CN114344479B - iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法,将姜黄素、胡椒碱、卵磷脂、胆固醇、iRGD‑PEG2000‑DSPE、DSPE‑PEG2000、三氯甲烷混合,得到混合物;将混合物进行旋蒸成膜;将膜在酸性环境下溶解,并依次搅拌、过滤后,得到iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。本发明还公开一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。本发明还公开一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体在建立离体A549细胞抑制模型中的应用以及旋转蒸发仪。本发明具有将iRGD肽作为纳米递药系统的特异性靶向配体,可增加药物在肿瘤细胞内的聚集,减少在正常组织的分布,可以达到更好的抗肿瘤效果的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体及其制备方法。
背景技术
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,且发病率和病死率居恶性肿瘤之首,5年生存率仅为19.7%。化疗是目前临床上治疗肺癌的主要方法之一,但由于多数化疗药物用量大,缺乏专一性,对正常的组织和细胞也会产生毒性,导致严重的毒副作用,且容易产生多药耐药和变态反应,药效受到限制。因此寻求安全高效的抗肺癌靶向给药系统是极为迫切的。
iRGD肽是一种靶向穿膜肽,能够特异性识别肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞表面的整合素αvβ3受体,而在大多数正常细胞组织中低表达或者仅少量表达。
姜黄素是从姜黄中提取出来的天然有效成分,是一种疏水性的多酚类成分,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及肝保护等作用。但由于姜黄素较低的溶解性与体内易消除两个因素限制了其临床应用。口服给药后,姜黄素还会被人体内多种还原酶代谢成水溶性的葡萄糖醛酸结合物和硫酸化结合物,随尿液排出体外,无法理想地发挥疗效。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于如何提供一种新型的将iRGD肽作为纳米递药系统的特异性靶向配体,可增加药物在肿瘤细胞内的聚集,减少在正常组织的分布,可以达到更好的抗肿瘤效果的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体及其制备方法。
本发明所要解决的技术问题之二在于如何提供一种通过建立离体A549细胞抑制模型,来优化判断iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的药性。
本发明所要解决的技术问题之三在于如何通过优化iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体制备过程中的旋转蒸发仪结构,来提高单因素实验、正交实验或者多组分实验的实验效率以及提高操作的便捷性,避免高温灼烧以及热源浪费。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题之一的:一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、将COOH-PEG2000-DSPE、N-N-羟基琥珀酰亚胺、二氯乙烷、三氯甲烷混合反应,得到第一混合反应体系;
步骤二、iRGD多肽溶解,得到第二混合体系;
步骤三、将第一混合反应体系、第二混合体系混合反应,将反应产物旋蒸得到固体;
步骤四、固体置透析袋中透析后,冻干得到iRGD-PEG2000-DSPE。
步骤五、将姜黄素、胡椒碱、卵磷脂、胆固醇、iRGD-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、三氯甲烷混合,得到混合物;
步骤六、将混合物进行旋蒸成膜;
步骤七、将膜溶解,并依次搅拌、过滤后,得到iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。
优选地,所述步骤四中,固体置于500分子截留量的透析袋中透析3天。
优选地,步骤五中胆固醇、卵磷脂的质量比为1:5.19。
优选地,步骤六中在35~45℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜。
优选地,步骤七中,在60℃恒温磁力搅拌20min,0.22μm的滤膜滤过,得到iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。
本发明还公开一种采用上述的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法制备得到的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题之二的:一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体在建立离体A549细胞抑制模型中的应用;包括以下步骤:
步骤一、对离体的A549细胞进行体外培养;
