CN100998563A - 磁性多柔比星脂质体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明方法制备的磁性多柔比星脂质体,其平均磁响应性为50.28emu,平均包封率为30.8%±3.27%,平均粒径为293.4nm。它克服了现有制备方法工艺复杂、成本较高,不能较好地兼顾好粒径的大小和磁响应性高低的关系的缺点。采用本发明方法制备的磁性多柔比星脂质体具有粒径小、磁响应性高和包封率高的特点。本发明还同时公开了这种磁性多柔比星脂质体的制备方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药载体材料,更具体地说它是一种磁性多柔比星脂质体,本发明还涉及这种磁性多柔比星脂质体的制备方法和应用。
背景技术
随着纳米技术、生物工程技术的不断进步,非病毒载体的研究也发展到了一个新的阶段。目前,药物/核酸转运系统已经发展到靶向转运系统。该系统将能携带效应分子,主动或被动地转运到机体的靶部位发挥治疗作用,而对其它部位的毒副作用很低。国内外的研究显示,在四氧化三铁晶粒表面包附一层生物大分子(如蛋白质,脂质体,多糖等),能够得到良好的生物相容性和生物安全性。而且这种磁性微球具有磁响应性,在外加梯度磁场作用下能够趋向运动,可以作为携带药物或核酸分子的载体骨架进行肿瘤的磁控靶向治疗。其中,多糖类高分子聚合物更具有可生物降解、几乎无免疫原性的优点。而且其良好的亲水性使其可以制备成亲水凝胶状的纳米颗粒。这种天然的亲水表面能减弱机体内巨噬细胞的吞噬作用,延长其在血液中的循环时间,因此很适合用于生物大分子类药物的传递。
四氧化三铁(Fe3O4)磁性微粒毒性低,具有磁响应性。当磁性微粒的粒径足够小时,具有超顺磁性,即在外加磁场中有较强的磁性,撤离磁场时磁性很快消失,剩磁为零,不会被永久磁化。因此,四氧化三铁磁性微粒成为目前生物磁性材料领域的一个研究热点。
脂质体作为药物载体具有独特的优势。脂质体的粒子大小处于纳米级的范围,具有无毒、无免疫原性、可降解、缓释等特点。磁性脂质体是磁导向药物传递系统中一种新型的药物导向载体,可通过外磁场对肿瘤实施引导定位治疗,在靶区产生持续高浓度药物,增强对肿瘤细胞的杀伤作用,而在非肿瘤部位分布很少,可降低毒副作用。国内外学者就生物磁学用于恶性肿瘤的治疗进行了初步研究,认为恒定磁场具有抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用,磁性微粒在足够强的外磁场作用下,可以引导负载药物在体内定向移动、定位浓集,从而达到提高药物治疗指数,降低药物毒副作用的目的。
磁性多柔比星(阿霉素)脂质体具备的靶向性、低毒性和缓释性等特点日益受到各国学者的重视,人们不断尝试制备粒径更小、磁响应性更强的磁性多柔比星脂质体,然而迄今为止相关的制备方法均较复杂、成本较高,不能较好地兼顾好粒径的大小和磁响应性高低的关系,尚没有形成成熟统一的制备方法。本发明采用简单易行、成本低廉的方法研制粒径微小、磁响应性高的磁性多柔比星脂质体材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性多柔比星脂质体。
本发明的另一个目的在于提供这种磁性多柔比星脂质体的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供这种磁性多柔比星脂质体在作为医药载体材料中有应用。
本发明的目的是通过如下措施来达到的:磁性多柔比星脂质体的制备,其特征在于它包括如下步骤:
(1)纳米四氧化三铁磁性体的制备:其化学反应式
Fe2++2Fe3++80H-=Fe3O4+4H2O,
其步骤为:将等体积的FeSO4和FeCL3按1∶2摩尔浓度比混合,然后添加NaOH调定PH值为13.5,加入双蒸水后再调定PH值为7.4,加热至70℃,恒温加热4小时,同时搅拌并通入氧气,得到黑色Fe3O4沉淀,充分水洗和丙酮清洗抽滤得到黑色泥沙状物,真空干燥后可以得到Fe3O4超微颗粒,用生理盐水溶解Fe3O4得到14.5mol/ml;
(2)再称取5g多柔比星溶解于制备好的磁液里形成混合液,多柔比星和四氧化三铁之间无紧密结合,充分振荡20分钟和超生粉碎10分钟,冰浴于4℃水中,后1000r/min离心5分钟,用蒸馏水进行定容分别制备出0.5mg/ml的多柔比星磁液;
