CN105999290A - 一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，以生物内源性磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)作为膜材，对抗炎药物姜黄素进行包载，制备PS修饰的姜黄素纳米粒靶向递药系统；其能够通过模拟凋亡细胞，被巨噬细胞表面的特异性受体识别，借助受体介导的巨噬细胞主动靶向作用，增强巨噬细胞摄取；药物姜黄素进入巨噬细胞后，发挥其抗炎作用，同时PS载体被摄取后还会诱导巨噬细胞产生抗炎反应，即致炎细胞因子释放减少，抗炎因子分泌增加，达到药物和载体协同抗炎的效果；该磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒可用于治疗巨噬细胞介导的相关疾病的药物应用。

Description

一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，能够特异性靶向到巨噬细胞，并发挥药物与载体的协同抗炎疗效，用以治疗巨噬细胞介导的相关疾病。
背景技术
目前研究发现，众多疾病均与炎症反应相关，如动脉粥样硬化、癌症、糖尿病、风湿性关节炎等，需要应用抗炎药物进行治疗。巨噬细胞作为机体的主要免疫细胞，在这些炎症疾病中发挥着重要的作用，可促进致病性炎症反应，是很多抗炎药物的靶细胞。采用新型的靶向递药系统将抗炎药物靶向至巨噬细胞，能够提高抗炎药物的疗效并降低其毒副作用。因此，开发一种可特异性靶向巨噬细胞的抗炎药物制剂具有较高的应用价值。
姜黄素是从姜科植物姜黄根茎中提取出的一种天然多酚类物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、预防和缓解糖尿病并发症等多种药理活性，但其溶解性差、易光解、体内代谢快等缺点大大限制了其临床应用。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)是一种带负电荷的阴性磷脂，大量存在于凋亡细胞的外膜，能高效识别巨噬细胞上的受体而实现巨噬细胞靶向性，凋亡细胞可被巨噬细胞快速有效清除，抑制炎症和自身免疫反应的发生。基于生物内源性的PS对巨噬细胞的靶向作用，有望开发一种以其为膜材包载药物的递送系统，实现巨噬细胞靶向递药。此外，研究发现PS载体本身也有抗炎作用，原因可能是其能模仿凋亡的细胞，被巨噬细胞摄取后会诱导巨噬细胞产生抗炎反应。
目前中国专利CN104771764A公开了一种甘露糖修饰的精蛋白巨噬细胞靶向载体的合成及基因递送系统的制备方法。中国专利CN103120795B公开了一种靶向巨噬细胞的制剂，该制剂由囊状的酵母细胞壁内装载自组装的载药纳米粒得到。中国专利CN101690822B公开了一种用于巨噬细胞疾病靶向供药的药物载体及其制备方法，该药物载体为对巨噬细胞由特异识别能力的轮状病毒外壳蛋白Vp6经原核表达、自组装而成的中空病毒样颗粒，其内表面或外表面化学修饰有药物分子。申请人经过专利检索及文献查询，具有主动靶向至巨噬细胞同时利用药物和载体发挥协同抗炎作用的纳米载体——磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒未见报道。
发明内容
本发明所要解决的关键问题是制备一种磷脂酰丝氨酸(PS载体)修饰的姜黄素纳米粒，使其通过模拟凋亡的细胞，被巨噬细胞表面的特异性受体识别后，借助受体介导的巨噬细胞主动靶向作用，增强巨噬细胞对纳米粒的摄取；药物姜黄素进入巨噬细胞后，发挥其抗炎作用，同时PS载体被摄取后还会诱导巨噬细胞产生抗炎反应，即致炎细胞因子释放减少，抗炎因子分泌增加，达到药物和载体协同抗炎的效果。
本发明提供的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，由姜黄素、磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂、胆固醇油酸酯、三油酸甘油酯和胆固醇按摩尔百分比组成。
摩尔百分比为：姜黄素：0.5％～10％，大豆磷脂：20％～50％，磷脂酰丝氨酸：0％～50％，胆固醇油酸酯：10％～30％，三油酸甘油酯：15％～40％，胆固醇：1％～15％，物质的摩尔百分比之和为100％。
其中，磷脂酰丝氨酸可以是L-α-磷脂酰丝氨酸(由大豆磷脂或脑磷脂合成)、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸、1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸或其他种类的磷脂酰丝氨酸。
上述磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，具体按以下步骤进行：
(1)将处方量的大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、胆固醇油酸酯、三油酸甘油酯、姜黄素的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声(300W，6min)；
(3)采用聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