步骤二、每孔分别加入至1.25ug/mL、2.5ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体,分别培养24h、48h、72h;
步骤三、每孔加入20μLMTT溶液,继续孵育4h,终止培养;
步骤四、吸弃孔内培养液,每孔加入150μLDMSO,摇床振荡10min;
步骤五、492nm下,酶标仪测定各孔光密度值,记录结果。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题之三的,旋转蒸发仪包括旋转导流机构;旋转导流机构能带动多个蒸发瓶同时旋转;旋转导流机构还包括导流管、滑动块、连接管体;滑动块与导流管在导流管的导向滑动配合,连接管体与滑动块转动配合;
当需要进行蒸发瓶安装或者拆卸时,包括以下步骤:
步骤6.1、滑动块向外运动使得连接管体脱离导流管;
步骤6.2、滑动块、连接管体同步向上运动使得倾斜状的蒸发瓶向上脱离水浴锅的同时转动至蒸发瓶的开口向上的竖直状或者近似竖直状。
当进行蒸发瓶旋转蒸发时,包括以下步骤:
步骤6.3、滑动块、连接管体同步向下使得竖直状或者近似竖直状的蒸发瓶向下运动至其底部伸入至水浴锅的同时转动至蒸发瓶呈倾斜状;
步骤6.4、滑动块向内运动使得倾斜状的连接管体的一端伸入至导流管中。
本发明的优点在于:
本发明将姜黄素包载于脂质体中,可以提高其生物利用度,减缓体内消除。胡椒碱为桂皮酞胺类生物碱,可通过抑制姜黄素失活或减慢其消除来提高姜黄素生物利用度,本发明加入胡椒碱,从而增加治疗效果。
本发明的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体与未修饰的姜黄素胡椒碱脂质体相比较细胞存活率有所下降。胡椒碱能通过抑制Bcl-2通路达到诱导A549细胞凋亡作用,故本发明的脂质体与姜黄素脂质体相比细胞存活率有所下降,在给药24h时,效果最为明显。iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体对肿瘤细胞的抑制作用较普通脂质体有所增强。
本发明的脂质体对A549细胞的毒性最强,细胞存活率最低,给药72h的IC50为[(12.61±0.84)μg/L],其次为姜黄素胡椒碱脂质体[IC50为(16.13±0.81)μg/L],与姜黄素溶液组比较,iRGD修饰的姜黄素和胡椒碱脂质体组的存活率显著降低(P<0.05)。本发明通过建立离体A549细胞抑制模型,来优化判断iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的药性,为脂质体的使用以及脂质体的进一步研究提供了模型基础。
本发明通过在同一台旋转蒸发仪设置多个蒸发瓶并能同时进行多个蒸发瓶的旋转,进而能实现启动一台转蒸发仪即可进行多组样品的同时进行旋蒸处理,相比现有技术单独多组样品分别进行操作的方式,极大地节省了操作时间、提高了操作效率。同时,利用当需要进行蒸发瓶安装或者拆卸时,连接管体向上运动使得倾斜状的蒸发瓶向上脱离水浴锅的同时转动至蒸发瓶的开口向上的竖直状或者近似竖直状,当进行蒸发瓶旋转蒸发时,连接管体同步向下使得竖直状或者近似竖直状的蒸发瓶向下运动至其底部伸入至水浴锅的同时转动至蒸发瓶呈倾斜状,避免高温灼烧以及热源浪费。
附图说明
图1为本发明中的紫外扫描共同吸收波长图。
图2为本发明中胆脂比与成膜温度的交互作用等高线图。
图3为本发明中胆脂比与成膜温度的交互作用响应曲面图。
图4为本发明中胆脂比与成膜溶剂体积的交互作用等高线图。
图5为本发明中胆脂比与成膜溶剂体积的交互作用响应曲面图。
图6为本发明中成膜温度与成膜溶剂体积的交互作用等高线图。
图7为本发明中成膜温度与成膜溶剂体积的交互作用响应曲面图。
图8为本发明中iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的透射电镜图。
图9为本发明在碱性缓冲液条件下对应的脂质体的累积释放率曲线图。
图10为本发明在酸性缓冲液条件下对应的脂质体的累积释放率曲线图
图11为本发明在培养24h条件下各组细胞存活率的测定结果曲线图。
图12为本发明在培养48h条件下各组细胞存活率的测定结果曲线图。
图13为本发明在培养72h条件下各组细胞存活率的测定结果曲线图。
图14为本发明旋转蒸发仪的结构示意图。
图15为本发明中蒸发瓶伸入至水浴锅状态下的结构示意图。
图16为本发明图15的A部分放大图。
图17为本发明中中心齿轮与滑块配合在中心轴状态下的仰视示意图。
图18为本发明中中心齿轮的结构示意图。
图19为本发明中滑块的结构示意图。
图20为本发明中导流管与集中管配合状态下的结构示意图。
图21为本发明中分离转动管体结构的结构示意图。
图22为本发明中蒸发瓶与接口连接状态下的结构示意图。
图23为本发明中连接管体与导流管连接状态下的结构示意图。
图24为本发明中连接管体与导流管分离状态下的结构示意图。
图25为本发明中连接管体在转动状态下的结构示意图。
图26为本发明中蒸发瓶在向上运动至脱离水浴锅状态下的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,当元件被称为“固定于”另一个元件,它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件,它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