(3)脂质成分的超声乳化:按2∶1V/V的比例抽取氯仿/甲醇共2ml放入试管里,按7∶2∶1的比例称量L-α-磷脂酰乙醇胺、胆固醇、L-α-磷脂酰胆碱,要求总脂浓度100umol/ml加入试管,充分振荡使混合液之间的界面完全消失完全混合溶解;
(4)脂质薄膜的形成:用氮气吹去1/4溶剂后加入旋转蒸发器的茄形瓶在真空状态下进行旋转蒸发,温度控制在45℃恒温状态,转速为60r/min直至在瓶壁形成一层均匀淡黄色的薄膜;
(5)脂质体的形成:抽取0.5mg/ml的多柔比星磁流体3ml和0.5g玻璃珠加入茄形瓶里,在室温下进行旋涡振荡30min直至薄膜脱落完全,将初液倒入试管内进行超声粉碎间断脉冲20min,静置12小时完成封闭过程后进行离心4000r/min,10分钟取上清夜;
(6)磁性多柔比星脂质体的洗脱和分离:选用葡聚糖凝胶对制作的磁性多柔比星脂质体初液进行洗脱和分离,即得磁性多柔比星脂质体材料。
按权利要求1制备方法所制备的磁性多柔比星脂质体,其平均磁响应性为50.28emu,平均包封率为30.8%±3.27%,平均粒径为293.4nm。
磁性多柔比星脂质体作为医药载体在制药中的应用。
本发明磁性多柔比星脂质体具有如下优点:将用最佳工艺制备的磁性多柔比星脂质体用磁测仪(3257-35,日本)在室温下按HG/T3247.2-92标准测试其平均磁响应性为50.28emu,用原子吸收光谱分析仪测定未经消化处理的磁性脂质体的铁含量,测得的铁含量非常低,而经消化处理的磁性脂质体平均铁含量为0.15mg/ml,可见磁性成分被脂质体完好包裹,计算出的磁性成分包封率为30.8%±3.27%,平均粒径为293.4nm。
本发明磁性多柔比星脂质体具有粒径小、磁响应性高和包封率高的特点。
附图说明
图1为四氧化三铁的电镜照片。
图2为磁性多柔比星脂质体原子力显微镜照片(三维)。
图3为磁性多柔比星脂质体原子力显微镜照片(二维)。
图4为磁性多柔比星脂质体粒径分析图。
图5为磁性多柔比星脂质体粒径分析结果。
图6为磁性多柔比星脂质体电镜照片。
图7为磁性多柔比星脂质体样品。
具体实施方式
磁性多柔比星纳米脂质体的制备
1.实验材料
1.1药品与试剂
氯化铁(FeCl3),硫酸亚铁(FeSO4),氢氧化钠(NaOH),表面活性剂聚山梨酯80,司盘80,乙醚(C4H10O),丙酮(C3H6O)等均为分析纯,购自上海化学试剂有限公司;硝酸、高氯酸(优级纯)。
L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-PE),L-α-磷脂酰胆碱(L-α-PC),胆固醇(CHOL),均为日本和光纯药工业株式会社产品;葡聚糖凝胶(Sephadex G-50,Pharmacia进口分装);盐酸多柔比星(深圳万乐制药有限公司);实验用水为双蒸水。
1.2仪器
JJ-3控温电动搅拌器:常州国华电器有限公司;
RE-52C旋转蒸发器:河南巩义市英峪予华仪器厂;
SHZ-D型循环水式真空泵:河南巩义市英峪予华仪器厂;
JY92-II超声细胞粉碎机:宁波科生仪器厂;
UV-260紫外分光光度仪:日本岛津,同济医学院附属协和医院药剂科提供;
Zetapal无机粒度分析仪:Brookhaven instruments corporation,武汉理工大学复合材料国家重点实验室提供;
OPTON EM10C型透射电镜:同济医学院超微病理教研室;
原子吸收光谱分析仪:美国Warian公司;
原子力显微镜(Nanoscope-4):美国DI Corp,武汉理工大学电镜中心;
3257-35磁测仪:日本,武汉磁性材料检测中心;
TGL-16G高速离心机,JA1003型电子天平;
固体永磁铁:0-2000Gs,包头磁性材料厂;
TGL-16G高速离心机,CTS24型磁强仪,PHSJ-4型酸度计,JA1003型电子
天平:同济医学院附属协和医院腹腔镜实验室提供;
所有玻璃仪器均须经过重铬酸钾洗液和双蒸水严格清洗以除去溶液中杂质。
2试验方法和结果
2.1磁性多柔比星脂质体的制备
2.1.1多柔比星磁流体的制备
制备四氧化三铁的共沉淀法的试验反应原理为:Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4+4H2O
