CN111548389B - 一种免疫增强剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种免疫增强剂及含该免疫增强剂的猪口蹄疫疫苗组合物与应用。所述免疫增强剂由序列表中序列3所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽、或者序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组合的多肽组合物组成。所述猪口蹄疫疫苗组合物包含免疫增强剂和猪口蹄疫抗原。所本发明的免疫增强剂可通过固相化学合成方法进行大量制备,与灭活抗原以一定比例混合,便于规模化的生产制备疫苗组合物,该疫苗组合物既可诱导机体产生体液免疫应答水平,也可增强机体的细胞免疫应答水平,且可获得较好的免疫效果。本发明的免疫增强剂安全、可靠,具有广阔的应用前景。
Description
本申请是申请号为“2018100038990”,发明名称为“一种免疫增强剂及其应用”的专利申请的分案申请
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域,具体地说,本发明涉及一种免疫增强剂及含该免疫增强剂的猪口蹄疫疫苗组合物与应用。
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease virus,FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触传染性和快速远距离传播的烈性传染病,以传染性强、疾病传播速度快、危害严重而著称,该病的暴发流行给发表地区的畜牧业造成巨大的经济损失(常慧云,2017)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一,我国将其列为一类动物传染病。
口蹄疫传染性高,传播迅速,感染猪、牛、羊等牲畜后常导致幼畜的死亡,成年动物感染后生长能力急剧下降。该病传播速度迅速,可以引起世界性的大流行,不仅对畜牧业造成巨大的经济损失,而且严重的影响动物及其畜产品的国际贸易和声誉。
FMDV属于小RNA病毒科,为单股正链RNA病毒,因其基因组具有高度的变异性,导致FMDV不断进化产生新的病毒亚型,给FMD的防控与净化带来了困难。FMD是关系到国家经济安全的重大动物疫病。目前,大多数发展中国家和地区都通过接种灭活疫苗的方法来控制FMD的流行,而传统的灭活疫苗主要诱导机体产生体液免疫应答,缺少细胞免疫应答。此外,随着抗原纯化技术的不断革新,FMD亚单位疫苗、病毒样颗粒(VLP)疫苗以及合成肽疫苗等新型疫苗的将大量出现,疫苗的安全性虽然得到了提高,但其免疫原性往往不理想,缺乏均衡的体液免疫应答和细胞免疫应答,因此需要开发更为安全高效的免疫增强剂以提高疫苗的细胞免疫应答水平。
抗原表位是指抗原可与T细胞受体、B细胞受体或抗原结合片段发生特异性的结合,具有特殊结构和免疫活性的化学基团,是引起免疫应答的物质基础。相比于FMD的B细胞表位、Th细胞表位,目前对于细胞毒性T细胞CTL表位的研究还较少,有研究证实FMDV特异性的CTL表位可诱导机体产生细胞性免疫应答,因此开发CTL表位的免疫增强剂对于细胞介导的抗FMDV免疫具有重要的应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫增强剂,以及含该免疫增强剂的猪口蹄疫疫苗组合物与应用。该猪口蹄疫疫苗组合物既能诱导机体产生体液免疫应答,又能增强机体产生细胞免疫应答,能获得较好的免疫效果。
本发明提供的免疫增强剂,由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合的多肽组合物组成。
当所述免疫增强剂由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的两种组成时,它们的重量分数比为0.5-1:0.5-1;
当所述免疫增强剂由序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成时;所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽的重量份数比为0.5-1:0.5-1:0.5-1。优选地,所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽的重量份数比为1:1:1。
其中,序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽,是用于免疫增强的多肽,也属于本发明的保护范围。
本发明提供的猪口蹄疫疫苗组合物,包括上述免疫增强剂。
具体的,所述疫苗组合物包含:
(1)上述免疫增强剂,
和,(2)猪口蹄疫抗原。
其中,所述疫苗组合物为免疫增强剂与猪口蹄疫疫苗的混合物。
