CN112999351A - 一种人造脂滴及其冻干制剂的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，本公开了一种人造脂滴及其冻干制剂的制备方法和应用。本发明提供了一种由中性脂质和单层磷脂膜组成的脂滴及其冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：1）称取一定量的磷脂和甘油三脂溶于一定体积的乙醇中，作为有机相；2）量取一定体积的缓冲液作为水相，在一定转速的磁力搅拌下，将有机相加入水相中；3）有机相加入完毕后，继续搅拌使乙醇挥发制得纳米脂质颗粒；所得纳米脂质颗粒可直接招募一种或几种脂滴固有蛋白或脂滴表面功能蛋白作为人造脂滴利用，亦可在一定条件下制成冻干粉剂以备后用。本发明提供的方法制备的脂滴在细胞代谢或药物载体研究中有重要作用。

Description

一种人造脂滴及其冻干制剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人造脂滴及其冻干制剂的制备方法和应用。

技术背景

脂滴(Lipiddroplets，LD)是细胞内储存脂质的细胞器，在脂质代谢和能量稳态中具有重要的作用。它具有独特的结构，核心为中性脂质，该核被磷脂单分子层包裹，表面由特定的蛋白质修饰。研究表明，脂滴起源于内质网，并通过多样的膜接触位点与其它细胞器结合。脂滴的生物发生和降解以及它们与其他细胞器的相互作用与细胞代谢密切相关，对于缓解细胞脂毒性和调节应激水平至关重要。因此，许多代谢疾病与脂滴的功能变化息息相关。然而，脂滴的高度动态性给其研究造成了极大的障碍和困难，对脂滴的功能和及其调控机制依然知之甚少。在过去的一段时间里，人们对脂滴的研究逐渐深入，脂滴的表面蛋白组成和脂质成分逐渐清晰，介导脂滴与其它细胞器互作过程的蛋白逐渐明确。但在体外分离纯化的脂滴总是含有多种细胞器碎片，给脂滴蛋白的功能研究带来严重的干扰。因此，制备与体内脂滴结构一致、成分相近、蛋白组成相似的脂滴，并建立一种体外研究脂滴的体系是非常有必要的。

已有少数研究者构建了脂滴的体外研究模型，法国科学家Thaim将甘油三酯注入到双层囊泡中，在双层磷脂间形成凸起的富中性脂结构来模拟脂滴，但该方法不能形成球形脂滴，只能形成类似结构，应用有较强的局限性。2015年，刘平生组在磷脂薄膜中加入水性缓冲液和甘油三酯，通过涡旋振荡和多次纯化制得人造脂滴。该方法可获得结构相似、脂质组分较为一致的人造脂滴。但该方法所得产物中存在较多杂质，需要经过多次纯化过程才能得到纯净的脂滴，步骤较为繁琐，且制备过程中所需的氯仿溶液为危险化学品，易对人体和环境造成伤害。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人造脂滴的制备方法，方法简单，制备的脂滴纯度高，适合大规模推广。

本发明的另一个目的在于提供人造脂滴冻干剂的方法，利用该方法制备的冻干剂，冻融后脂滴的稳定性好。

本发明的最后一个目的在于提供了上述脂滴的应用，包括利用该脂滴负载不同的蛋白以进行脂滴的体外研究。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种人造脂滴的制备方法，包括下述步骤：

将磷脂和甘油三脂溶于乙醇中作为有机相，将该有机相加入缓冲液中，混合搅拌，直至乙醇挥发，即得；

所述磷脂为1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-胆碱磷酸(DOPC)，或1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、或DOPC和DOPE的任意比例的混合物、或DSPC和DOPC的质量比小于或等于1:1；

所述缓冲液为Buffer A或Buffer B；

所述Buffer A为浓度0.01％-1％的Tween80的水溶液；

所述Buffer B的组分及含量为：20mM HEPES，100mM KCL，2mM MgCl₂；溶剂为去离子水；pH为7.4。

以上所述的方法中，优选的，搅拌的转速为200-1000rpm、搅拌时间为1-6h；

以上所述的方法中，优选的，Buffer A为浓度0.2％的Tween80的水溶液

以上所述的方法中，优选的，所述甘油三酯和磷脂的质量比为1：1-0.02，优选的为1：1、1：0.2、1：0.1、1：0.05或1：0.02。

一种人造脂滴冻干剂的制备方法，包括下述步骤：

冻干保护剂加入到上述方法制备的人造脂滴中，使得冻干保护剂的终浓度范围3％-10％(优选5％)；置于梯度冷冻干燥机中，经过预冻期、稳定期、真空期、升华期、压盖，出箱，即得。