我们用共沉淀法制备Fe3O4磁流体。取一定浓度的FeSO4和FeCL3混合,然后添加NaOH得到灰白色碱性悬液,调定PH值为13.5,加定量双蒸水进行定容,加热至一定温度(70℃),恒温加热搅拌中通入氧气后得到黑色Fe3O4沉淀,充分水洗和丙酮清洗抽滤得到黑色泥沙状物,真空干燥后可以得到Fe3O4超微颗粒。根据使用的不同途径和要求我们可以用生理盐水来溶解Fe3O4。此次试验我们用双蒸水加入表面活性剂溶解Fe3O4超微颗粒得到不同浓度的磁液备用。经Zetapal无机粒度分析仪测量Fe3O4超微颗粒平均粒径为10nm。加双蒸水将磁液浓度调定为10mg/mL。再将精确称取盐酸多柔比星溶解于制备好的磁液里形成混合液,多柔比星和四氧化三铁之间无紧密结合。充分振荡和超声粉碎(冰浴于4℃水中)后高速离心,用蒸馏水进行定容分别制备出2、1、0.5mg/ml(盐酸多柔比星的含量)的三种浓度的多柔比星磁液(B),放置于-4℃冰箱备用。
2.1.2磁性多柔比星脂质体的制备(逆相蒸发法)
脂质体药物的制备方法很多,方法不同所制备脂质体药物的粒径、层次及药物的包封率不同。目前常用的制备方法可分为3大类,即机械分散法、两相分散法和表面活性剂法。逆相蒸发法适用于包裹水溶性药物,试验步骤如下:
(1)脂质成分的超声乳化:按2∶1V/V的比例抽取氯仿/甲醇共2ml放入试管里,按7∶2∶1的比例精确称量L-α-磷脂酰乙醇胺(L-α-PC)、胆固醇(CHOL)、L-α-磷脂酰胆碱(L-α-PE),要求总脂浓度100umol/ml加入试管,充分振荡使混合液之间的界面完全消失完全混合溶解。振荡溶解后分别进行超声粉碎0min、2min和4min(A)。
(2)脂质薄膜的形成:用氮气吹去一部分溶剂后加入旋转蒸发器的茄形瓶在真空状态下进行旋转蒸发,温度控制在45℃恒温状态,转速为60r/min直至在瓶壁形成一层均匀淡黄色的薄膜。
(3)脂质体的形成:抽取不同浓度的多柔比星磁流体2ml、3ml、6ml(D)和0.5g玻璃珠加入茄形瓶里,在室温和大气压的条件下进行旋涡振荡30min直至薄膜脱完全落。将初液倒入试管内进行超声粉碎间断脉冲0min,10min和20min(C),静置12小时完成封闭过程后进行离心(4000转)10分钟取上清夜。脂质体初液的制作完成后将其置于-4℃冰箱保存。选用葡聚糖凝胶对制作的磁性多柔比星脂质体初液进行洗脱和分离,即得磁性多柔比星脂质体材料。
2.2磁性多柔比星脂质体最佳制备工艺的确定
正交设计方法是利用一套规格化的正交表,使每次试验的因素及水平得到合理的安排。通过试验结果的分析,获得较全面的信息,从中找出各因素对试验观察指标的影响,并能找出各因素的主次地位及交互作用,能发现诸因素各水平的最佳组合,是进行多因素多水平试验效率最高的设计方法。因此,正交设计已广泛应用于各科研领域。利用正交设计方法对工艺条件进行探讨,可以以较少次的试验获得了较佳的提取工艺、技术条件与方案。
根据对文献的分析,本次实验排除了一些已经被证实的因素后选择五个因素进行实验设计。因为多柔比星磁液中磁性四氧化三铁成分的浓度和多柔比星的浓度成正比关系所以将这两个因素归为同一因素进行设计。四个因素为:旋转蒸发前对脂质溶剂超声粉碎(A);多柔比星磁液浓度(B);旋转蒸发后对混合液超声粉碎(C);脂水相体积比(D),以四因素三水平的正交实验设计对脂质体包封率的影响,以确定最佳的制备工艺。正交实验设计各因素水平见表1,按照正交助手程序推算出的组合进行磁性多柔比星脂质体的制作,并用上述的步骤方法进行经葡聚糖层析柱洗脱分离,紫外法测定多柔比星脂质体包封率及含量。将测得的各个样品的包封率输入正交助手程序,演算出的结果科见表2。由表2可知,四个因素中对磁性多柔比星脂质体包封率的影响力大小顺序为:C>A>B>D,四个因素组合中以包封率为观察对象而推算出最佳包封率的工艺为A1B3C3D2。即为在蒸发前对脂质溶剂超声粉碎0min(Al),多柔比星磁液浓度为0.5mg/ml(B3),蒸发后对混合液超声粉碎20min(C3),脂水相体积比为1∶1.5(D2)的条件下制作的多柔比星磁性脂质体的包封率最高。
2.2.4利用最佳工艺制备的磁性多柔比星脂质体包封率测定
重复按最佳工艺即为在蒸发前对脂质溶剂超声粉碎0min(Al),多柔比星磁液浓度为0.5mg/ml(B3),蒸发后对混合液超声粉碎20min(C3),脂水相体积比为1∶1.5(D2)的条件下制作多柔比星磁性脂质体共9组。然后通过葡聚糖层析柱分离洗脱,分别收集包封的磁性多柔比星脂质体的洗脱液和未包封的多柔比星磁液脱洗液。对多柔比星磁液脱洗液稀释成上述浓度-吸光度的线形回归方程范围的浓度,按照包封率的公式