所制得的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的平均粒径为100nm～300nm，多分散指数(PI)为0.01～0.10，Zeta电位为-15mV至-45mV，，包封率为80％～100％，载药量为2％～3％。
所制得的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒在透射电镜下呈现黑色类球形的实心结构，大小均一，粒径在100～300nm，与动态光散射法(DLS)测得的粒径结果一致。
所制得的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的稳定性良好，4℃放置一周，其外观性状和粒径、多分散系数、电位和包封率等理化性质均未发生明显变化。
所制得的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒在含5％SDS的PBS溶液(0.01M，pH7.4)中，120h内累计释放百分率约为50％～60％，表明该磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒能够长效、缓慢地释放药物。对药物的体外释放曲线方程进行拟合，结果表明其体外释放曲线符合一级动力学模型。
经实验表明，本发明制备的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与大鼠红细胞孵育3h后溶血率小于5％；对小鼠巨噬细胞RAW264.7未表现出明显的细胞毒性，表明该磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的生物相容性良好。
本发明的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与未进行PS修饰的纳米粒相比，可以被高选择性地摄取进入巨噬细胞，结果见图6(激光共聚焦显微镜定性分析)和图7(流式细胞仪定量分析)，说明靶向抗炎双功能纳米粒可以特异性靶向到巨噬细胞。
所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与姜黄素溶液或PS修饰的空白纳米粒(即PS单独应用)相比，可以更显著地促进炎症状态下的巨噬细胞分泌抗炎因子，同时抑制其致炎因子的产生，表明药物和载体能发挥协同抗炎的疗效。
本发明的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与现有技术相比，至少具有如下优点：
1)与常规靶向纳米粒相比，本发明采用安全的生物内源性磷脂，通过简单的物理结合对载体进行修饰，操作简单方便，成本较低，并且不会引起机体的免疫反应；
2)与常规靶向纳米粒相比，本发明的载体对巨噬细胞具有良好的靶向性，可通过特异性PS受体识别机制增加巨噬细胞对姜黄素的摄取，提高药物的抗炎疗效；
3)与常规靶向纳米粒相比，本发明的载体可以模拟生物体内凋亡细胞，被巨噬细胞摄取后诱导巨噬细胞产生抗炎反应，与药物姜黄素发挥协同增效的抗炎作用。
附图说明
图1是磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的粒径分布图；
图2是磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的透射电镜图；
图3是磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的体外释放曲线；
图4是磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的溶血性实验；
图5是磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的细胞毒实验；
图6是激光共聚焦显微镜对细胞摄取的定性分析图示；
图7是流式细胞仪对细胞摄取的定量分析图示；
图8是巨噬细胞致炎因子和抗炎因子的mRNA表达水平图示；图中，从左至右且从上到下依次为：A、阳性对照组，B、姜黄素溶液组，C、空白载体组，D、实施例9含药载体组，E.阴性对照组；图中，#p<0.01，代表与A比有显著性差异，*p<0.01，代表与D相比有显著性差异。
图9是巨噬细胞致炎因子和抗炎因子的蛋白表达水平图示；图中，从左至右且从上到下依次为：A、阳性对照组，B、姜黄素溶液组，C、空白载体组，D、实施例9含药载体组，E、阴性对照组；图中，#p<0.01，代表与A比有显著性差异，*p<0.01，代表与D相比有显著性差异。
以下结合附图和实施例以及实验对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，采用生物内源性的PS作为膜材，制备PS修饰的纳米脂质载体作为靶向递药系统，对抗炎药物姜黄素进行包载，可实现特异性靶向到巨噬细胞，同时发挥药物和载体协同抗炎的疗效。
以下是发明人给出的实施例，这些实施例仅用于帮助理解本发明，本发明不限于这些实施例。
实施例1：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法选择
常见的纳米脂质载体制备方法主要有高压匀质法、熔融乳化法、熔融超声法、溶剂扩散法、溶剂乳化蒸发法、高速搅拌超声法、微乳法等。其中高压匀质法需要较高的温度，通常为80℃左右，热敏性药物不适合用此方法制备。而冷高压匀质法又很难制得粒径较小且分布较窄的纳米结构脂质载体。因此，结合药物特点，筛选出以下几种制备方法进行考察。
1.1乳化蒸发法-低温固化法