冻干剂加入Buffer A或Buffer B复融，即可使用。

所述的冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、山梨醇、磷酸盐等中的一种或两种以上的组合。

上述人造脂滴的应用，包括利用上述脂滴进行体外脂滴的研究，本发明提供的脂滴可招募一种或几种脂滴表面固有/功能蛋白形成人造脂滴，进行脂滴的体外研究

所述蛋白为Plin2、ApoB。

本发明的保护范围还包括：利用上述方法制备的人造脂滴用于制备人造脂蛋白或药物载体。

与现有技术相比，本发明的具有以下优点：

1.与人体内天然脂滴相比，结构相似，组分一致；

2.制备过程使用的有机溶剂为乙醇，无毒无害；

3.制备步骤更加简单，所得产物含有极少杂质，无需进行二次纯化即可使用；

4.反应体系可根据自身需求按比例放大，利于大批量制备；

5.可通过制备冻干粉的形式长期保存人造脂滴。

附图说明

图1：纳米脂质颗粒实物和组分染色示意图；

染料为BODIPY。

图2：纳米脂质颗粒不同染料染色示意图。

图3：纳米脂质颗粒的粒径及zeta电位图。

图4：纳米脂质颗粒薄层色谱图；

其中，TG即甘油三酯，PC为所用磷脂(DOPC)。

图5：纳米脂质颗粒在4℃和25℃下7天稳定性；

A为4℃时，连续7天观察纳米脂质颗粒形态所示结果；B为25℃时连续七天观察纳米脂质颗粒形态所示结果；C为在4℃和25℃条件下连续测量纳米脂质颗粒的粒径。

图6：转速对纳米脂质颗粒粒径和产量的影响示意图。

图7：TAG与DOPC的比例对纳米脂质颗粒粒径和产量的影响示意图。

图8：DOPE含量对纳米脂质颗粒粒径和产量的影响示意图。

图9：DSPC含量对纳米脂质颗粒粒径和产量的影响示意图。

图10：不同有机溶剂对纳米脂质颗粒形成的影响示意图。

图11：纳米脂质颗粒冻干制剂外观示意图。

图12：纳米脂质颗粒冻干制剂复溶后实物及染色图。

图13：SUMO-Plin5-GFP蛋白和GFP蛋白分别与脂滴共孵育后组分检测图。

图14：脂滴孵育APOB蛋白银染图。

具体实施方案

本发明技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。

具体实施方案给出的实施例仅为阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1：

一种人造脂滴的制备方法：

1.1、纳米脂质颗粒的制备

1.1.1、准确称取300mg甘油三酯(TAG)至离心管中，加入10mL乙醇，水浴加热使甘油三酯完全溶解。

1.1.2、将溶解的甘油三酯加入300μL DOPC的乙醇溶液(内含30mg DOPC)，涡旋30s使溶液完全混匀，得到有机相。

1.1.3、量取30ml含0.2％Tween 80的溶液作为水相，将有机相缓慢加入到水相，置于磁力搅拌器上搅拌使乙醇挥发(转速400rpm，4h)完毕，然后将溶液迅速置于冰水浴中冷却，加入0.2％Tween80的水溶液至30mL制得纳米脂质颗粒(图1中A)。

1.2、纳米脂质颗粒的特征

1.2.1、完成上述步骤后，取1mL上述步骤1.1.3中的得到的纳米脂质颗粒于离心管中，经15000rpm离心5min。离心后可见明显分层(上层为白色带，命名为上层1；下层为无色透明溶液，命名为下层2)。

分别取步骤1.1.3中所得纳米脂质颗粒原液、上层1和下层2用显微镜进行观察，结果如图1所示：

1)三种组分中都有含中性脂质的球形结构，原液(图1中C，左一)和上层1(图1中C，左二)中数量较多，下层2(图1中C，右一)中较少。我们通过测量三种组分的光密度OD600来反映纳米脂质颗粒的产量，原液、上层1和下层2的OD600值分别为1.98、2.12和0.56，说明原液和上层1中含有较多的纳米脂质颗粒(图1中B)