实施例1
(CUR+PIP)-LPs((CUR+PIP)-LPs即姜黄素和胡椒碱联合脂质体)的制备采用薄膜水化法进行制备:称取卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、姜黄素(CUR)、胡椒碱(PIP)于圆底烧瓶中,其中,PC:500mg、CHO:100mg、CUR:10mg、PIP:0.5mg,用20mL三氯甲烷超声溶解后,40℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜,再加入20mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5),60℃下旋转20min使膜溶解,60℃恒温磁力搅拌20min,0.22μm的滤膜滤过即得。
实施例2
CUR与PIP最大吸收波长的确定
CUR、PIP对照品溶液的制备
对照品贮备液:取CUR对照品1.28mg,精密称定,置于10mL棕色量瓶中,加甲醇溶解稀释,并定容至刻度,制得质量浓度为128μg/mL的姜黄素对照品贮备液;取PIP对照品1.35mg,精密称定,置于10mL棕色量瓶中,加甲醇溶解稀释,并定容至刻度,制得质量浓度为135μg/mL的胡椒碱对照品贮备液。
对照品稀释液:将姜黄素对照贮备液和胡椒碱对照品储备液用甲醇稀释10倍,制得质量浓度为12.8μg/mL的姜黄素对照品稀释液和13.5μg/mL的胡椒碱对照品稀释液。
混合对照品溶液:吸取1mL姜黄素对照品贮备液和1mL胡椒碱对照品贮备液于离心管中,再加入8mL甲醇混匀。即得含姜黄素12.8μg/mL、含胡椒碱13.5mg的混合对照品溶液。
分别称取2mL的CUR、PIP溶于10mL甲醇中,超声溶解后吸取(红色部分改为取姜黄素对照品稀释液、胡椒碱对照品稀释液、混合对照品溶液)适量于吸收池内,用甲醇空白调零,基线归零后在紫外分光光度计上200nm~930nm波长范围内进行紫外扫描,找到CUR和PIP的共同最大吸收波长。结果如图1所示,姜黄素和胡椒碱的交点即共同最大吸收波长,为366nm。
实施例3方法学考察
3.1色谱条件与系统适应性
色谱柱:ACQUITY UPLC C18柱(2.1mm×100mm,1.7μm);流动相:乙腈-4%冰乙酸水溶液(54:46,V/V);4%表示4ml的冰乙酸溶于96ml纯化水中;流速:0.2mL/min;柱温:30℃;检测波长:430nm;进样量:2μL。
3.2供试品溶液的制备
脂质体溶液:取实施例1制备的(CUR+PIP)-LPs 0.5mL,加4.5mL甲醇超声溶解稀释,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。
空白脂质体溶液:取不含药物的空白脂质体0.5mL,加4.5mL甲醇超声溶解稀释,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过,即得。
不含药物的空白脂质体的制备方法为:称取适量卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、于圆底烧瓶中,其中,PC:500mg、CHO:100mg;用20mL三氯甲烷超声溶解后,40℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜,再加入20mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5),60℃下旋转20min使膜溶解,60℃恒温磁力搅拌20min,0.22μm的滤膜滤过即得。
3.3线性关系考察
配置含姜黄素1.92μg/mL、3.84μg/mL、7.68μg/mL、15.36μg/mL、30.72μg/mL、61.44μg/mL浓度、含胡椒碱2.025μg/mL、4.05μg/mL、8.10μg/mL、16.20μg/mL、32.40μg/mL、64.80μg/mL浓度的混合对照品溶液。
即分别配置含姜黄素1.92μg/mL、胡椒碱2.025μg/mL的混合对照品溶液,含姜黄素3.84μg/mL、胡椒碱4.05μg/mL的混合对照品溶液,含姜黄素7.68μg/mL、胡椒碱8.10μg/mL的混合对照品溶液,含姜黄素15.36μg/mL、胡椒碱16.20μg/mL的混合对照品溶液,含姜黄素30.72μg/mL、胡椒碱32.40μg/mL的混合对照品溶液,含姜黄素61.44μg/mL、胡椒碱64.80μg/mL的混合对照品溶液其中各组混合对照品溶液的溶剂为甲醇。
按“3.1”项下色谱条件进样分析,记录色谱图及峰面积,以峰面积(Y)为纵坐标,待测物质量浓度(c,μg/mL)为横坐标进行线性回归。结果,姜黄素的回归方程为Y=22375c-4997.6(r=0.9999),表明姜黄素在1.92~61.44μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,胡椒碱的回归方程为Y=33219c-19708(r=0.9995),表明胡椒碱在2.025~64.80μg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
3.4精密度试验
取混合对照品溶液,按“3.1”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积。结果,姜黄素峰面积的RSD为1.32%(n=6),胡椒碱峰面积的RSD为1.45%(n=6),表明仪器精密度良好。