以摩尔百分比计，称取姜黄素5％，磷脂45％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸0％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％的脂质混合物，溶于氯仿，超声使其充分溶解，构成有机相。将有机相预热至65℃，随后将其匀速滴入相同温度下的pH 6.5磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌1h形成初乳。随后进行探头超声(300W，6min)，减压蒸去有机溶剂并浓缩至适当体积，将浓缩后的溶液快速倒入磁力搅拌下4℃的水相中冷却，继续搅拌1h后，通过聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。
1.2溶剂扩散法
以摩尔百分比计，称取姜黄素5％，磷脂45％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸0％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％的脂质混合物，溶于氯仿，超声使其充分溶解，构成有机相。将有机相预热至65℃，随后将其匀速滴入相同温度下的pH 6.5磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌1h形成初乳。随后进行探头超声(300W，6min)，减压蒸去有机溶剂并浓缩至适当体积，自然冷却至室温后，通过聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。
1.3薄膜分散法
以摩尔百分比计，称取姜黄素5％，磷脂45％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸0％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％的脂质混合物，溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜。在室温下用pH 6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，在进行探头超声(300W，6min)。最后通过聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。
由于有机相以氯仿为溶剂，与水相的磷酸盐缓冲溶液互不相溶，前两种制备方法无法有效制备得到纳米脂质载体。因此最终选择薄膜分散法制备磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒。
实施例2：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒中磷脂酰丝氨酸/磷脂摩尔比例的筛选
根据实施例1中结果，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，固定其他条件，制备PS修饰量(mol％)分别为0％、4％、8％、12％、20％的姜黄素纳米粒。用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。考察PS摩尔比例对于姜黄素纳米粒粒径、包封率的影响，以此确定有效的PS摩尔比例的范围进行后续试验。
表1：不同PS修饰量(mol％)的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
PS修饰量(mol％) 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
0 223.6±1.21 0.016±0.001 77.98±0.31
4 214.4±1.65 0.010±0.003 76.40±0.54
8 214.5±1.27 0.044±0.002 80.44±0.64
12 194.2±1.45 0.087±0.003 78.48±0.83
20 156.8±1.43 0.089±0.004 49.69±0.73
结果表明，PS修饰量在0～12％时，对药物的粒径和包封率影响不大。但当PS的修饰量为20％时，包封率显著减小，可能是由于此时PS在磷脂单层膜中的插入量超过了其所能承载的最大容量进而影响药物包载。因此在本研究中选择PS的修饰量(mol％)分别为0％、4％、8％和12％制备姜黄素纳米粒进行后续的研究。
实施例3：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒处方优化
固定PS用量(mol％)为8％，以粒径和包封率为考察指标，采用薄膜分散法制备姜黄素纳米粒，对其磷脂种类、甘油三酯种类、投药量、固液脂质比、磷酸缓冲溶液的pH值等处方因素进行优化。
3.1磷脂种类的选择
固定其它条件不变，分别以国产普通大豆磷脂，德国lipoid公司的大豆磷脂S100，上海AVT公司的蛋磷脂PC 98-T，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表2：不同磷脂种类的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
磷脂种类 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
