CN1057915C

CN1057915C - 免疫佐剂

Info

Publication number: CN1057915C
Application number: CN94115186A
Authority: CN
Inventors: 柳钟勋; 左增艳; 林赴田; 于锋; 宋坤改; 许津
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Shandong Dayin Marine Biotechnological Pharm Holdings Co., Ltd.
Priority date: 1994-09-19
Filing date: 1994-09-19
Publication date: 2000-11-01
Anticipated expiration: 2014-09-19
Also published as: CN1109356A

Abstract

本发明属来源于植物材料的药物制品领域。从传统中草药伞形科植物，当归[Angelica Sinensis (Oliv) Diels，ASD]中分离，提取及制备的免疫佐剂有效成份，内酯类(ASDE系列)，作为免疫佐剂。多糖类(ASDP)，作为疫苗与免疫佐剂的载体，并制备成复合免疫佐剂(ASDP/ASDE)合用，能明显增强疫苗的免疫原性，毒性很小，对机体免疫功能有广泛的调节作用，免疫佐剂性效果明显优于至今唯一人用的疫苗佐剂氢氧化铝胶，同时也可以用作免疫治疗剂。

Description

免疫佐剂

本发明属来源于植物的药物制品领域。

目前临床上应用的疫苗用免疫佐剂(Immunological Adjuvant)为氢氧化铝胶(Alum)。它从30年代起始用，现已有60多年历史了。其优点：(1)对传统疫苗免疫佐剂性效果较好；(2)毒性小；(3)生产成本不高。但随着新型疫苗(如DNA重组疫苗，合成肽疫苗)的问世，Alum则存在着一些无法克服的缺点：1.对某些新型疫苗(如流感疫苗)无免疫佐剂性效果；2.Alum制备过程，质量控制难以标化；3.不能诱生机体的细胞免疫反应；4.批与批之间免疫佐剂性效果波动大，重复性差等等。因此，近十余年来，各国科研工作者，采用了不同来源及途径，研制了一系列新免疫佐剂，但由于效果差或毒性大等原因，至今仍无一种新型免疫佐剂，能用作人类疫苗的免疫佐剂。在新型疫苗研究及开发中最大的，共同的问题之一是免疫原性很低，单独使用很难使机体产生有保护作用的免疫应答。新型免疫佐剂与新型疫苗合用，是传统的、行之有效的、提高疫苗免疫原性的手段和策略。因此，新型免疫佐剂就成为新型疫苗的必不可少的组成成分。美国专利US4,843,067只提出增强免疫功能的一个次要成份为ASD多糖，用于免疫治疗，其主要成份为黄芪多糖对免疫功能起增强作用，治疗人的免疫功能低下如老龄等，其分离提取制备方法与本发明完全不一样。

本发明的目的是研制出了佐剂性效果好、毒性小，优于现用的氢氧化铝胶的新免疫佐剂。新型免疫佐剂与相应的疫苗(即抗原)结合，组成最佳的配方，即形成免疫刺激复合物，才能最好的发挥其免疫佐剂性效果。

本发明的主要内容为，从传统中草药伞形科植物当归[Angelica Sinen-sis(Oliv)Diels]即ASD中分离提取及制备多糖部分ASDP作为疫苗和佐剂的载体，ASDP本身也有免疫生物活性。内酯部分ASDE1-8，主要用ASDE，8个部分可单独用也可以合用，作为免疫佐剂。并且将两部分按一定比例混合制备成复合免疫佐剂，ASDP/ASDE，再分别与相关抗原如乙肝血原疫苗，乙肝基因工程疫苗(r-HBsAg)等合用(作为实验组)，以Alum作为对照，用多项指标，检测了免疫佐剂性效果。研究结果显示AS-DP/ASDE，在实验动物体内，能明显增强乙肝血原疫苗及乙肝基因工程疫苗免疫原性(Immunogenicity)，其抗原的半有效量(ED₅₀)，实验组较对照组一般要低3～4倍，研究过程中，未见毒副作用；同时还有诱导和增强机体的细胞免疫、细胞因子等广泛的免疫调节作用。从广义免疫佐剂来讲，ASDP/ASDE是免疫调节剂(Immunomodulator)，既可用于免疫预防(Im-munoprophylaxis)也完全可以用作免疫治疗。(Immunotherapy)