混合对照品溶液为RSD小于2%的混合对照品溶液,本实施例优选为含姜黄素3.84μg/mL、胡椒碱4.05μg/mL的混合对照品溶液。
3.5重复性试验
取实施例1制备的(CUR+PIP)-LPs6份,每一份均为0.5mL,按上述供试品溶液的制备方法处理,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。结果,姜黄素峰面积的RSD为1.25%(n=6),胡椒碱峰面积的RSD为1.44%(n=6),表明该方法重复性良好。
3.6稳定性试验
取实施例1制备的(CUR+PIP)-LPs 0.5mL,按上述供试品溶液的制备方法处理,室温下放置0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h后,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。结果,姜黄素峰面积的RSD为0.66%(n=6),胡椒碱峰面积的RSD为1.79%(n=6),表明供试品溶液在室温下放置12h内稳定性良好。
3.7回收率试验
取已知含量的姜黄素胡椒碱脂质体样品溶液1mL(即取实施例1制备的脂质体0.5mL,通过加4.5mL甲醇超声溶解稀释,摇匀,0.22μm微孔滤膜滤过得到的供试品溶液。已知含量指含姜黄素25.54ug、胡椒碱2.85ug),各9份,分别加入相对于样品体积分数的80%、100%和120%的对照品溶液。按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积并计算加样回收率和RSD值。结果姜黄素的平均加样回收率为100.34%,RSD为1.58%,胡椒碱的平均加样回收率为98.32%,RSD为2.57%,表明加样回收率良好。
表1
实施例4
包封率的测定
(1)姜黄素包封率的测定
取制备好未滤过的脂质体0.5mL,加甲醇超声20min破乳,13000r/min离心10min,上清液0.22μm滤膜滤过后,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。带入混合标曲溶液计算姜黄素的含量,作为姜黄素的总量W1;吸取滤过的等体积脂质体,加甲醇超声20min破乳,13000r/min离心10min,上清液0.22μm滤膜滤过后,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。带入混合标曲溶液计算姜黄素的含量,作为包载进脂质体的姜黄素的质量W2,制备脂质体时加入的辅料与药物用量为W3。
姜黄素包封率总=W2/W1×100%
姜黄素载药量总=W2/W3×100%
其中,好未滤过的脂质体制备方法为:
采用薄膜水化法进行制备:称取适量卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、姜黄素(CUR)、胡椒碱(PIP)于圆底烧瓶中,用20mL三氯甲烷超声溶解后,40℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜,再加入20mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5),60℃下旋转20min使膜溶解,60℃恒温磁力搅拌20min,得到未滤过的脂质体。;其中,PC:500mg、CHO:100mg、CUR:10mg、PIP:0.5mg
(2)胡椒碱包封率的测定
取制备好未滤过的脂质体0.5mL,加甲醇超声20min破乳,13000r/min离心10min,上清液0.22μm滤膜滤过后,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。带入混合标曲溶液计算胡椒碱的含量,作为胡椒碱的总量W4;吸取滤过的等体积脂质体,加甲醇超声20min破乳,13000r/min离心10min,上清液0.22μm滤膜滤过后,按“3.1”项下色谱条件进样,记录峰面积。带入混合标曲溶液计算胡椒碱的含量,作为包载进脂质体的胡椒碱的质量W5,制备脂质体时加入的辅料与药物用量为W6。
胡椒碱包封率总=W5/W4×100%
胡椒碱载药量总=W5/W6×100%
实施例5
脂质体处方工艺优化
5.1脂质体Box-Behnken试验设计
根据预实验单因素试验结果,综合考虑溶剂种类、胆脂比、成膜溶剂用量、成膜温度、水化溶剂体积用量、水化温度考察对姜黄素提取率的影响,选择以胆脂比(A)、成膜温度(B)、成膜溶剂体积(C)为主要考察因素,以姜黄素包封率为响应值,运用Design-Expert8.0.6软件,根据Box-Behnken的试验设计原理设计三因素三水平响应曲面试验,各因素及水平设计见表2,每个因素设计3个水平,通过试验结果对脂质体制备效果进行比较,从而选出最佳制备条件,并进行验证试验,进而验证试验结果,试验设计与结果见表3。
表2
表3
表4
将表3中姜黄素包封率数据输入Design-Expert 8.0.6软件中,拟合得到方程为Y=97.85+0.82A+0.088B-0.13C+0.38AB-0.54AC+0.19BC-2.25A2-1.63B2-1.84C2。R2=0.8999(P<0.05)。拟合结果表明,模型在所研究整个回归区域内拟合度较好,可用以优选iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的最优处方工艺。