国产普通大豆磷脂 256.6±0.42 0.086±0.002 72.98±0.31
Lipoid大豆磷脂S100 215.4±0.56 0.010±0.003 89.40±0.42
AVT蛋磷脂PC98-T 216.5±0.33 0.044±0.004 80.44±0.56
结果表明，国产大豆磷脂纯度低，所含杂质较多，制备所得纳米粒易产生沉淀，粒径较大，包封率较低。Lipoid S100和PC 98-T，纯度较高，其中卵磷脂含量大于95％，两者制备的纳米粒粒径没有显著性差别，但LipoidS100包封率较高，故最终选择Lipoid S100制备姜黄素纳米粒。
3.2甘油三酯种类的选择
固定其它条件不变，分别以辛癸酸甘油酯，硬脂酸甘油酯和三油酸甘油酯，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表3：不同甘油三酯种类的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
甘油三酯种类 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
辛癸酸甘油酯 220.6±0.42 0.026±0.002 80.33±0.54
硬脂酸甘油酯 258.4±0.56 0.032±0.003 69.56±0.48
三油酸甘油酯 216.5±0.33 0.024±0.005 88.43±0.26
结果表明，硬脂酸甘油酯制备所得纳米粒粒径较大，包封率较低。辛癸酸甘油酯和三油酸甘油酯制备的纳米粒粒径没有显著性差别，但三油酸甘油酯包封率较高，这可能与不同液态脂所形成的纳米粒内部结构不同有关，故最终选择三油酸甘油酯制备姜黄素纳米粒。
3.3固液脂质比的选择
固定其它条件不变，分别以不同的固液态脂质比(m％)2/1、2/3、2/5、2/7，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表4：不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
固液脂质比 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
2/1 195.0±0.48 0.021±0.004 57.69±0.54
2/3 201.3±0.38 0.046±0.003 75.08±0.48
2/5 192.3±0.63 0.037±0.002 87.10±0.26
2/7 185.6±0.29 0.025±0.005 59.90±0.35
结果表明，固液态脂质比对粒径影响不大，但对包封率有较大影响，随着液态脂质比例的增加，包封率先增大后减小，因此选择固液态脂质比为2/5。
3.4投药量的选择
固定其它条件不变，分别以不同的投药量5mg、10mg、15mg、20mg，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表5：不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
结果表明，投药量对粒径和包封率均有较大影响，投药量在15mg以下，随着投药量的增加，粒径逐渐增大，包封率先增大后减小。当投药量在15mg以上，粒径减小但包封率也较低，故投药量选择10mg。
3.5磷酸缓冲盐溶液pH值的选择
固定其它条件不变，分别以不同pH值5.0、6.5、7.0、7.4的磷酸缓冲盐溶液，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表6：不同固液脂质比的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
pH值 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
5.0 302.5±0.53 0.257±0.002 58.30±0.46
6.5 189.8±0.26 0.153±0.003 79.13±0.32
7.0 192.9±0.37 0.060±0.002 62.32±0.28
7.4 197.6±0.25 0.037±0.004 61.55±0.51
结果表明，磷酸缓冲盐溶液的pH值对粒径和包封率均有较大影响，pH在6.5时，粒径较小且包封率较高，当pH值进一步增加时，包封率下降，可能是姜黄素在中性条件下不稳定，导致包封率较低。因此选择磷酸缓冲盐溶液的pH值为6.5。
实施例4：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒制备工艺优化
固定PS用量(mol％)为8％，以粒径和包封率为考察指标，采用薄膜分散法制备姜黄素纳米粒，对其成膜温度、水合时间、超声时间等制备工艺参数进行优化。
4.1成膜温度的选择
固定其它条件不变，分别以不同成膜温度55℃、65℃、75℃、85℃，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表7：不同成膜温度的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
成膜温度(℃) 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
55 196.7±0.25 0.101±0.012 82.43±0.46