Qw%=(W总-W游)/W总×100%
计算出各个包封率,求均值。在该条件下制备的磁性多柔比星脂质体平均包封率为30.8%±3.27(n=9)。
2.3磁性多柔比星脂质体的电镜观察及粒径分布:
磁性多柔比星脂质体肉眼观呈均匀分布橙红色液体,在原子力显微镜(武汉理工大学材料研究与测试电镜中心提供)下磁性多柔比星脂质体外观为圆形或椭圆形,直径分布为200-400nm,粒径分布均匀,电镜照片见图3及图4。按最佳工艺分别制备9个的磁性多柔比星脂质体样品,用蒸馏水稀释后用激光粒度分析仪(武汉理工大学提供)进行测定,经动态光散射处理软件处理,得到平均粒径为293.4nm±20.6。
表1因素和水平
A(min) | B(mg/ml) | C(min) | D(V/V) | |
123 | 024 | 210.5 | 01020 | 1∶11∶1.51∶3 |
A:旋转蒸发前对脂质溶剂超声粉碎;B:多柔比星磁液浓度;
C:旋转蒸发后对混合液超声粉碎;D:脂水相体积比。
表2.结果分析
A | B | C | D | 结果 | |
123456789 | 111222333 | 123123123 | 123231312 | 123312231 | 20.725.526.220.921.319.424.919.625.7 |
均值1均值2均值3极差 | 24.13320.53323.4003.600 | 22.16722.13323.7671.634 | 19.90024.03324.1334.233 | 22.56723.26722.2331.034 |
2.4纳米级磁性多柔比星脂质体的磁响应性测定和铁含量
磁性多柔比星脂质体的体外磁场响应性检测在装有磁性多柔比星脂质体的玻璃瓶旁用固体永磁铁施加磁场后可见磁性多柔比星脂质体在3min内迅速聚集在磁铁一侧,取混悬剂一滴置于载波片上在倒置显微镜下观察,可以看到纳米粒快速向磁铁方向运动和聚集,磁性脂质体几乎全部集中在磁铁一侧,并且可以随着磁铁的运动而变化。
将用最佳工艺制备的磁性多柔比星脂质体用磁测仪(武汉磁性材料中心提供)在室温下按HG/T3247.2-92标准测试其平均磁响应性为50.28emu。用原子吸收光谱分析仪(华中科技大学同济医学院提供)分别测定磁性多柔比星脂质体洗脱液和四氧化三铁洗脱液的铁含量。依据公式:
Qw%=(W总-W游)/W总×100%
Qw%表示包封率;W总表示总铁含量;W游表示游离铁量。
将制备的磁性多柔比星脂质体、多柔比星脂质体和磁性空白脂质体封装入瓶,采用辐射灭菌法连续辐照装置产生的射线照射消毒。磁性多柔比星脂质体成品样本呈均匀粉红色液体。
计算出的磁性成分包封率为35.2%±4.82,可知按最佳工艺制备的磁性多柔比星脂质体具有非常好的磁响应性和磁性材料包封率高。
由以上实验可知按最佳方案用反相蒸发法制备的磁性多柔比星脂质体具有粒径小、磁响应性高和包封率高的特点。
3磁性多柔比星纳米脂质体的体外细胞毒试验
3.1细胞与细胞培养
人大肠癌细胞株常规培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基加100U/mL的青霉素、链霉素中维持生长;用0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶消化传代。培养条件:37℃、5%CO2的潮湿环境。培养时进行细胞计数和细胞生长曲线测定。细胞计数是了解培养细胞的生长状态;细胞生长曲线测定:将生长良好的细胞接种于24孔培养板中,每孔接种5×104个细胞,分为3组,每组21孔,10%小牛血清的RPMI-1640培养基加10%小牛血清、100U/mL的青霉素、链霉素中维持生长,置37℃、5%CO2的培养箱中培养,连续培养7天,逐日取各组细胞3孔,台盼兰染色后计数细胞,以细胞数(Y轴)和培养时间(X轴)为轴绘出各组细胞的生长曲线。因为细胞在对数生长期细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究,所以我们进行细胞毒检测选择在癌细胞的对数生长期进行。
3.2MTT法测定DOX对肿瘤细胞增殖变化
3.2.1MTT法的原理:
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法,它具有快速、简捷之优点,且与临床有较好的相关性。其原理是活的肿瘤细胞内线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把四氮唑蓝(MTT)还原成有色化合物,而死细胞无此功能;二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比,再用酶标仪测定OD值。根据这一原理,在培养板中加入一定数量肿瘤细胞悬液,然后加入一定浓度的化疗药物培育3-4天,移去培养液后加入三联液(SDS-异丁醇-盐酸)培养过夜后生成的有色化合物,将样本在酶标仪检测光密度值(OD)的变化,就能定量反映残余肿瘤活细胞数目的变化,所以后者的生成量与活细胞数目呈正相关,从而确定对化疗药物的敏感性。在多种化疗药敏试验方法中,MTT法近年来备受推崇,广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。
3.2.2MTT法测定肿瘤细胞增殖变化
(1)48小时毒性试验设计:取人大肠癌LoVo细胞株稀释成1×104/ml的单细胞悬液,加在96孔培养板上,每孔0.1ml,在有磁场和没有磁场作用下分别加入多柔比星、多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体及1640液(空白对照组)共4组,以多柔比星浓度为标准设(DOX血药峰浓度2.4ug/ml)5个组,分别为0.02、0.2、2、20和200ug/ml。每个浓度设4个复孔,置37℃、5%CO2饱和湿度培养48小时,弃上清。每孔加MTT20ul(浓度5mg/ml)继续培养4小时,每孔加入50ul三联液(SDS-异丁醇-盐酸)培养过夜,在酶标仪上以570nm波长检测光密度值(OD值)。
生存率=实验组OD值/对照组OD值×100%
(2)化疗药物作用时间与抑瘤率的关系试验:取多柔比星、多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体及1640液(空白对照组)其中各组的多柔比星浓度为2ug/ml,每个组设4个复孔,置37℃、5%CO2饱和湿度培养。培养时间分为0.5小时、1小时、24小时、48小时和72小时5个组。然后分别弃上清,每孔加MTT20ul(浓度5mg/ml)继续培养4小时。每孔加入50ul三联液(SDS-异丁醇-盐酸)培养过夜。在酶标仪上以570nm波长检测光密度值(OD值)。计算各组的抑瘤率。
抑瘤率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%
3.3克隆(集落)形成试验
(1)原理:克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一,其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,称为克隆或集落。每个克隆可含有50个以上的细胞,大小在0.3~1.0mm3之间。通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力作定量分析,了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性,克隆形成率高者其独立生存能力强。这种方法常用于抗癌药物敏感性试验,肿瘤放射生物学试验等。常见的方法有平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验。体外集落形成法,是评价细胞活性敏感性强的有效方法。肿瘤细胞“存活”的含义,是指那些保留了完整的生殖能力,能无限分裂产生大量子细胞形成一个集落或克隆的肿瘤细胞。有的细胞虽未死亡,但失去了无限增殖的能力,亦被当成死亡细胞,或称“增殖性死亡”细胞。克隆形成法已用于医学诸多学科的研究领域。
(2)试验步骤:
1.制备细胞悬液:取对数生长期的单程培养细胞,用0.25%胰蛋白酶溶液消化并吹打成单个细胞悬液,把细胞悬浮在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。