2)三种组分中除球形结构外，无其它类型结构；

3)原液经离心后未发现底部有沉淀组分，说明该方法没有产生其它杂质；

利用三种脂滴特异性染料BODIPY、LipidTOX、GD317对纳米脂质颗粒进行染色，结果如图2所示均为阳性，且荧光标记的结构尺寸与光镜(图2中DIC组)下的结构一致，说明这些球状结构均含有TAG核心。

1.2.2、用粒度仪测定脂滴的平均粒径为168.8nm，如图3所示其zeta电位为-11.2mV。

1.2.3、使用薄层色谱法分析纳米脂质颗粒的脂质，具体步骤参见文献Wang Y,Zhou X M,Ma X,et al.Construction of Nanodroplet/Adiposome and ArtificialLipid Droplets[J].AcsNano,2016,10(3):3312.中的方法，结果表明，样品中DOPC与脂质的比例为9.8％±1.1％，在文献所述比例范围中(0.18％～17％)，表明纳米脂质颗粒具有单层膜结构(图4)。

1.2.4、7天稳定性

在室温(25℃)或4℃条件下储存纳米脂质颗粒7天。每天测定其粒度，并用显微镜对纳米脂质颗粒进行观察。各项数据均无明显变化，图5结果表明纳米脂质是相对稳定的。

1.3、影响纳米脂质颗粒的因素

1.3.1、转速对纳米脂质颗粒的影响

按照上述1.1中的方法，将1.1.3步中磁力搅拌器的转速400rpm分别替换为200rpm、600rpm、800rpm和1000rpm，其它步骤不变。分别测量所得纳米脂质颗粒的粒度和OD600。

结果表明，当转速分别为200、400、600、800和1000rpm时，纳米脂质颗粒的粒度分别为159.6、200.4、210.5、251.5和232.7nm，OD600值分别为2.02、2.04、2.04、2.05和2.06。纳米脂质颗粒的粒度随转速的提高而上升，当转速提高至800时，提高转速并不能增大颗粒粒度，其产量较为稳定没有显著变化(图6)。

1.3.2、磷脂与中性脂质的比例对纳米脂质颗粒的影响

按照上述1.1中的方法，将1.1.2步中300μL DOPC的乙醇溶液(含30mg DOPC)中的30mgDOPC分别替换为300mg DOPC、60mg DOPC、15mg DOPC和6mg DOPC，使TAG与DOPC的比值分别达到1：1、5：1、20：1和50：1，其它步骤不变，测量所得纳米脂质颗粒的粒度和OD600。

结果表明，当TAG与DOPC的比值为1：1、5：1、10：1、20：1和50：1时，其粒度分别为224.3、234.6、292.1、333.4和457.6nm，OD600值分别为1.98、2.02、2.04、2.07和2.08。，纳米脂质颗粒的粒度随着TAG与DOPC比值的增大而增大，其产量较为稳定，有微弱增大趋势(图7)。

1.3.3、磷脂种类对纳米脂质颗粒的影响

1.3.3.1、按照上述1.1中的方法，将1.1.2步中300μL DOPC的乙醇溶液(含30mgDOPC)中的30mg DOPC替换为7.5mg DOPE和22.5mg DOPC的混合物(即DOPE占总磷脂比例为25％)、15mg DOPE和15mg DOPC(DOPE占总磷脂比例为50％)、22.5mg DOPE和7.5mg DOPC(即DOPE占总磷脂比例为75％)和30mg DOPE(即DOPE占总磷脂比例为100％)，其它步骤不变，测量所得纳米脂质颗粒的粒度和OD600(图8)。

结果表明，当DOPE的含量分别为0％、25％、50％、75％和100％时，纳米脂质颗粒的粒度分别为292.2、294.8、200.4、303.3和256.7nm，OD600值分别为2.04、2.11、2.06、2.09和1.76。DOPE含量为50％时粒度最小，当磷脂成分全部为DOPE时，产量下降。