65 198.6±0.32 0.081±0.013 79.13±0.32
75 195.3±0.28 0.052±0.022 78.38±0.29
85 200.9±0.59 0.020±0.027 66.51±0.38
结果表明，温度的改变对NLC的粒径无明显影响，但对包封率有显著影响。随着温度的升高，包封率呈下降的趋势，可能由于温度过高，药物和脂质发生氧化的缘故，因此成膜温度选择55℃。
4.2水合时间的选择
固定其它条件不变，分别以不同的水合时间15min、30min、60min、90min，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表格8：不同成膜温度的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
水合时间(min) 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
15 193.1±0.36 0.133±0.011 74.83±0.46
30 199.6±0.25 0.112±0.013 79.02±0.45
60 198.3±0.37 0.120±0.009 77.77±0.36
90 200.2±0.32 0.140±0.018 79.78±0.21
结果表明，当水合时间在15min时包封率较低，可能是由于药物未能与脂质充分接触，水合不完全。当水合时间在30min时，包封率增大，但继续延长水合时间，粒径和包封率无明显变化，故为节省时间，水合时间选择30min。
4.3探头超声时间的选择
固定其它条件不变，分别以不同的探头超声时间3min、6min、9min、12min，采用薄膜分散法制备PS修饰的姜黄素纳米粒，用激光粒度分析仪测其粒径，并测定其包封率。
表9：不同超声时间的姜黄素纳米粒的粒径、多分散系数及包封率(Mean±SD，n＝3)
超声时间(min) 粒径(nm) 多分散系数PI 包封率(％)
3 258.1±0.54 0.185±0.001 77.633±0.36
6 198.3±0.22 0.120±0.003 74.78±0.26
9 188.3±0.25 0.111±0.008 54.32±0.63
12 176.1±0.31 0.144±0.006 49.61±0.46
结果表明，探头超声时间对粒径和包封率有较大影响，随着超声时间的延长，粒径和包封率均呈下降的趋势。可能由于超声时间过长，破坏载体的结构，导致部分药物泄漏的缘故。6min时粒径和包封率较为理想，因此超声时间选择6min。
实施例5：正交试验法优化磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的处方和制备工艺
根据实施例3和实施例4中单因素考察的结果，选择影响姜黄素纳米粒粒径和包封率的四个主要参数为考察对象，即以投药量(A)，固液态脂质比(B)，探头超声时间(C)，磷酸缓冲盐溶液的pH值(D)为4个主要考察因素，每个因素选取3个水平，按正交设计L9(34)表进行实验，优选最佳处方和制备工艺，因素水平见下表。
表10：正交设计因素水平表
根据正交设计因素水平表，采用正交设计助手Ⅱ专业版软件进行正交实验设计，按照软件给出的实验安排制备姜黄素纳米粒，并测定包封率。结果见表11，方差分析见表12。
表11：L9(34)正交实验设计及结果
表12：方差分析结果
方差来源 SS V MS F 显著性
A 1826.42 2 913.21 105.87 *
B 17.25 2 8.63 1.00 –
C 573.13 2 286.56 33.23 *
D 146.84 2 73.42 8.51 –
误差 17.25 2 – – –
注：临界值F0.05(2,2)＝19.00，*P<0.05
从表11中可以看出，各个因素的不同水平对姜黄素纳米粒包封率的影响依次为：A1>A2>A3，B2>B1>B3，C1>C2>C3，D2>D3>D1，A>C>D>B，即投药量对姜黄素纳米粒包封率的影响最大，其次是探头超声时间，再次是磷酸缓冲溶液的pH值，固液脂质比对包封率的影响相比较前三者而言最小。
由表12可知，投药量和探头超声时间对包封率的影响具有显著性差异(P＜0.05)。按照正交实验结果，最优工艺的组合为A1B2C2D2，即投药量为10mg，固液脂质比为2/5，超声时间为6min，磷酸缓冲溶液的pH值为6.5。
实施例6：优化工艺条件的验证实验
结合正交实验设计筛选的工艺和参数，按照最佳处方和工艺条件，制备三批姜黄素纳米粒，并测定包封率，对最佳组合结果进行验证。结果见表13。
表13：正交实验设计结果验证(n＝3)
实验编号 包封率(％) 粒径(nm) 载药量(％)
1 88.42 211.6 2.23
2 89.13 205.8 2.15
3 88.78 207.9 2.19
Mean±SD 88.78±0.36 208.4±1.85 2.19±0.04
方差分析的结果说明所选的4个因素在各自设定的水平内有2个因素对粒径的影响不具有统计学意义，因此结合既定的工艺和参数，按照最佳处方和工艺条件制备的姜黄素纳米粒的平均包封率为88.78％，而且较为稳定，粒径和载药量都较为理想，说明优化的方案可行且工艺的重现性良好。
实施例7：0％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