1免疫佐剂，内酯类物质，ASDE系列(ASDE_1-8)，其特征在于从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis(Oliv)Diels]即ASD中分离、提取及制备的内酯类物质：

a、伞形料传统中草药当归生药(Angelica Sinensis(Otiv)Diels ASD)，用粉碎机粉碎。

b、加95％乙醇，等体积，60℃，抽提3次，每次1小时。

c、乙醇提取物合并、减压浓缩去有机溶媒。

d、乙醇提取后不溶物，晾干，备用。

e、乙醇提取物柱层析：(1)柱层析：100×3CM，(2)硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂产品，300克，(3)上样品量与硅胶比为1∶50(w/w)，(4)洗脱液乙酸乙酯∶环已烷5∶95～20∶80(v/v)，(5)流速2ml/分，洗脱液按每份100ml收集，(6)同时用硅胶GF254(TLC)，扩展系统，乙酸乙酯∶环已烷(1∶5，v/v)测Rf值，经三用紫外分析仪，波长2537A检测ASDE_2-a，3650A检测ASDE_1-2；(7)根据检测波长，洗脱时间及Rf值不同，相同的收集液，合并、减压浓缩，依次分别得到ASDE内酯类系列ASDE_1-2；AS-DE₁洗脱时间1小时，Rf值0.70，ASDE₂洗脱时间1-2小时，Rf值0.61，ASDE₂洗脱时间2.5-3小时，Rf值0.51，ASDE₄洗脱时间3-3.5小时，Rf值0.41，ASDE₃洗脱时间3.5-4.5小时，Rf值0.20，ASDE₆洗脱时间4.5-5.0小时，Rf值0.17，ASDE₇洗脱时间5-5.5小时，Rf值0.06，AS-DE₈洗脱时间5.5-6.5小时，Rf值0；

f、ASD_1-8这八个部分，均有免疫佐剂活性，实验中一般用ASDE₃；

g、ASDE_1-8部分经TLC谱，紫外及红外光谱等分析，符合内酯类物质。

2、疫苗及佐剂载体，多糖类物质，ASDP，其特征在于从传统中草药ASD中分离、提取及制备多糖类物质。

a、ASD经乙醇抽提之后的不溶物，称重；

b、加等体积的蒸馏水PH7.0，60℃，抽提1小时。

c、水提取物，减压浓缩。

d、水提浓缩物，加1/10体积的氯仿∶正丁醇(4∶1)，振荡5分钟后，过滤；

e、滤液，减压浓缩。

f、加入2倍体积乙醇，振荡5分钟后过滤；

g、沉淀物用乙醇洗三次；

h、沉淀物洗过后，冷冻、干燥，得ASDP样品；

i、ASDP样品经TLC谱，紫外光谱及红外光谱(有明显的一OH基，-CH₂基峰)等理化性质分析，符合多糖类物质。

3、复合免疫佐剂，即ASD/ASDE，其特征在于，其中的免疫佐剂是由ASD中制备的ASDE系列，通常多用ASDE₃，疫苗及免疫佐剂载体为由ASD中制备的ASDP，分别称取ASDE及ASDP，按1∶2的重量比例混合后，制备成复合免疫佐剂ASDP/ASDE，再按所需要的剂量与相关抗原合用。

4、复合免疫佐剂的用途，其特征在于制备乙肝基因工程疫苗免疫佐剂(Immunoadjuvant)的免疫调节剂(Immunomodulator)的用途。

ASDP/ASDE₃的免疫佐剂性评价：

1、ASDP/ASDE₃的免疫佐剂性

用ASDP/ASDE₃分别与乙肝血源疫苗、乙型肝炎基因工程疫苗合用，免疫小鼠，6周后分离血清，，用固相放射免疫法(RIA Kit)，测定小鼠血清阳转数、血清阳转率、S/N比值及RIA参考单位，实验组较对照组均有明显增高。抗原半有效量(ED₃₀)，对照组比实验组高3倍以上。(表1)

2、免疫佐剂ASDE_1-8中，有效部分合用，对增强抗原免疫原性有协同作用。(见表3)

3、抗HB₈抗体阳性的小鼠血清，实验组与对照组同时对倍稀释，分别测各稀释血清的抗体水平，结果表明，实验组血清抗HB₃抗体水平较对照组高20倍以上。(图1)

4、ASDP/ASDE₃及Alum分别作为佐剂，作量效反应曲线试验，结果表明，ASDP/ASDE₂有效剂量的范围较宽，小鼠从120/64mg/Kg到2/1mg/Kg。(图2)