所述猪口蹄疫抗原为猪口蹄疫灭活抗原、猪口蹄疫病毒样颗粒抗原、猪口蹄疫亚单位抗原或猪口蹄疫多肽抗原;其中,猪口蹄疫灭活抗原选自猪口蹄疫O型和A型疫苗毒株。优选地,所述猪FMDV灭活抗原选自猪O/Mya98/XJ/2010株、O/GX/09-7株、AF/72株、A/QH/09株中一种或两种以上任意组合的灭活病毒抗原,最优选为O/Mya98/XJ/2010株。
制备猪口蹄疫疫苗组合物时,将所述免疫增强剂与猪FMDV灭活抗原在缓冲液体系中进行孵育混合,缓冲液体系优选为含50mMNaCl的20mMTris-HCl(pH 8.0)溶液,所述孵育条件,优选为4℃孵育过夜。
优选地,所述猪口蹄疫疫苗组合物中,免疫增强剂和猪口蹄疫抗原的重量份数比可根据抗原种类、免疫剂量等确定,重量分数比具体可以为0.1-10:1、优选1-5:1。
在本发明的一个实施方式中,当抗原选择猪口蹄疫灭活抗原时,免疫增强剂与猪口蹄疫的重量分数比为3:1。
进一步的,所述猪口蹄疫疫苗组合物还包括兽医学上可接受的佐剂,本发明的另一目的在于提供一种猪口蹄疫疫苗组合物,包括所述免疫增强剂、猪口蹄疫抗原以及兽医学上可接受的佐剂。
本发明的猪口蹄疫组合物的免疫剂量可根据免疫猪的主要受被免疫动物的物种、品系、年龄、体重、健康状态等确定,比如,可以为1-300ug猪口蹄疫组合物/头份;如当上述的猪口蹄疫抗原为猪口蹄疫灭活抗原时,可根据灭活抗原的种类设置免疫剂量1-200ug猪口蹄疫抗原/头份猪。
在本发明的一个实施例中,猪口蹄疫灭活抗原为O/Mya98/XJ/2010株灭活抗原,猪口蹄疫组合物中猪FMDV灭活抗原的免疫剂量为10ug/头份,免疫增强剂的免疫剂量为30μg/头份。
本发明所用术语“猪口蹄疫疫苗组合物”是指可用于预防由猪FMDV感染所知症状或疾病的疫苗,该疫苗组合物可包括任何能够用于预防猪来自猪FMDV感染的疫苗。
本发明所述术语“免疫量”是指针对猪FMD疫苗组合物的免疫剂量,免疫剂量的大小主要受被免疫动物的物种、品系、年龄、体重、健康状态以及该动物之前是否已免疫过相同毒株的疫苗等因素影响。
本发明所述术语“佐剂”可包括油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、铝胶佐剂、皂苷或Gel佐剂中的一种或几种;优选地,所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂。所述佐剂与所述免疫增强剂和猪口蹄疫灭活抗原混合物的体积比为1:1。
本发明的免疫增强剂可通过固相化学合成方法进行大量制备,与灭活抗原以一定比例混合,便于规模化的生产,既可诱导机体产生体液免疫应答水平,也可增强机体的细胞免疫应答水平,且可获得较好的免疫效果。安全、可靠,具有更为广阔的应用前景。
附图说明
图1.免疫后第14天IFN-γ的ELISPOT试验结果
图2.免疫后第21天IFN-γ的ELISPOT试验结果
图3.免疫后第14天IFN-γ的ELISPOT试验结果
图4.免疫后第21天IFN-γ的ELISPOT试验结果
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解,这些实施例仅用于说明本发明,其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
本发明所用术语“CTL表位多肽”是指细胞毒性T细胞表位多肽(Cytotoxic TLymphocytesepitope,简称CTL表位多肽),靶抗原经抗原递呈细胞处理以“抗原肽-MHC-I类分子”复合物的形式呈现至抗原递呈细胞或靶细胞表面后可被CD8+T细胞识别,相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位多肽。CTL表位多肽能够激活诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞),诱导机体产生细胞性免疫应答。
本发明所用术语“CTL表位多肽”是指位于FMDV结构蛋白具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。
实施例1、CTL表位多肽的筛选
预测多肽免疫机体后,被MHCI类分子递呈的多肽抗原,可刺激机体产生记忆性T细胞。当多肽抗原再次刺激T细胞时,记忆性T细胞会诱导产生细胞因子。通过对细胞因子水平的检测以及利用生物学统计分析可对预测多肽是否为CTL表位多肽进行评价分析。
1.预测多肽:
由网站预测及化学合成10条预测多肽ZM1501~ZM15010,序列信息见序列表。利用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液分别溶解预测多肽,10条预测多肽均配制成浓度为1mg/ml溶液。各预测多肽根据免疫剂量为10μg/头份与61佐剂按1:1体积比进行混合免疫动物。
序列表中序列1为多肽ZM1501的氨基酸序列;
序列表中序列2为多肽ZM1502的氨基酸序列;
序列表中序列3为多肽ZM1503的氨基酸序列;
序列表中序列4为多肽ZM1504的氨基酸序列;