以摩尔百分比计，取姜黄素5％，大豆磷脂45％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸0％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％，通过以下步骤制备靶向抗炎双功能纳米粒：
(1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声(300W，6min)；
(3)采用聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
实施例8：4％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
以摩尔百分比计，取姜黄素5％，大豆磷脂41％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸4％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％，通过以下步骤制备靶向抗炎双功能纳米粒：
(1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声(300W，6min)；
(3)采用聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
实施例9：8％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
以摩尔百分比计，取姜黄素5％，大豆磷脂37％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸8％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％，通过以下步骤制备靶向抗炎双功能纳米粒：
(1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声(300W，6min)；
(3)采用聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
实施例10：12％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备
以摩尔百分比计，取姜黄素5％，大豆磷脂33％，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸12％，胆固醇油酸酯15％，三油酸甘油酯25％，胆固醇10％，通过以下步骤制备靶向抗炎双功能纳米粒：
(1)将上述组分的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声(300W，6min)；
(3)采用聚碳酸酯膜(孔径220nm)过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀。最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
实施例11：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的形态学、粒径、Zeta电位、包封率和载药量的测定
利用透射电镜观察纳米粒的微观形态，采用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径分布及Zeta电位，采用微柱离心法测定纳米粒的包封率和载药量。
纳米粒的粒径分布图和微观形态分别见图1和图2。
表14：纳米粒的粒径、Zeta电位、包封率和载药量(Mean±SD，n＝3)
透射电镜下可见所有的纳米粒均为黑色类球形的实心结构，大小均一。表14显示随着PS修饰量的增加，电位呈现下降趋势，说明PS已经成功插入到磷脂单层膜中。当PS的摩尔比例大于8％时，电位趋于恒定，说明PS在磷脂单层膜中已达到饱和状态。从表中可以看出粒径分布范围较窄，粒径大小均匀。
实施例12：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的体外释放行为考察
采用透析袋法，考察纳米粒在PBS(pH7.4)中的释药特性(见图3)。结果表明，磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的药物释放具有一定的缓释性。对药物的体外释放曲线方程进行拟合，结果表明其体外释放曲线符合一级动力学模型。
实施例13：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的溶血性考察
取大鼠全血2mL置于肝素化试管中，用玻璃棒搅拌去除纤维蛋白原，加入约10倍量的生理盐水，摇匀，1500rpm离心15min弃去上清液，沉淀的红细胞再用等量的生理盐水重复洗涤3～4次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理盐水配成2％的红细胞悬液。
取6支10mL离心管，编号，按下表15进行实验，第1～4管分别为实施例1～4中的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，第5管为阴性对照，第6管为阳性对照，混匀后置于37℃恒温水浴中振荡3h(100r/min)。于3000rpm离心10min后，收集上清，过0.22μm的有机滤膜，采用紫外-可见分光光度计，在500nm～650nm波长范围内进行扫描。测定每组上清液在最大吸收波长处的吸光度，按下式计算溶血率：