2.接种细胞:根据细胞增殖能力,将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度接种于培养皿中。按每皿含100个细胞密度,分别接种于含10ml预温37℃的培养液的培养皿中,两个为一组。然后以十字方向轻轻晃动培养皿,使细胞分散均匀。
3.培养:将平皿移入CO2孵箱,在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下,静止培养1天。当细胞已经完全附壁生长后,加入含有2ug/ml磁性多柔比星脂质体的培养液,每组的A瓶放在磁场下;B瓶无磁场作用利用我们设计的循环装置进行循环作用20分钟。停止作用后在37℃、5%CO2及饱和湿度环境下继续培养1天后换成RPMI1640培养液培养2周。
4.染色:当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去培养液,用PBS(0.01mol/L,pH7.4)小心浸洗2次。加纯甲醇5ml固定15min。弃去固定液,加适量姬姆萨应用液染色10-30min,然后流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
5.计数:将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。按下列公式计算克隆形成率(PE)和细胞存活率(SF)。
PE=集落形成数/接种细胞数×100%
SF=照射后细胞集落形成数/(PE×接种细胞数)×100%
3.4结果
(1)48小时毒性试验结果:细胞形态学观察经药物处理后在高倍镜下观察细胞的形态改变。部分细胞胞体缩小,染色质变粗糙,核仁减少或消失,核浆比例降低;部分细胞胞浆浓缩,染色质浓缩聚集于核膜下,可见核碎裂现象,呈现细胞凋亡的特征性改变。
在有磁场和没有磁场条件下多柔比星、多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体对大肠癌细胞作用的生存率见表1。经方差分析SNK法检验,在没有磁场作用条件下多柔比星、多柔比星脂质体和磁性多柔比星纳米脂质体对大肠癌细胞的杀伤效果之间均无明显差异(P>0.05);多柔比星在有磁场和没有磁场作用对癌细胞的杀伤率没有显著差异(t=2.91 P=0.0437);多柔比星脂质体在有磁场和没有磁场作用对癌细胞的杀伤率也没有显著差异(t=2.29 P=0.0840);而在有磁场作用下磁性多柔比星脂质体对细胞的杀伤率明显高于没有磁场作用时。(t=3.51P=0.0248)
表1.48小时大肠癌细胞生存率
DOX浓度 | DOX(%) | DOX-LIP(%) | MDLP(%) | |||
+ | - | + | - | + | - | |
0.020.2220200 | 97.5±1.380.1±3.648.2±2.827.1±3.83.8±1.5 | 98.5±0.282.5±3.251.6±3.728.5±4.23.9±2.0 | 97.1±0.578.9±5.046.3±5.226.4±5.24.1±2.1 | 98.5±0.680.4±5.848.6±4.827.3±4.93.5±2.2 | 96.7±1.175.8±6.241.9±3.224.5±3.81.8±3.2 | 98.2±0.879.0±3.147.6±2.526.8±4.63.1±2.7 |
+:有磁场作用 -:无磁场作用
(2)化疗药物作用时间与抑瘤率的关系试验:通过表2可以分析,多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体在0.5和1小时时对癌细胞的杀伤率与DOX相比有显著差异(P<0.05),多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体在0.5和1小时时对癌细胞的杀伤率比多柔比星的杀伤率低。而随着时间的延长,在24小时以后多柔比星、多柔比星脂质体、磁性多柔比星纳米脂质体对癌细胞的杀伤率已经无显著意义(P>0.05)。
表2.作用时间与抑瘤率关系
时间(h) | DOX(%) | DOX-LIP(%) | MDLP(%) |
0.51244872 | 5.6±2.110.2±2.130.1±2.550.2±2.869.1±2.4 | 3.1±1.86.7±1.631.8±5.151.6±4.870.5±2.6 | 3.5±1.47.9±2.332.4±2.653.6±2.572.1±2.7 |