序列表中序列5为多肽ZM1505的氨基酸序列;
序列表中序列6为多肽ZM1506的氨基酸序列;
序列表中序列7为多肽ZM1507的氨基酸序列;
序列表中序列8为多肽ZM1508的氨基酸序列;
序列表中序列9为多肽ZM1509的氨基酸序列;
序列表中序列10为多肽ZM15010的氨基酸序列。
2.动物的免疫:
试验动物:6-7周龄健康易感仔猪,液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。
本发明采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒(兰州兽医研究所)检测液相阻断ELISA抗体滴度。
分离、提取猪PMBC,若猪只PMBC经某一条预测多肽刺激时可诱导产生较高的细胞因子,与对照组和其他预测多肽相比,统计分析差异显著,则该预测多肽为CTL表位多肽。如下表1:根据该表进行免疫分组。其中免疫多肽的含量是10μg/头份。免疫2次,在首次免疫后第14天进行第二次免疫。各组设置如表1所示。
表1、免疫分组及处理方法
组别 | 组名 | 抗原组成 | 抗原含量 | 佐剂 | 免疫方式 | 动物数 | 免疫剂量 |
第一组 | ZM1501 | ZM1501 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第二组 | ZM1502 | ZM1502 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第三组 | ZM1503 | ZM1503 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第四组 | ZM1504 | ZM1504 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第五组 | ZM1505 | ZM1505 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第六组 | ZM1506 | ZM1506 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第七组 | ZM1507 | ZM1507 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第八组 | ZM1508 | ZM1508 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第九组 | ZM1509 | ZM1509 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
第十组 | ZM15010 | ZM15010 | 10μg/头份 | 61佐剂 | 原倍5头 | 5 | 2ml |
对照组 | -- | -- | -- | -- | -- | 2 | -- |
(1)猪外周血单个核细胞(PBMC)的分离
a.免疫后分别在第14天、第21天前腔静脉采血法采集猪的新鲜血液,放入肝素抗凝的采血管中。
b.取10ml的新鲜血液,用pH 7.4PBS或0.9%NaCl按1:1比例稀释后,加到已复温至室温(20℃左右)的10ml猪淋巴细胞分离液上,加样时动作要轻柔,沿管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上。20℃,2000rpm(700g)离心20min。
c.离心后最上层为血浆和稀释液,管底为红细胞和粒细胞层,中层为淋巴细胞分离液(灰白色云雾层,该层主要为PBMC),吸取灰白色层,至一个10ml的试管中。2500rpm离心10min,弃上清。
d.加入5ml的RPMI 1640稀释,1500rpm、离心10min;重复此操作一次,尽量去除血小板和抗凝剂。细胞计数,用流式反应液调整细胞浓度为2×106个/mL待用。
(2)ELISPOT实验
步骤(1)中PBMC根据分组加入到预包被ELISPOT板中,设置阳性对照、阴性对照与空白对照。刺激物为10条预测多肽,根据试剂盒说明书进行操作,每条肽刺激的PBMC做2个复孔。多肽刺激PBMC后,以该组动物PBMC未经多肽刺激为对照,对各条多肽刺激产生的IFN-γ相比,经统计分析多肽间能显著增加动物的IFN-γ的蛋白水平,将此多肽判定为阳性表位肽。
(3)分析结果如下:
a.ELISPOT试验结果:如图1所示,图柱用a、b不同字母标注,字母相同表示统计分析差异不显著,字母不同表示统计分析差异显著。免疫后第14天,与对照组和其他预测多肽相比,多肽ZM1501、ZM1502或ZM1503刺激猪PBMC后,均能产生较高水平的IFN-γ,统计分析差异显著;如图2所示,免疫后21天,多肽ZM1501、ZM1502和ZM1503产生的IFN-γ高于均对照组和其他多肽,统计分析差异显著。