溶血率(％)＝(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/(阳性对照组吸光度值-阴性对照组吸光度值)×100
表15：溶血试验各组分加入方法(mL)
离心管编号 2％红细胞悬液 生理盐水 姜黄素纳米粒 蒸馏水
1 2.5 2.2 0.3 0
2 2.5 2.2 0.3 0
3 2.5 2.2 0.3 0
4 2.5 2.2 0.3 0
5 2.5 2.5 0 0
6 2.5 0 0 2.5
表16：溶血性实验结果(Mean±SD,n＝3)
样品 实施例7 实施例8 实施例9 实施例10
溶血率(％) 4.66±0.09 3.36±0.06 3.61±0.05 4.23±0.07
由图4和表16可知，不同实施例中纳米粒的溶血率均小于5％，表明纳米粒没有溶血性。
实施例14：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的细胞毒性考察
取对数生长期的RAW 264.7巨噬细胞以5×104个/孔密度接种于96孔板中，每孔200μLDMEM培养基于培养箱中37℃，5％CO2培养24h后，洗去培养液，分别加入用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释的不同PS修饰的姜黄素纳米粒200μL(Cur浓度均为20μM)，孵育24小时后，向每个孔中加入20μL MTT储备液(5mg/mL，pH7.4PBS)，37℃继续孵育4小时。去除上清液，加入150μL DMSO，稍加振摇溶解蓝紫色的甲瓒结晶，用酶联免疫测定仪于490nm测定吸光度。以含10％胎牛血清的培养液孵育细胞，相同操作作为阴性对照；以无细胞的空白培养基接种并按相同操作处理作为空白对照。每个样品三复孔，计算细胞存活率。
图5结果表明，与纳米粒孵育后的细胞，与未处理的正常细胞相比，细胞存活率未发生明显变化。
实施例15：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的巨噬细胞摄取研究
采用荧光染料香豆素-6(Coumarin-6，C6)代替姜黄素制备靶向抗炎双功能纳米粒，通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪(FCM)考察巨噬细胞对纳米粒的摄取程度。
取无菌处理的圆形盖玻片置于24孔板内，将RAW264.7以1×105接种于24孔细胞板，在含有10％胎牛血清的DMEM培养基(含有100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中标准条件培养24h，弃去上层培养基，用PBS润洗，将各组荧光标记的纳米粒分别用无血清培养基稀释至Coumarin-6浓度为100ng/mL，用各组稀释后的纳米粒混悬液替换细胞生长培养基。不含纳米粒的空白培养液作为阴性对照。37℃培养3h后，吸除上层培养液，PBS洗细胞3次，加1ml的4％多聚甲醛(v/v)固定细胞(室温20min)，PBS洗3次，加入细胞核染色剂DAPI(200μl/孔)，避光室温孵育10min。弃去DAPI，PBS洗2min，重复5次；取出细胞爬片置于洁净载玻片上，采用50％甘油封片，避光保存于4℃，CLSM观察细胞对各组纳米粒的摄取情况。
将RAW264.7巨噬细胞以5×105/孔接种于6孔板内，于培养箱中37℃，5％CO2培养24h细胞长满孔板后，除去培养基，加入各组荧光标记的纳米粒分别用无血清培养基稀释至Coumarin-6浓度为100ng/mL，用各组稀释后纳米粒混悬液替换细胞生长培养基。以不含纳米粒的空白培养基作为阴性对照。37℃培养3h后，吸除上层培养液，PBS洗涤，胰酶消化液处理各组细胞形成细胞悬液，收集细胞悬液于离心管中，离心(1000rpm，5min)后，用0.5ml的PBS复悬细胞，用于流式细胞仪检测，每次分析10000个细胞。
图6和图7表明，磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒与未进行PS修饰的纳米粒(即0％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒)相比，可以被高选择性地摄取进入巨噬细胞；且8％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒摄取率最高，故选择8％磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒用于后续细胞抗炎特性研究。
实施例16：磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的抗炎特性研究
按1×105/孔的密度接种RAW264.7细胞于12孔板，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，其中培养液内含有双抗(100μg/mL链霉素和100units/mL青霉素)，37℃条件下、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养24h；再分别按如下方式进行处理分组，继续培养24h，每组设置3个复孔进行，分别进行后续不同生化指标检测。
按照细胞不同干预处理可分为以下五组：