再对回归方程进行方差分析和显著性检验,结果见表4。通过姜黄素提取工艺条件响应面拟合回归方程的方差分析结果可以看出整体的回归方差P<0.05,表明该模型总体来说是有效的,失拟项P>0.05,拟合度和可信度良好,表明模型具有极显著意义,可充分表示响应值与三个变量A、B、C的关系。此外,对拟合模型进行显著性检验发现,A对Y值有显著影响(P<0.05),因素B、C对Y值没有显著影响(P>0.05);3个因素对平均包封率影响的大小顺序为A>C>B,(胆脂比>成膜溶剂体积>成膜温度)。使用Design-Expert 8.0.6软件绘制因变量和自变量的三维效应面图和二维等高图,结果见图2-7。由图2-7可知,B、C对Y值的影响不大,A对Y值则影响显著。上述交互因素中A与B、A与C的效应面形状均较陡,等高线均呈明显的椭圆形,而B与C的效应面较平缓,等高线椭圆形不明显,说明A与B、A与C的交互作用更为明显。
5.2验证试验
依据上述回归方程,以姜黄素包封率极值,利用模型进行预测,得到胆固醇:卵磷脂=1:5.19、成膜温度40.25℃、成膜溶剂体积19.98mL,此时姜黄素包封率为97.93%。综合实际生产考察,最终选定提取条件为胆固醇:卵磷脂(质量比)=1:5.19、成膜温度40℃、成膜溶剂体积20mL。为检验该提取工艺的可靠性,进行提取工艺验证。称取处方量的姜黄素和胡椒碱原料药(CUR:10mg、PIP:0.5mg),按优选条件(胆固醇:卵磷脂的质量比=1:5.19、成膜温度40℃、成膜溶剂体积20mL)进行提取,平行试验3次。结果显示,得到姜黄素提取率为97.46%(n=3,RSD=0.37%),与预测值97.93%,相对误差为0.47%。通过验证性试验可知,响应面试验分析所得的最佳条件优化的姜黄素胡椒碱脂质体制备工艺较为稳定,优化的条件可靠。
实施例6
iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备
6.1iRGD-PEG2000-DSPE的合成
取0.001molCOOH-PEG2000-DSPE、0.012molN-N-羟基琥珀酰亚胺、0.012mol二氯乙烷加入到反应瓶中,加入5mL三氯甲烷,室温搅拌反应8小时。
将0.001moliRGD多肽溶于1mL去离子水中,加入到6mL的甲醇中,然后将整个体系加入到上述反应瓶中,继续反应6小时后,旋蒸去除所有液体,得到固体置于500分子截留量的透析袋中透析3天,冻干得到最终产物。
6.2iRGD脂质体(即iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体)的制备
按上述优化的最优条件称取处方量即CUR:10mg、PIP:0.5mg、PC:519mg CHO:100mg、iRGD-PEG2000-DSPE:10mg、DSPE-PEG2000:40mg于圆底烧瓶中,用20mL三氯甲烷超声溶解后,40℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜,再加入20mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5),60℃下旋转20min使膜溶解,60℃恒温磁力搅拌20min,0.22μm的滤膜滤过即得。
实施例7
脂质体的表征
取实施例6中的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体经过甲醇稀释后得到的产物(即稀释后的脂质体溶液),配比是0.5ml脂质体加入4.5ml甲醇。滴加至覆盖300目铜网上,待其吸附后,从一边用滤纸吸走多余的脂质体溶液,再用2wt%磷钨酸溶液染色,2wt%磷钨酸溶液的用量为覆盖300目铜网即可;室温晾干,然后置于透射电子显微镜上观察其形态。另取iRGD-(CUR+PIP)-LPs 2mL,使用纳米粒度及电位分析仪测定脂质体的粒径及Zeta电位,平行操作3次。结果显示,iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体呈球形,粒径为(93.9±0.9)nm(n=3),Zeta电位为(0.3±0.1)mV(n=3)。iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的透射电镜图见图8。
实施例8
脂质体的体外释放特性考察
采用膜透析法考察姜黄素纳米粒的体外释药特性。取2.0mL相同浓度(含姜黄素0.5mg/mL)的姜黄素溶液(其中溶剂乙醇:PEG400:水体积比=2:2:6,即将姜黄素加入至溶剂(乙醇、PEG400、水)中,形成姜黄素溶液)和实施例7中的稀释后的脂质体溶液(iRGD-(CUR+PIP)-LPs)置于透析袋(MW14000)中,透析袋置于40mL 1%(w/v)吐温80的PBS(pH7.4、pH5.6)缓冲液中,在37℃,140r/min的摇床中振荡,分别在0.5h、1h、2h、4h、8h、24h、32h、48h、72h、96和144h取出1.0mL透析液,同时补充同温同体积的释放介质(定期更换释放介质)。UPLC测定透析液中姜黄素含量,计算脂质体的累积释放率并绘制累积释放曲线。结果如图9、10所示,当pH7.4时,姜黄素溶液的释放速度很快,在释放初期,在8h已经释放50%以上,72h已基本释放完全。iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体(iRGD-(CUR+PIP)-LPs)在释放初期,前4h的累积释放率约4%,没有明显的突释现象;在72h左右释放量达到50%以上;随着时间的增加,释放逐渐增加最后达到67%,总的释药周期约一周。当pH5.6时,姜黄素溶液在48h已基本释放完全,iRGD-(CUR+PIP)-LPs在120h后释放逐渐变慢最后趋于稳定,全部释药量约86%左右。将姜黄素原料药制备成脂质体后,明显延长了体外释放时间,具有较好的缓释作用。