综上所述,通过对10条预测多肽的动物免疫试验筛选,最终获得ZM1501、ZM1502和ZM1503共计三条功能CTL表位多肽。这三条CTL表位多肽可作为免疫增强剂提高猪口蹄疫疫苗的免疫性。
实施例2、含CTL表位多肽疫苗组合物的应用
1.由实施例1中筛选获得3条功能CTL表位多肽:ZM1501、ZM1502和ZM1503,溶解于20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液。3条CTL表位多肽均配制成浓度为1mg/ml溶液。其中,
ZM1501序列:SADPVTATV(序列表中序列1)
ZM1501序列:ALDNTTNPT(序列表中序列2)
ZM1501序列:LM QTPSHTL(序列表中序列3)
根据免疫剂量和免疫分组取各CTL表位多肽或配制成混合溶液与含免疫剂量的O/Mya98/XJ/2010灭活抗原混合,4℃孵育过夜,获得的混合溶液与Montanide ISA 206佐剂混合制备得到猪口蹄疫疫苗组合物。
如表2所示,各组猪口蹄疫疫苗组合物的制备方法为:
1)灭活疫苗组:O/Mya98/XJ/2010灭活抗原溶解于20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液,制成1mg/ml溶液,取10ul,用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液稀释至1ml,然后与Montanide ISA 206佐剂按照体积比1:1混合。
2)免疫增强剂组1:将上述制备的1mg/mlZM1501多肽溶液,取30ul与10ugO/Mya98/XJ/2010灭活抗原混匀,用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液稀释至1ml,然后与Montanide ISA 206佐剂按照体积比1:1混合。
3)免疫增强剂组2:将上述制备的1mg/mlZM1502多肽溶液,取30ul与10ugO/Mya98/XJ/2010灭活抗原混匀,用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液稀释至1ml,然后与Montanide ISA 206佐剂按照体积比1:1混合。
4)免疫增强剂组3:将上述制备的1mg/mlZM1503多肽溶液,取30ul与10ugO/Mya98/XJ/2010灭活抗原混匀,用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液稀释至1ml,然后与Montanide ISA 206佐剂按照体积比1:1混合。
5)免疫增强剂组4:将上述制备的1mg/mlZM1501多肽溶液、1mg/mlZM1502多肽溶液、1mg/mlZM1503多肽溶液,各取10ul与10ugO/Mya98/XJ/2010灭活抗原混匀,用20mMTris-HCl(pH 8.0)、50mMNaCl缓冲溶液稀释至1ml,然后与Montanide ISA 206佐剂按照体积比1:1混合。
试验动物:6-7周龄健康易感仔猪,液相阻断ELISA抗体滴度≤1:8。
本发明采用口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒(兰州兽医研究所)检测液相阻断ELISA抗体滴度。
动物的免疫:
如下表2:根据该表进行免疫分组。其中灭活抗原10μg/头份和免疫增强剂的免疫含量均为30μg头份。免疫2次,首次免疫后第14天进行第二次免疫。灭活抗原为O/Mya98/XJ/2010灭活抗原。各组设置如表2所示。
表2、免疫分组及处理方法
(1)血清的分离和抗体水平的ELISA检测。
免疫后分别在第14天、21天、35天、49天、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月采血分离血清,进行抗体水平的检测。
(2)免疫后分别在第14天、第21天前腔静脉采血法采集猪的新鲜血液,根据实施例1中方法进行猪外周血单个核细胞(PBMC)的分离、ELISPOT试验。
(3)分析结果如下:
a.抗体水平检测结果:
如下表3所示:免疫后各时间点对抗体水平进行ELISA检测结果,免疫增强剂1-3组,猪只整体抗体水平和平均抗体水平略高于灭活疫苗组,但均低于免疫增强剂4组;免疫增强剂4组猪只整体抗体水平和平均抗体水平高于灭活疫苗组,且抗体持续时间较长,说明将3条多肽组合使用可明显增强机体针对灭活抗原的抗体水平。
表3、抗体水平检测结果
b.ELISPOT试验结果:如图3所示,免疫后第14天,图柱用a、b、c不同字母标注,字母完全相同表示统计分析差异不显著,含一个字母相同表示统计分析差异显著。字母完全不同表示统计分析差异极显著。免疫增强剂1-4组猪PBMC经灭活抗原刺激后,产生的IFN-γ高于灭活疫苗组,统计分析差异显著;而免疫增强剂1-3组均低于免疫增强剂4组,统计分析差异不显著;如图4所示,免疫后21天,各组产生的IFN-γ整体水平提高,免疫增强剂1-4组高于灭活疫苗组,统计分析差异显著;而免疫增强剂1-3组均低于免疫增强剂4组,统计分析差异不显著;由ELISPOT试验结果说明,3条CTL表位多肽组合使用可增强灭活疫苗的细胞因子水平。