1.3.3.2、按照上述1.1中的方法，将1.1.2步中300μL DOPC的乙醇溶液(含30mgDOPC)中的30mg DOPC分别替换为7.5mg DSPC和22.5mg DOPC的混合物(DSPC占总磷脂比例为25％)、15mg DSPC和15mg DOPC的混合物(DSPC占总磷脂比例为50％)、22.5mg DSPC和7.5mg DOPC的混合物(DSPC占总磷脂比例为75％)和30mg DSPC(DSPC占总磷脂比例为100％)，其它步骤不变，测量所得纳米脂质颗粒的粒度和OD600。

结果表明，纳米脂质颗粒的粒度随着DSPC含量的增大而增大，当DSPC含量分别为0％、25％和50％时，纳米脂质颗粒粒度分别为166.8、359.7和320nm，OD600值分别为2.03、1.92和1.91，纳米脂质颗粒的产量随着DSPC含量的增大而下降。而当DSPC含量为75％和100％时，溶液静置5min后产生明显分层，取上层白色带观察，纳米脂质颗粒被大量非球形结构包裹，无法获得纯净的纳米脂质颗粒，产率为0，故DSPC不能作为主要磷脂成分制备纳米脂质颗粒(图9)。

1.3.4不同有机溶剂对纳米脂质颗粒形成的影响

选择实验室常用的有机溶剂甲醇、乙醚、丙酮、二甲亚砜，检测其对纳米脂质颗粒形成的影响。称取300mg TAG和30mg DOPC，分别使用上述溶剂作为有机相制备纳米脂质颗粒，制备过程如1.1所述，制得的纳米脂质颗粒使用BODIPY染色，并测量其OD600来反映纳米脂质颗粒的产量。结果表明使用二甲亚砜作为有机相溶剂时，溶液中含有较多杂质(图10左上)；丙酮作为有机溶剂时，溶液中也含有少量杂质(图10右上)；而使用甲醇和乙醚作为有机溶剂时，纳米脂质颗粒产量较少(如图10左下、右下)。乙醚、甲醇、二甲亚砜和丙酮四种有机溶剂所制得纳米脂质颗粒的OD600值分别为0.60、1.48、0.45和1.71，均小于乙醇(1.98)。丙酮、乙醚、甲醇具有刺激性气味，过量吸入可导致人体中毒，对人体和环境有危害作用。且与乙醇相比，纳米脂质颗粒制备效果不好。故本例选择乙醇作为有机溶剂。

实施例2：

纳米脂质颗粒冻干制剂的制备和使用

1、冻干制剂的制备

因此本实施例选用甘露醇为冻干保护剂，其他冻干保护剂也能完成本发明。将混合后终浓度为3％、4％、5％、6％(w/v)甘露醇作为冻干保护剂加入实施例1中1.1制得的纳米脂质颗粒中，溶解混匀，分装2mL于西林瓶中，置于梯度冷冻干燥机中，首先测量其共晶点。结果表明其共晶点为-5℃。

根据共晶点确定最佳冻干温度，经过预冻期-40℃4h、稳定期-15℃30min、真空期-15℃4h、升华期-10℃18h、0℃4.5h和终末干燥20℃3.5h。压盖，出箱，即得冻干样品。冻干样品可加入一定量的0.2％Tween80缓冲液复溶，即可使用。

2、冻干制剂的特征

以冻干制剂外形形态、粒径及重悬性为评价指标，筛选出合适的甘露醇用量，结果可得，甘露醇含量为5％时，赋型能力较好、冻干形态疏松多孔，再分散性良好，因此本发明选择5％的甘露醇作为冻干保护剂。

纳米脂质颗粒冻干制剂成为表面光洁、均匀细腻的白色疏松多孔粉末(图11)，取一瓶冻干制剂(0.1g)加入2ml0.2％Tween80溶液后，能很快再分散，分散后呈白色乳状，如图12中上图所示。

3、冻干制剂的性质

3.1、对复溶后的冻干制剂进行离心，取上层白色带，用BODIPY对复溶后的纳米脂质颗粒进行染色，荧光显微镜观察其形态，结果可见脂滴呈圆形，如图12中下图所示。与新制备的脂滴相比，复溶后脂滴形态正常，数量有所减少。