实施例9
脂质体的体外释放特性考察
iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体体外抗肺癌活性初步评价
9.1细胞的培养
将A549肺癌细胞接种于含10%体积百分比灭菌胎牛血清和1%体积百分比青-链霉素的1640完全培养基中,然后将其置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。待细胞生长至融合度为90%后,弃去培养液,加入1mLPBS清洗细胞,清洗2~3次,每次用量1ml,再加入0.25%胰蛋白酶1mL(Gibco牌0.25%Trypsin-EDTA货号25200056)消化约3min,再加入培养基3mL。然后用移液枪轻轻吹打使细胞完全脱落,将细胞悬液置于15mL离心管中,以1000r/min离心3min,吸弃上清液,重新加入新鲜的含10%体积百分比灭菌胎牛血清和1%体积百分比青-链霉素的1640完全培养基重悬并转移至2个新的培养瓶中进行传代培养。
9.2iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体对A549细胞存活率的影响
采用MTT法进行考察。取对数生长期的A549细胞,以每孔4×103个接种于96孔培养板中,每孔体积100μL。将培养板放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养24h,弃去旧的培养基,每孔加入100μL不同浓度梯度(1.25ug/mL、2.5ug/mL、5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、80ug/mL)的游离姜黄素(CUR-sol)、姜黄素脂质体(CUR-LPs)、姜黄素和胡椒碱联合脂质体((CUR+PIP)-LPs)、iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体(iRGD-(CUR+PIP)-LPs),溶剂为1640不完全培养基(即上述1640完全培养基中去除灭菌胎牛血清。每个质量浓度设置3个复孔,同时不加细胞悬液的空白孔和不加药的细胞悬液孔作为对照组,接着放入恒温培养箱中继续培养24h、48h、72h。然后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL),继续孵育4h,终止培养。吸弃孔内培养液,每孔加入150μLDMSO,摇床振荡10min。492nm下,酶标仪测定各孔光密度值(OD),记录结果。使用Graphpad-prism-5软件计算药物的半数抑制浓度(IC50)。采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析和LSD检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。
其中,姜黄素脂质体(CUR-LPs)的制备方法为:称取适量卵磷脂(PC)、胆固醇(CHO)、姜黄素(CUR)、于圆底烧瓶中,用20mL三氯甲烷超声溶解后,40℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜,再加入20mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5),60℃下旋转20min使膜溶解,60℃恒温磁力搅拌20min,0.22μm的滤膜滤过即得。其中,PC:519mg CHO:100mg CUR:10mg计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%
结果如图11-13所示iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体对A549细胞的毒性最强,细胞存活率最低,给药72h的IC50为[(12.61±0.84)μg/L],其次为姜黄素胡椒碱脂质体[IC50为(16.13±0.81)μg/L],与姜黄素溶液组比较,iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体组的存活率显著降低(P<0.05)。iRGD肽本身具有良好的生物相容性,但是对于存在于肿瘤上特定受体有强亲和力,能够靶向肿瘤或肿瘤微环境,因此iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体与未修饰的姜黄素胡椒碱脂质体相比较细胞存活率有所下降。胡椒碱能通过抑制Bcl-2通路达到诱导A549细胞凋亡作用,故姜黄素胡椒碱脂质体与姜黄素脂质体相比细胞存活率有所下降,在给药24h时,效果最为明显。以上结果表明,iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体对肿瘤细胞的抑制作用较普通脂质体有所增强。其中,图11-13中,与姜黄素脂质体组比较,*P<0.05;**P<0.01,(x±s,n=4)每次做试验为四个复孔。每个复孔操作剂量完全一致。x±s统计符号,即标准偏差。