5、ASDP/ASDE₂对小鼠的单核巨噬细胞系统的功能，细胞免疫及多种细胞因子的活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASDP/ASDE₃作为免疫佐剂的免疫生物学基础，同时也是作为免疫治疗剂的免疫生物学基础。

6、ASDP/ASDE₂对流行性出血热灭活疫苗、乙肝血源疫苗等都能提高它们的免疫原性。

7、ASDP/ASDE₂毒理学研究结果表明，毒性很低，用小鼠及大鼠，4种佐剂样品，测定其急性毒性(LD₅₀)，未见急性毒性反应(表2)；ASDP/AS-DE₃局部用药的刺激性试验；用多种途径，多次用药后，再经肉眼及组织学观察，均未见病理性反应及组织损害(表4)；用小鼠及豚鼠的I型变态反应试验表明ASDP/ASDE₂不是I型变态反应的过敏原(表5及表6)。AS-DP及ASDE系列(即ASDE_1-8的有效成分)的理化性质及初步鉴别：(1)ASDP经薄层层析，紫外光谱及红外光谱等特性的分析，认为是多糖类物质(图3、图4、图5)(2)ASDE系列即ASDE_1-8共8个有效成分，经薄层层析，紫外光谱及红外光谱特性的分析，认为它们都是内酯类物质(图3、图6、图7)。

本发明的优点和积极效果：主要优点是由多糖类(ASDP)作载体，对HBsAg免疫佐性剂性效果明显优于现用的氢氧化铝胶(Alum)，毒副作用很小，ASDP及ASDE₃对实验动物单核巨噬细胞系统，T淋巴细胞，细胞因子，B淋巴细胞的免疫生物学活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASD/ASDE₃作为佐剂多效用性的免疫生物学基础，ASDP/ASDE₈已初步试用于其它疫苗，也有很好的免疫佐剂效果。同时也可作为免疫调节剂用于免疫治疗。本发明药源充足，制备流程方法的稳定性重复性好，可行性强。ASDP/ASDE₂本质为免疫调节剂(Immunomodulators)与抗原(疫苗)合用，用于免疫预防(Immunoprophylaxis)，能明显降低抗原的有效剂量，提高预防接种效果，特别对昂贵的新型疫苗来说，ASDP/ASDE₃如能在大面积人群推广使用，定会取得可观的社会效益和经济效益。

附图说明：

图1为免疫佐剂ASDP/ASDE₃与阳性对照佐剂氢氧化铝胶(Alum)，分别与乙型肝炎血源疫苗及乙型肝炎基因工程疫苗合用，分离小鼠血清后进行稀释，比较抗HBs抗体的滴度水平，横座标为稀释度，纵坐标为cpm均值(×10³)，曲线1为r-HBsAg/ASDp/ASDE₈，曲线2已知抗HBs抗体阳性对照血清，曲线3为r-HBsAg/Alum(阳性佐剂对照)，曲线4为已知抗HBs抗体阴性对照血清。图1表明复合免疫佐剂抗HB₈抗体水平，较阳性对照佐剂Alum高20倍以上。

图2为ASDP/ASDE₈免疫佐剂性剂量反应曲线图。横坐标为AS-DP/ASDE₃，浓度mg/kg，纵坐标A，为cpm×均值(×10³)结果见曲线5，(对照Al(OH)₃为2.5×10³)。纵坐标B，为血清阳转率(％)，结果见曲线6，(Al(OH)₃为67％)。纵坐标C，为样品cpm值与已知阴性血清cpm值比值(S/N)，结果见曲线7(Al(OH)，为28)。