3.2、稳定性

纳米脂质颗粒冻干制剂在25℃、4℃和-20℃存放三个月后分别观察其形态。结果表明，25℃情况下，制剂外观塌陷，不易再分散，且分散后有沉淀形成。而4℃和-20℃条件下，其冻干制剂依然呈白色疏松粉状，再分散性良好。

实施例3：

人造脂滴在负载蛋白中的应用：

1、蛋白的表达和纯化

1.1、SUMO-Plin5-GFP蛋白的表达与纯化

1)SEQ ID NO.1所示多核苷酸替换载体pET28a-SUMO的限制性内切酶HindIII和XhoI识别序列间的片段，得到重组质粒。该质粒可表达N-末端融合有6×His标签和SUMO结构域的可溶性蛋白。

2)将上述构建好的质粒转化BL21大肠杆菌，诱导SUMO-Plin5-GFP蛋白表达，将菌体破碎，破碎后蛋白表达在上清中，根据his标签可溶性蛋白纯化试剂盒的操作步骤进行蛋白纯化，收集的蛋白用离心超滤管(

Ultra-4 10K Centrifugal Filter Devices)去除咪唑，将收集液进行SDS-PAGE，通过Western分析，结果表明收集液中包含了纯化后的SUMO-Plin5-GFP蛋白。

2、人造脂滴的构建

取10μg SUMO-Plin5-GFP蛋白分别与实施例1中步骤1.1制备的纳米脂质颗粒或实施例2中步骤1制备的冻干粉复溶物100μL混合，37℃孵育30min。对孵育后的脂滴进行离心(12000g，3min)，可见溶液明显分2层，上层为白色脂滴带，下层为液体。取上层白色脂滴带，重悬于100μL 0.2％Tween80溶液中，再次12000g离心3min，取上层白色脂滴带。

取37℃孵育后的脂滴加入LipidTOX染色，继续孵育10min。用荧光显微镜对人造脂滴进行观察。另取10μgGFP蛋白作为对照，操作步骤同SUMO-Plin5-GFP蛋白相一致。结果表明SUMO-Plin5-GFP在人造脂滴上呈环形分布(图13中A)，而未见脂滴招募GFP蛋白(图13中B)。无论是直接制备的纳米脂质颗粒还是其冻干粉复溶物其均具备上述结果。

取10μg SUMO-Seipin-GFP蛋白分别与实施例1中步骤1.1制备的纳米脂质颗粒或实施例2中步骤1制备的冻干粉复溶物100μL混合，37℃孵育30min。对孵育后的脂滴进行离心(12000g，3min)，可见溶液明显分2层，上层为白色脂滴带，下层为液体。取上层白色脂滴带，重悬于100μL0.2％Tween80溶液中，再次12000g离心3min，取上层白色脂滴带。将赋予后未离心的脂滴作为原液，分别取原液、上层脂滴和下层液体进行银染。再原液和下层液体中可以观察到seipin蛋白条带，而上层脂滴组分中未观察到seipin，说明脂滴对蛋白的招募是有特异性的(图13中C)。无论是直接制备的纳米脂质颗粒还是其冻干粉复溶物其均具备上述结果。

实施例4：

人造脂蛋白的制备

将实施例3中步骤2中的SUMO-Plin2-GFP蛋白替换为相同质量的ApoB蛋白(载脂蛋白B)，其余步骤不变。将孵育脂滴标记为原始组分，对孵育后的脂滴进行离心(12000g，3min)，可见溶液明显分2层，上层为白色脂滴带，下层为液体。分别取上层白色脂滴和下层溶液并标记为上层脂滴和下层溶液，进行银染。

结果表明(图14)，三个组分中都含有ApoB蛋白，原始组分中浓度较高，说明ApoB被招募到了纳米脂质颗粒上，可得人造脂蛋白。离心后的下层溶液中也存在ApoB，说明纳米脂质颗粒对ApoB蛋白的负载是有限度的。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种人造脂滴及其冻干制剂的制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctgaag aagaggcggc tcagatcccc agatccagtg tgtgggagca ggaccagcag 60