综上,通过对预测多肽的筛选,获得3条CTL表位多肽;通过对CTL表位多肽与灭活疫苗的组合应用,含3条CTL表位多肽的免疫增强剂对口蹄疫灭活疫苗的免疫效力有明显的提高作用,可提高疫苗的细胞免疫水平及抗体水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本发明相关技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提条件下,还可以做出若干改进和修饰,这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中牧实业股份有限公司
<120> 一种免疫增强剂及其应用
<130> WHOI201025
<170> Patent-In 3.5
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<212>PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400>5
Lys Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met
1 5 10
<210> 6
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400>6
Lys Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu
1 5
<210> 8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
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1 5
<210> 9
<211>9
<212>PRT
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Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu
1 5
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<211> 10
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial sequence)
<400>10
Lys Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu
1 5 10
Claims (12)
1.一种用于免疫增强的多肽,为序列表中序列3所示的多肽或序列表中序列2所示的多肽。
2.权利要求1所述的多肽在制备猪口蹄疫疫苗的免疫增强剂中的应用。
3.一种免疫增强剂,由序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽组成,它们的重量分数比为1:1。
4.权利要求3所述的免疫增强剂在制备猪口蹄疫疫苗组合物中的应用。
5.一种猪口蹄疫疫苗组合物,所述疫苗组合物包含:
1)权利要求3所述的免疫增强剂;
2)猪口蹄疫抗原。
6.根据权利要求5所述的猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述猪口蹄疫疫苗组合物还包括兽医学上可接受的佐剂。
7.根据权利要求6所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂为油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述佐剂为Montanide ISA206佐剂。
9.根据权利要求5-8中任一项所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述猪口蹄疫抗原选自猪口蹄疫灭活抗原、猪口蹄疫病毒样颗粒抗原、猪口蹄疫亚单位抗原或猪口蹄疫多肽抗原中的一种或两种以上任意组合。
10.根据权利要求9所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,猪口蹄疫灭活抗原为猪口蹄疫O型或A型疫苗毒株。
11.根据权利要求10所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述猪口蹄疫灭活抗原选自猪O/Mya98/XJ/2010株、O/GX/09-7株、AF/72株、A/QH/09株中的一种或两种以上任意组合的灭活病毒抗原。
12.根据权利要求11所述猪口蹄疫疫苗组合物,其特征在于,所述猪口蹄疫灭活抗原为O/Mya98/XJ/2010株的灭活病毒抗原。
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