图3为ASDE佐剂系列即ASDE_1-8及ASDP的薄层层析(TLC)图谱，扩展溶媒为乙酸乙酯∶环已烷(20∶80，v/v)，显迹，是用紫外线分析仪。

图4为ASDP紫外光谱图(UV)，曲线8为ASDP呈末端吸收，符合多糖类紫外光谱，曲线9为小牛血清蛋白280mm有吸收峰。

图5为ASDP红外光谱图(IR)，曲线10呈糖类典型羟基(一OH)峰。

图6为ASDE系列(ASDE_1-8)紫外光谱图，曲线11-18，ASDE_1-8UV相似。

图7为曲线19，20分别为ASDE₂、ASDE₃红外光谱图，均有典型羰基(-c＝0)吸收峰(1200-1800nm)符合内酯类化学物质。

图8为ASDE_1-8及ASDP的分离提取及制备流程图。

本发明的最佳实施例

1、ASDE系列(ASDE_1-8内酯类)的分离、提取、制备；

a、ASD100克加95％乙醇100ml，60℃振荡，提取三次。

b、乙醇提取物合并，减压浓缩成20ml。

c、硅胶柱层析，层析柱100cm×3.0cm。

d、上述样品与硅胶比为1∶50(W/W)。

e、先后用乙酸乙酯-环己烷5∶95～20∶80(v/v)，洗脱，流速2ml/分。

f、梯度洗脱，分部收集之洗脱液，经薄层层析，扩展溶媒系统，乙酸乙酯∶环己烷(1∶5，v/v)，紫外检测，波长2537A检测ASDE_3-8部分，3650A检测ASDE_1-2部分，并测出各部分Rf值(附图3)

g将理化性质相同的洗脱液，分别合并，减压，浓缩。

h可得到ASDE_1-8，其中ASDE₃为0.3克。

2、ASDP(多糖类)分离、提取、制备：

a、ASD经提取过ASD系列后的乙醇不溶物，晾干称重100克，

b、加pH7之蒸馏水100ml，

c、60℃提抽三次，

d、水提取收集，合并，减压浓缩，

e、浓缩液加氯仿∶正丁醇4∶1，沉淀，过滤，

f、取上清液加三倍乙醇沉淀过滤，

i、取沉淀用乙醇洗三次，

j、沉淀物，经冷冻干燥，可得ASDP₃克。

3、免疫刺激复合物即抗原+载体(ASDP)-佐剂(ASDE_1-8)的制备：

按2∶1比例(w/w)混合，振荡5分钟，制备成复合免疫佐剂，然后再与所试的抗原(疫苗)混合，轻轻振荡30分钟，在室温放置2-3小时后，制备成免疫刺激复合物，即可免疫实验动物。

表1. 免疫佐剂ASDP/ASDE₃的免疫佐剂性

乙肝表面抗免疫佐剂剂量原(HBsAg) 血清阳血清阳 S/N RIA ED₅₀ P值

mg/kg 微克/鼠转数转率％AL(0H)₃ 100 1.25 7/7 100 13.7 560 0.363(对照) 0.3125 3/7 43 0.8 ＜8

0.078 0/7 0 0 0ASDP/ASDE₃60/30 1.25 7/7 100 32.9 1820 0.118 ＜0.01

0.3125 7/7 100 12.7 551

0.078 2/6 33 6.0 22

*小鼠 BALB/C 雄性三周龄，8-10克

样品用50％小牛血清1∶5稀释

表2. ASDP/ASDE的急性毒性(CD₅₀)

小鼠 (mg/kg) 大鼠 (mg/kg)免疫佐剂 S.C. I.H. I.V S.C.ASDE₂ ＞4000 ＞800 ＞800ASDP/ASDE₂ ＞2000 ＞200 100ASDE₃ ＞4000 ＞1600 ＞640ASDP/ASDE₃ ＞2000 ＞800 200

表3. ASDE各有效组分合用对HBsAg免疫原性的影响

剂量 ASDE HBsAg 血清阳血清阳样品cpm RIA免疫佐剂 mg/kg 组分微克/鼠转数转率(％) 阳性血清cpm 单位 P值AL(OH)₃ 100 1.25 7/7 100 13.7 560ASDP/ASDE 60/30 3 1.25 7/7 100 32.9 1820 ＜0.01ASDP/ASDE 60/30 2，3 1.25 6/7 86 25.2 1460 ＜0.01ASDP/ASDE 60/30 3，4 1.25 5/6 83 43.4 ＞2560 ＜0.05ASDP/ASDE 60/30 3.4，5 1.25 7/7 100 35.6 2000 ＜0.01ASDP/ASDE 60/30 3，4，5，6 1.25 7/7 100 27.2 1400 ＜0.01

表4. ASDP/ASDE₃局部用药试验

局部刺激性观察给药部位药物浓度给药次数肉眼观察组织学镜检家兔正常皮肤 10mg/ml 每日四次 --- ---

给药一周家兔损伤皮肤 10mg/ml 每日四次 --- ---

给药一周家兔肌肉皮肤 10mg/ml 每日四次 --- ---*

给药一周家兔眼结膜 10mg/ml 每日四次 --- ---

给药一周生理盐水(对照) 10mg/ml 每日四次 --- ---

给药一周

*轻度炎症细胞浸润

---表示阴性反应

表5. ASDP/ASDE₃ I型变态反应试验组别豚鼠数性别给药途径致敏剂量ml 攻击剂量ml 观察结果阴性对照 5 ♂ I.V. 1.0 1.0 ---(生理盐水)阳性对照 5 ♂ I.V. 1∶10 腰液 4只过敏休克死亡(马血清) 1.0 1.0 1只严重过敏反应实验组 5 ♂ I.V. 2/4mg/ml 4/8mg/ml ---(ASDP/ASDE₃) 1.0 1.0