(1)阳性对照组：加入含有50μg/mL oxLDL不含任何制剂的无血清DMEM；
(2)药物溶液组：加入含有50μg/mL oxLDL和含有20μM姜黄素溶液的DMEM；
(3)空白载体组：加入含有50μg/mL oxLDL和不含姜黄素的空白载体(PS浓度与含药载体相同)的DMEM；
(4)含药载体组：加入含有50μg/mL oxLDL和含药载体(即8％PS修饰的姜黄素纳米粒，其中姜黄素浓度为20μM)的DMEM；
(5)阴性对照组：加入无血清的DMEM。
各细胞组中致炎因子和抗炎因子mRNA表达水平测定：按照试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA，以稀释后的RNA样本作为模板合成cDNA，将制备得到的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增。所有结果均用GAPDH进行校正，比较方法为CT法(2-ΔΔCT)，计算公式如下：ΔΔCT＝(CT-CR)试验 组-(CT-CR)对照组，其中(CT-CR)试验组表示处理组的靶基因和内参基因的CT差值，而(CT-CR)对照组表示对照组的靶基因和内参基因的CT差值。
各细胞组中致炎因子和抗炎因子蛋白表达水平测定：按照上述细胞培养及给药方案处理分组后，继续培养24h结束后，收集细胞培养液，12000rpm4℃离心10min，分别采用ELISA试剂盒测定致炎因子和抗炎因子的蛋白表达水平。
图8和图9结果表明，分组给予不同的制剂处理后，与阳性对照组相比，姜黄素溶液组、空白载体组和含药载体组中细胞致炎因子(MCP-1、TNF-α、IL-6)的mRNA和蛋白表达水平均显著下降；抗炎因子(IL-10、TGF-β)mRNA和蛋白表达水平显著上升，而含药载体组作用最强。可见给予药物和载体后均能抑制致炎因子的表达，促进抗炎因子的表达，且两者合用后效果增强，表明PS与姜黄素有协同抗炎作用。

Claims (8)

1.一种磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，制得的该磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒由以下物质按摩尔百分比组成：
姜黄素：0.5％～10％，大豆磷脂：20％～50％，磷脂酰丝氨酸：0％～50％，胆固醇油酸酯：10％～30％，三油酸甘油酯：15％～40％，胆固醇：1％～15％，物质的摩尔百分比之和为100％。
2.如权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸是L-α-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸、1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸或其他种类的磷脂酰丝氨酸。
3.如权利要求1所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒平均粒径为100nm～200nm，多分散指数(PI)为0.01～0.10，Zeta电位为-15mV至-45mV，包封率为80％～100％，载药量为2％～3％。
4.权利要求1或2或3所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒的制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法，具体按以下步骤进行：
(1)将处方量的大豆磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、胆固醇油酸酯、三油酸甘油酯、姜黄素的脂质混合物溶于氯仿，在旋转蒸发仪中挥去有机溶剂，得到干燥的脂质薄膜；
(2)在室温下用pH6.5磷酸盐缓冲液对脂质薄膜进行水化30min，将脂质混悬液超声处理10min，再进行探头超声6min；
(3)采用孔径220nm的聚碳酸酯膜过滤若干次，除菌的同时使粒径均匀，最终得到磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒，装入无菌瓶中于4℃密封保存。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸是L-α-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰丝氨酸、1,2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸或其他种类的磷脂酰丝氨酸。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒平均粒径为100nm～200nm，多分散指数(PI)为0.01～0.10，Zeta电位为-15mV至-45mV，包封率为80％～100％，载药量为2％～3％。
7.权利要求1～3任一项所述的磷脂酰丝氨酸修饰的姜黄素纳米粒用于制备治疗巨噬细胞介导相关疾病药物的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，作为药物在递送系统以特异性靶向到巨噬细胞，并且发挥药物和载体协同抗炎疗效。
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