(3)克隆(集落)形成试验
在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数。按公式计算克隆形成率(PE),A组(磁场作用组)的PE为57.4%±5.5%;B组(无磁场作用组)的PE为82.8%±8.5%。经过t检验p<0.01,说明两组克隆率有显著性差异。
4.1磁场对多柔比星、多柔比星脂质体和磁性多柔比星脂质体杀伤性的作用
由48小时毒性试验说明在没有磁场作用下同一浓度的多柔比星、多柔比星脂质体和磁性多柔比星脂质体对人大肠癌细胞的生存率无显著差异,杀伤率相同。多柔比星和多柔比星脂质体在有磁场作用和无磁场作用的没有显著差异说明他们对于磁场作用无明显效果。而磁性多柔比星脂质体在磁场作用下比无磁场作用对癌细胞的杀伤率有显著性差异(P>0.05),在磁场作用下磁性多柔比星脂质体对人大肠癌细胞的杀伤率明显提高。说明磁场有利于多柔比星的释放,符合国外医学报道。近年来的研究证实磁场具有抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用,体外磁场本身对肿瘤生长具有抑制作用[12]。磁场诱导与化疗药物相结合的磁化疗比单用化疗药物具有更强的杀伤肿瘤细胞的作用[37]。其作用机理多数学者认为,在磁场的作用下,S期细胞增多,并阻断于G2期使M期细胞减少,干扰细胞的有丝分裂,使DNA合成降低[38];同时磁场能使瘤细胞生物膜的功能发生变化,影响细胞膜的物质交换,与化疗药物联用可使瘤细胞对抗癌药物的通透性增加,增强抗癌药物的细胞毒作用。磁性多柔比星纳米脂质体具有良好的磁靶向性,由于肿瘤组织与正常组织在磁场上具有差别,磁性纳米脂质体选择性地聚集于肿瘤组织,大大的提高了肿瘤组织的化疗药物浓度[39]。
4.2药物作用时间对抑瘤率的影响
由化疗药物作用时间与抑瘤率的关系试验可以知道,在短时间的作用下,多柔比星对癌细胞的杀伤率比多柔比星脂质体和磁性多柔比星纳米脂质体对癌细胞的杀伤率高,而在24小时后三者之间的杀伤率无差别。说明纳米脂质体包封的药物有一个缓慢释放的过程,在短时间内,多柔比星不能完全从脂质体释放出来,所以造成在0.5和1小时时磁性多柔比星脂质体对人大肠癌细胞的杀伤效果不如多柔比星的效果好。但是随着作用时间的延长,我们发现这三种化疗药物对癌细胞的杀伤效果无显著差异,就是说当时间延长后,多柔比星得到完全释放后,其作用效果没有下降,与单纯多柔比星液体效果相同。由此可知,磁性多柔比星脂质体可以使较高的化疗药物浓度在肿瘤组织中维持较长的时间,从而在不同的细胞周期发挥作用,提高抗肿瘤效应。
4.3克隆(集落)形成试验
由48小时毒性试验我们可以得出在磁场作用下磁性多柔比星脂质体对大肠癌细胞的杀伤率高于没有磁场作用的杀伤率。国内外的报道都提示证实磁场具有抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用,体外磁场本身对肿瘤生长具有抑制作用。磁场诱导与化疗药物相结合的磁化疗比单用化疗药物具有更强的杀伤肿瘤细胞的作用。为了明确磁性多柔比星脂质体的磁响应性的特性,我们设计了特殊的体外克隆形成试验。当癌细胞进行体外集落形成的过程中,当细胞完全附壁生长后我们利用自行设计的循环装置,将两组细胞放在不同的情况下:A组外加磁场B组不加磁场。利用磁场的作用将磁性多柔比星脂质体较多的吸附在A组。试验结果显示在磁场作用下的A组集落形成率远低于无磁场作用的B组,说明磁性多柔比星脂质体有较好的磁响应性,可以在磁场的作用下进行定向移动,当脂质体破坏后可以对癌细胞进行作用。
磁性药物载体是目前国内外大力研究的治疗恶性肿瘤的一种新型药物靶向系统。理论上,理想的磁性药物载体应具备以下几个条件:①较好的磁场响应性,在靶部位放置外磁场后,经过靶部位的载体能100%滞留在靶部位;②粒径足够小使能够自由通过最小内径的毛细血管,不会发生异位栓塞和滞留;③不被网状内皮系统和其他正常细胞摄取;④药物载体具有较高的载药能力并可以进入靶细胞内,并在细胞内以控制的方式释放。与常规化疗相比,磁性药物联合外磁场对肿瘤细胞的选择性加强,不良反应小,疗效好。磁性纳米脂质体属于第四代给药系统同时具有脂质体和磁靶向药物化疗的优点,不仅减少了化疗药物的用量,降低其毒副作用,提高了杀伤率,而且无免疫原性,自身无毒、无药理作用,可以生物降解,也适合体内应用,是磁靶向药物给药系统中一种新型的药物靶向载体。目前应用磁靶向载体治疗肿瘤国内外均处于起步阶段,对于它的作用机制和效果还需要进行试验验证和完善。磁性多柔比星脂质体是一种具有抗癌靶向性的新剂型化疗药物,它同时集合了磁性材料的主动靶向性和脂质体材料的特点,进行互相协同作用,发挥出最好的效果。可以预见磁性脂质体作为一种控释药物的靶向载体将在肿瘤化学治疗中获得广泛的应用。