*致敏14天后给药

---表示阴性反应

表6. ASDP/ASDE₃I型变态反应试验组别小鼠数动物性别致敏给药攻击给药观察结果

途径剂量ml 途径剂量ml阴性对照 7 ♂ S.C. 0.1 I.V. 0.1 ---(生理盐水)阳性对照 7 ♂ S.C. 1∶10 I.V. 原液抓地腹贴地爬(马血清) 0.1 0.1 卷缩，竖毛，无力

呼吸急促困难ASDP/ASDE 7 ♂ S.C. 4/8mg/ml I.V. 4/8mg/ml ---

0.1 0.1

*致敏14天后攻击给药； --表示阴性反应

Claims

1、一种乙肝基因工程疫苗免疫佐剂一内酯类物质，ASDE系列即AS-DE_1-8，其特征在于它是从传统中草药伞形科植物当归中，按下述方法分离、提取的内酯类物质，

a、伞形科传统中单药当归，用粉碎机粉碎；

b、加95％乙醇，等体积，60℃，抽提3次，每次1小时；

c、乙醇提取物合并、减压浓缩去有机溶媒；

d、乙醇提取后不溶物，晾干，备用；

e、乙醇提取物柱层析：(1)柱层析：100×3CM，(2)硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂产品，300克，(3)上样品量与硅胶比为1∶50(w/w)，(4)洗脱液乙酸乙脂：环乙烷5∶95～20∶80(v/v)，(5)流速2ml/分，洗脱液按每份100ml收集，(6)同时用硅胶GF254(TLC)，扩展系统，乙酸乙酯∶环乙烷1∶5(V/V)测Rf值，经三用紫外分析仪，波长2537A检测ASDE_3-8，3650A检测ASDE_1-2；(7)根据检测波长，洗脱时间及Rf值不同，相同的收集液，合并、减压浓缩，依次分别得到ASDE内酯类系列ASDE_1-8：ASDE₁洗脱时间1小时，Rf值0.70，ASDE₂洗脱时间1-2小时，Rf值0.61，ASDE₃洗脱时间2.5-3小时，Rf值0.51，ASDE₄洗脱时间3-3.5小时，Rf值0.41，AS-DE₅洗脱时间3.5-4.5小时，Rf值0.28，ASDE₆洗脱时间4.5-5.0小时，Rf值0.17，ASDE₇洗脱时间5-5.5小时，Rf值0.60，ASDE₈洗脱时间5.5-6.5小时，Rf值0。

2、一种乙肝基因工程疫疫苗及佐剂载体一多糖类物质，即ASDP，其特征在于它是由传统中草药当归中，按下述方法分离、提取的多糖类物质：

a、当归经乙醇抽提之后的不溶物，称重；

b、加等体积的蒸镏水PH7.0，60℃，抽提1小时；

c、水提取物，减压浓缩；

d、水提浓缩物，加1/10体积的氯仿∶正丁醇4∶1，振荡5分钟后，过滤；

e、滤液，减压浓缩；

f、加入2倍体积乙醇，振荡5分钟后过滤；

g、沉淀物用乙醇洗三次；

h、沉淀物洗过后，冷冻、干燥、得ASDP样品。

3、一种复合免疫佐剂，其特征在于其中的免疫佐剂是权利要求1的内酯类物质，即ASDE；疫苗及免疫佐剂的载体是权利要求2的多糖类物质，即ASDP；将ASDP和ASDE按2∶1的重量比例混合后制成。

4、权利要求3的复合免疫佐剂，其特征在于其中的ASDE是如权利要求1中所述的ASDE₃。

5、一种免疫刺激复合物，其特征在于由抗原、载体和佐剂组成，其中所述载体是权利要求2的多糖类物质，即ASDP；所述佐剂是权利要求1的内酯类物质，即ASDE_1-8；该免疫刺激复合物通过将权利要求3的复合免疫佐剂与抗原混合，轻轻振摇30分钟，在室温放置2-3小时后制成。

6、权利要求5的免疫刺激复合物，其特征在于其中的抗原是乙肝基因工程疫苗。