ｒｈ因子、アセチル コリンレセプター、甲状腺細胞レセプター、基底膜タンパク質、甲状腺タンパク 質、ＰＭ−１、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（６４Ｋ）及びカルボキシペプ チダーゼＨから成る群より選はれることを特徴とする請求の範囲３８に記載の方 法。
40. ４０．自己抗原がヒトミエリン塩基性タンパク質であり、ペプチドが基本的にヒ トミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸残基８４−１０６を含むことを特徴とす る請求の範囲３８に記載の方法。
41. ４１．自己抗原がヒトミエリン塩基性タンパク質であり、ペプチドが基本的にヒ トミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸残基８９−１０１を含むことを特徴とす る請求の範囲３８に記載の方法。
42. ４２．自己抗原がヒトミエリン塩基性タンパク質であり、ペプチドが基本的にヒ トミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸残基１４０−１７２を含むことを特徴と する請求の範囲３８に記載の方法。
43. ４３．自己抗原がヒトミエリン塩基性タンパク質であり、ペプチドが基本的にヒ トミエリン塩基性タンパク質のアミノ酸残基１４３−１６８を含むことを特徴と する請求の範囲３８に記載の方法。
44. ４４．組成物を可溶性の形態で投与することを特徴とする請求の範囲３０に記載 の方法。