实施例10
如图14所示,本实施例公开一种旋转蒸发仪,包括蒸发瓶1、收集瓶2、冷凝器3、集中管4、旋转导流机构、水浴锅6;旋转导流机构能带动多个蒸发瓶1旋转;水浴锅6用以对蒸发瓶1进行加热;集中管4分别与蒸发瓶1、冷凝器3连通,冷凝器3与收集瓶2连通。从蒸发瓶1蒸发出的蒸汽能通过集中管4流入至冷凝器3中,冷凝产生的液体能收集在收集瓶2中。
如图15-19所示,旋转导流机构包括中心轴51、中心齿轮52、导流管53、分离转动管体结构、旋转齿轮55;
在中心轴51上套接有中心齿轮52,中心齿轮52能相对中心轴51向下滑动,在中心轴51的外壁设置上下导向的导向凸起511,在中心齿轮52的内壁上开设有上下导通的第一缺口521,导向凸起511伸入至对应的第一缺口521中。
在中心齿轮52的外侧啮合有旋转齿轮55,多个旋转齿轮55绕着中心轴51环绕分布。中心齿轮52与旋转齿轮55形成非正交齿轮副。
在每一个旋转齿轮55上均套接有导流管53,导流管53呈倾斜状,导流管53位置较低的一端设置有分离转动管体结构;在导流管53上通过第一轴承(图中未画出)转动配合有支架561,在中心轴51上还滑动配合地套设有滑块562,滑块562的内壁上开设有第二缺口5621,导向凸起511伸入至对应的第二缺口5621中;滑块562与中心齿轮52之间连接有连接杆563。滑块562通过第二轴承572与集装板564转动配合,集装板564与支架561之间通过衔接连杆565固定。
如图20所示,导流管53位置较高的一端与中间管71的一端之间相通且通过第三轴承573与中间管71转动配合,中间管71的另一端与集中管4之间通过能形变的弯管72(弯管72如PVC软管、PE软管或者其他现有技术的管体)连通。在集中管4上设置有上下导向的导轨41,中间管71与导杆73的一端连接,导杆73的另一端与导轨41滑动配合。
如图21所示,分离转动管体结构包括滑动块541、连接管体542、第一弹簧543;滑动块541与导流管53在导流管53的导向滑动配合,连接管体542与滑动块541转动配合;在连接管体542与滑动块541之间连接有第二弹簧(如扭簧)544;第一弹簧543连接在滑动块541、导流管53之间使得连接管体542呈倾斜状、连接管体542的一端伸入至导流管53中。
如图22所示,在连接管体542的另一端设置有接口545;蒸发瓶1的开口通过接口545与连接管体542的另一端接通。
如图14所示,还包限位支架561,限位支架561用以支撑支架561。
如图15、23-26所示,提升装置的提升端81上设置有抵压盘82,当抵压盘82向上运动至与滑动块541的第一坡面结构5411相抵压时,能带动滑动块541向外移动至连接管体542与导流管53相分离;当提升装置的提升端81向上移动至其端部与支架561接触时,能带动相分离状态下的连接管体542与导流管53同步向上运动至连接管体542上的第二坡面结构5421与抵压环83接触,带动连接管体542的另一端向下转动至连接管体542呈竖直状或者近似竖直状。
本发明的提升装置优选为气缸,提升装置的提升端81为气缸的活塞杆端。
本实施例的旋转蒸发仪工作原理:
将多个蒸发瓶1分别安装在对应的各个接口545上时,本发明通过将气缸的活塞杆端向上运动至抵压盘82率先与各个滑动块541的底部第一坡面结构5411的接触,带动滑动块541向外运动,当滑动块541向外运动至连接管体542与导流管53相分离时,此时,气缸的活塞杆端的端部向上移动至与支架561的底部接触的位置,带动支架561脱离限位支架561向上运动,支架561向上运动同步带动抵压盘82、各个滑动块541、连接管体542、导流管53、滑块562、中心齿轮52、旋转齿轮55、中间管71、导杆73向上运动,各个弯管72发生形变。当连接管体542上的第二坡面结构5421与抵压环83接触时,带动连接管体542的另一端向下转动,直至连接管体542呈竖直状或者近似竖直状,气缸停止运动。将各个蒸发瓶1的开口向上以竖直状或者近似竖直状安装在对应的各个接口545中,实现蒸发瓶1的竖直或者近似竖直状安装,且此时,各个蒸发瓶1位于水浴锅6上方,与水浴锅6之间存在高度差。
将安装后的各个蒸发瓶1进行水浴加热时,当水浴锅6中的水温达到设定温度后,通过气缸的活塞杆端向下运动,同步带动抵压盘82、各个支架561、滑动块541、连接管体542、导流管53、滑块562、中心齿轮52、旋转齿轮55、中间管71、导杆73向下运动,连接管体542逐渐脱离抵压环83,第二弹簧544复位运动带动连接管体542复位转动,当连接管体542完全脱离抵压环83时,连接管体542复位转动至其中轴线与导流管53的中轴线共线,支架561向下运动至重新支撑在限位支架561的上方。气缸的活塞杆端继续向下复位运动的过程中,第一弹簧543逐渐复位运动,使得连接管体542在滑动块541的复位向内滑动的作用下,其一端重新呈倾斜状伸入至导流管53中与导流管53连通。此时,各个蒸发瓶1的底部浸入至水浴锅6的水中。
电机(图中未画出)的输出轴与中心轴51连接,启动电机,带动中心轴51转动,中心轴51转动带动中心齿轮52转动,从而带动各个旋转齿轮55转动,使得各个蒸发瓶1旋转,从蒸发瓶1蒸发出的蒸汽依次通过连接管体542、导流管53、中间管71、弯管72,能通过集中管4流入至冷凝器3中,冷凝产生的液体能收集在收集瓶2中。