传统的化疗药物在体外具有良好的抗肿瘤活性,当使用静脉注射进行化疗时往往不能达到理想的效果。药物到达肿瘤部位的浓度低而且大多化疗药物具有较多的毒副作用,使得临床医生在使用这些药物的同时不能不考虑病人的身体状况和耐受能力。此次试验研究是以四氧化三铁作为磁性载体,利用脂质体将多柔比星磁流体包裹研制出纳米级磁性多柔比星脂质体并将其进行体外细胞毒研究。
本发明利用共沉淀法研制出平均粒径10nm的四氧化三铁,其粒度分布比较均匀,并且分散的非常好,磁响应性高。对四氧化三铁进行动物的药代动力学研究发现:四氧化三铁家兔静脉注射本品后呈双室模型代谢;在动物体内的分布依次为:肝脏、脾脏、心脏和肾脏;四氧化三铁在体内排泄缓慢,可以从粪便和尿液排出体外。
本发明应用逆相蒸发法制备纳米级磁性多柔比星脂质体,并以正交实验设计确定最佳制备工艺。利用原子粒电镜观察其形态;无机粒度分析仪测量其粒径分布;利用紫外-sephadex G-50法测定其包封率;利用磁测仪测量其磁响应性。证实制备的磁性多柔比星脂质体达到纳米水平,有较高的包封率和较强磁响应性,具备主动靶向制剂的特性。
本发明选择四氮唑盐比色法(MTT法)和体外克隆形成法研究磁性多柔比星纳米脂质体对人大肠癌细胞体外细胞毒作用。利用自行设计的循环装置进行体外克隆形成试验。证实在外加磁场的作用下磁性多柔比星纳米脂质体对人大肠癌细胞生长抑制与多柔比星和多柔比星脂质体有明显差异。在磁场循环装置下可见磁性多柔比星脂质体有较好的磁场响应性。
由上述可知,研制的磁性多柔比星纳米脂质体达到纳米水平,有较高的包封率和较强磁响应性,具备主动靶向制剂的特性;体外试验证实了其抗癌性。
Claims (3)
1、磁性多柔比星脂质体的制备,其特征在于它包括如下步骤:
(1)纳米四氧化三铁磁性体的制备:其化学反应式
Fe2++2Fe3++80H-=Fe3O4+4H2O,
其步骤为:将等体积的FeSO4和FeCL3按1∶2摩尔浓度比混合,然后添加NaOH调定PH值为13.5,加入双蒸水后再调定PH值为7.4,加热至70℃,恒温加热4小时,同时搅拌并通入氧气,得到黑色Fe3O4沉淀,充分水洗和丙酮清洗抽滤得到黑色泥沙状物,真空干燥后可以得到Fe3O4超微颗粒,用生理盐水溶解Fe3O4得到14.5mol/ml;
(2)再称取5g多柔比星溶解于制备好的磁液里形成混合液,多柔比星和四氧化三铁之间无紧密结合,充分振荡20分钟和超生粉碎10分钟,冰浴于4℃水中,后1000r/min离心5分钟,用蒸馏水进行定容分别制备出0.5mg/ml的多柔比星磁液;
(3)脂质成分的超声乳化:按2∶1V/V的比例抽取氯仿/甲醇共2ml放入试管里,按7∶2∶1的比例称量L-α-磷脂酰乙醇胺、胆固醇、L-α-磷脂酰胆碱,要求总脂浓度100umol/ml加入试管,充分振荡使混合液之间的界面完全消失完全混合溶解;
(4)脂质薄膜的形成:用氮气吹去1/4溶剂后加入旋转蒸发器的茄形瓶在真空状态下进行旋转蒸发,温度控制在45℃恒温状态,转速为60r/min直至在瓶壁形成一层均匀淡黄色的薄膜;
(5)脂质体的形成:抽取0.5mg/ml的多柔比星磁流体3ml和0.5g玻璃珠加入茄形瓶里,在室温下进行旋涡振荡30min直至薄膜脱落完全,将初液倒入试管内进行超声粉碎间断脉冲20min,静置12小时完成封闭过程后进行离心4000r/min,10分钟取上清夜;
(6)磁性多柔比星脂质体的洗脱和分离:选用葡聚糖凝胶对制作的磁性多柔比星脂质体初液进行洗脱和分离,即得磁性多柔比星脂质体材料。
2、根据权利要求1制备方法所制备的磁性多柔比星脂质体,其特征在于所述其平均磁响应性为50.28emu,平均包封率为30.8%±3.27%,平均粒径为293.4nm。
3、磁性多柔比星脂质体的应用,其特征在于将其作为医药载体在制药中的应用。
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