aacgtggtgc agcgtgtggt ggctctgccc ctggtcaggg ccacgtgcac cgcggtctgc 120

gatgtttaca gtgcagccaa ggacaggcac ccgctgctgg gctccgcctg ccgcctggct 180

gagaactgcg tgtgcggcct gaccacccgt gccctggacc acgcccagcc gctgctcgag 240

cacctgcagc cccagctggc cactatgaac agcctcgcct gcaggggcct ggacaagctg 300

gaagagaagc ttccctttct ccagcaacct tcggagacgg tggtgacctc agccaaggac 360

gtggtggcca gcagtgtcac gggtgtggtg gacctggccc ggaggggccg gcgctggagc 420

gtggagctga agcgctccgt gagccatgct gtggatgttg tactggaaaa atcagaggag 480

ctggtggatc acttcctgcc catgacggag gaagagctcg cggcactggc ggctgaggct 540

gaaggccctg aagtgggttc ggtggaggat cagaggagac agcagggcta ctttgtgcgc 600

ctcggctccc tgtcagcacg gatccgccac ctggcctacg agcactctgt ggggaaactg 660

aggcagagca aacaccgtgc ccaggacacc ctggcccagc tgcaggagac gctggagctg 720

atagaccaca tgcagtgtgg ggtgaccccc accgccccgg cctgccctgg gaaggtgcac 780

gagctgtggg gggaatgggg ccagcgccct ccggagagcc gccgccggag ccaggcagag 840

ctggagacgc tggtgctgtc ccgcagcctg acccaggagc tgcagggcac ggtagaggct 900

ctggagtcca gcgtgcgggg cctgcccgcc ggcgcccagg agaaggtggc tgaggtgcgg 960

cgcagtgtgg atgccctgca gaccgccttc gctgatgccc gctgcttcag ggacgtgcca 1020

gcggccgcgc tggccgaggg ccggggtcgc gtggcccacg cgcacgcctg cgtggacgag 1080

ctgctggagc tggtggtgca ggccgtgccg ctgccctggc tggtgggacc cttcgcgccc 1140

atccttgtgg agcgacccga gcccctgccc gacctggcgg acctggtgga cgaggtcatc 1200

gggggccctg acccccgctg ggcgcacctg gactggccgg cccagcagag agcctgggag 1260

gcagagcaca gggacgggag tgggaatggg gatggggaca ggatgggtgt tgccggggac 1320

atctgcgagc aggaacccga gacccccagc tgcccggtca agcacaccct gatgcccgag 1380

ctggacttca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1440

gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1500

gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1560

tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 1620

cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 1680

accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 1740

gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 1800

ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 1860

cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg 1920

cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc 1980

gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat 2040

cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg 2100

tacaag 2106

Claims (9)

1.一种人造脂滴的制备方法，包括下述步骤：

将磷脂和甘油三脂溶于乙醇中作为有机相，将该有机相加入缓冲液中，混合搅拌，直至乙醇挥发，即得；

所述磷脂为1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-胆碱磷酸（DOPC），或1,2-二油酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺（DOPE）、或DOPC和DOPE的任意比例的混合物、或DSPC和DOPC的质量比小于或等于1:1；

所述甘油三酯和磷脂的质量比为1：1-0.02；

所述缓冲液为Buffer A或Buffer B；

所述Buffer A为浓度0.01%-1%的Tween80的水溶液；

所述Buffer B的组分及含量为：20mM HEPES，100mM KCL，2mM MgCl₂；溶剂为去离子水；pH为7.4。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的搅拌的转速为200-1000rpm、搅拌时间为1-6h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：Buffer A为浓度0.2%的Tween80的水溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，所述甘油三酯和磷脂的质量比为：1：1、1：0.2、1：0.1、1：0.05或1：0.02。

5.权利要求1所述的制备方法制备的人造脂滴。

6.一种人造脂滴冻干剂的制备方法，包括下述步骤：

冻干保护剂加入到权利要求2所述的人造脂滴中，使得冻干保护剂的终浓度范围3%-10%置于梯度冷冻干燥机中，经过预冻期、稳定期、真空期、升华期、压盖，出箱，即得；所述的冻干保护剂为甘露醇、葡萄糖、山梨醇、磷酸盐等中的一种或两种以上的组合。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：冻干保护剂的终浓度为5%。

8.权利要求2所述的人造脂滴在体外脂滴的研究中的应用。

9.权利要求2所述的人造脂滴用于制备人造脂蛋白或药物载体中的应用。

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