如图15、16所示,进一步,支架561为环形支架,包括上环形支架5611、下环形支架5612,集装板564与下环形支架5612之间通过衔接连杆565固定。
每一根导流管53均分别通过一个第一轴承与上环形支架5611、通过另一个第一轴承与下环形支架5612转动配合。
进一步,上环形支架5611、下环形支架5612之间连接有固定杆(图中未画出)。
进一步,抵压环83可以通过支撑杆(图中未标出)固定在水浴锅6上。
进一步,限位支架561可以固定在水浴锅6上。
进一步,冷凝器3为现有技术,如冷凝管。
进一步,在冷凝器3的顶部还与排汽管91连通,在排汽管91上设置有真空泵(图中未画出),排汽管91与收集罐92连通。
进一步,在排汽管91上设置有阀门,优选为单向阀。
如图21、22所示,进一步,在接口545的内壁、导流管53的内壁上均设置有密封圈10、进而加大连接管体542伸入至导流管53后的密封性以及蒸发瓶1与接口545之间的密封性。
进一步,蒸发瓶1的开口卡合在接口545中;或者蒸发瓶1的开口开设有外螺纹,在接口545的内壁上开设有外螺纹,蒸发瓶1的开口与接口545螺纹配合。
进一步,本发明的第一弹簧543优选为拉簧,第二弹簧544优选为扭簧。
进一步,本发明的拉簧始终处于拉伸状态,如此,利用拉簧的收缩力,加大连接管体542与导流管53之间的紧密接触程度。
进一步,本发明的近似竖直状为与竖直状之间的偏差角度在5°以内的倾斜状。
本发明相比现有技术存在以下技术效果:本发明通过在同一台旋转蒸发仪设置多个蒸发瓶1并能同时进行多个蒸发瓶1的旋转,进而能实现启动一台转蒸发仪即可进行多组样品的同时进行旋蒸处理,相比现有技术各个样品单独分别进行操作,极大地节省了操作时间、提高了操作效率。本发明通过分离转动管体结构的设置,即能满足各个蒸发瓶1在旋蒸时如现有技术以倾斜状浸入至水浴锅6中的水体中,满足与热水接触的充分程度,又能实现其在安装或者拆卸时不与水浴锅6接触,如此,能避免因水温过高而导致安装或者拆卸不便,也能使得蒸发瓶1在使用后与水浴锅6分离而加速其冷却速度,尤其是当需要做温度递增实验或者不同批次样品相同温度实验时,将当前旋蒸后的蒸发瓶1移出水浴锅6后,再对水浴锅6的水进行进一步加热的同时,能进行蒸发瓶1在非水浴环境下进行更换或者加料,而不必如现有技术为了避免高温接触而将水体排出后,才能实现蒸发瓶1在非水浴环境下进行更换或者加料,提高了同一批水体的使用次数以及避免对水体反复重新加热;还能实现各个蒸发瓶1在安装或者拆卸时呈竖直状或者近似竖直状,工作人员可以保证蒸发瓶1以开口向上的竖直状或者近似竖直状与接口545对合,相比现有技术需要将装有溶液的蒸发瓶1倾斜后再进行安装方式,能提高操作的稳定性、精确度以及顺畅性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、将COOH-PEG2000-DSPE、N-N-羟基琥珀酰亚胺、二氯乙烷、三氯甲烷混合反应,得到第一混合反应体系;
步骤二、iRGD多肽溶解,得到第二混合体系;
步骤三、将第一混合反应体系、第二混合体系混合反应,将反应产物旋蒸得到固体;
步骤四、固体置透析袋中透析后,冻干得到iRGD-PEG2000-DSPE;
步骤五、将姜黄素、胡椒碱、卵磷脂、胆固醇、iRGD-PEG2000-DSPE、DSPE-PEG2000、三氯甲烷混合,得到混合物;
步骤六、将混合物进行旋蒸成膜;
步骤七、将膜在酸性环境下溶解,并依次搅拌、过滤后,得到iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体;
其中,步骤五中胆固醇、卵磷脂的质量比为1:5.19;
其中,步骤六中所述旋转蒸发仪包括旋转导流机构;旋转导流机构能带动多个蒸发瓶同时旋转;旋转导流机构还包括导流管、滑动块、连接管体;滑动块与导流管在导流管的导向滑动配合,连接管体与滑动块转动配合;
当需要进行蒸发瓶安装或者拆卸时,包括以下步骤:
步骤6.1、滑动块向外运动使得连接管体脱离导流管;
步骤6.2、滑动块、连接管体同步向上运动使得倾斜状的蒸发瓶向上脱离水浴锅的同时转动至蒸发瓶的开口向上的竖直状或者近似竖直状;
当进行蒸发瓶旋转蒸发时,包括以下步骤:
步骤6.3、滑动块、连接管体同步向下使得竖直状或者近似竖直状的蒸发瓶向下运动至其底部伸入至水浴锅的同时转动至蒸发瓶呈倾斜状;
步骤6.4、滑动块向内运动使得倾斜状的连接管体的一端伸入至导流管中;
其中,步骤七中,在 60℃恒温磁力搅拌20min,0.22µm的滤膜滤过,得到iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。
2.根据权利要求1所述的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法,其特征在于,所述步骤四中,固体置于500分子截留量的透析袋中透析3天。
3.根据权利要求1所述的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法,其特征在于,步骤六中在35~45℃下用旋转蒸发仪将溶剂蒸干成膜。
4.一种采用如权利要求1-3任意项所述的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体的制备方法制备得到的iRGD肽修饰共载姜黄素和胡椒碱脂质体。
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