CN102614515A

CN102614515A - 具有靶向及双重抗肿瘤作用的新型化学重组高密度脂蛋白载药系统及应用

Info

Publication number: CN102614515A
Application number: CN2012101101871A
Authority: CN
Inventors: 刘建平; 贾俊婷; 樊永庆
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2012-04-16
Publication date: 2012-08-01

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种新型的化学重组高密度脂蛋白的构建，并将其作为抗肿瘤药物载体。其特征在于提高重组高密度脂蛋白载体在其代谢酶作用下的稳定性，利用高密度脂蛋白将药物靶向传输至腺体肿瘤细胞的作用，以及介导胆固醇外流的作用阻断肿瘤细胞增殖所需的营养物质，增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的毒性作用。

Description

具有靶向及双重抗肿瘤作用的新型化学重组高密度脂蛋白载药系统及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种新型的抗肿瘤药物化学重组高密度脂蛋白载体的制备和表征，特别涉及协同药物发挥抗肿瘤作用的重组高密度脂蛋白载体。其特征在于制备新型的重组高密度脂蛋白，并将此作为抗肿瘤药物载体，利用高密度脂蛋白介导胆固醇外流的作用阻断肿瘤细胞增殖所需的营养物质，增强抗肿瘤药物对肿瘤的细胞毒作用，以及利用化学重组的方式提高高密度脂蛋白载体的稳定性。

背景技术

高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)是由载脂蛋白、游离胆固醇、磷脂以及非极性脂质组成的生物活性物质。HDL受体(SR-BI受体)在肝脏、固醇激素生成组织(如前列腺、乳腺、卵巢等)的癌细胞表面高度表达，国内外许多研究者尝试利用重组的HDL(reconstituted HDL，rHDL)来提高药物向肝或肿瘤组织的靶向转运，并取得了良好的成效，例如专利US6514523B1公开了一种载药rHDL的制备方法，用于改善药效、降低毒性和减少网状内皮系统的吞噬，并将药物靶向传输至特定的组织或细胞；CN1307906A公开了一种新型药物载体，利用rHDL载药提高药物向肝或肿瘤组织的靶向转运。HDL具有新生(盘状)和成熟(球状)两种类型，前者主要由载脂蛋白A-I(apolipoprotein AI，apoA-I)包围的磷脂双层膜组成，类似于制剂学上的脂质体结构；后者由非极性的脂质核心及外周的单层磷脂膜和载脂蛋白组成，与固体脂质纳米粒较为接近。专利US5128318公开了一种利用apoA-I和磷脂制备盘状HDL的方法，目的在于移除机体内多余的脂溶性物质，但并未将其应用于载药。由于纳米粒结构的HDL具有独特的亲水-疏水结构、较大的脂质核心(可作为脂溶性药物的贮存空间)、内源性可完全降解以及不被网状内皮系统识别和清除等特性，因此目前研究中，主要选择球状结构的rHDL作为抗肿瘤药物载体。但是，癌细胞对纳米粒结构rHDL中药物的摄取是以同时摄入胆固醇酯为代价，胆固醇酯作为细胞分裂生长的主要营养成分，过多地摄入可能会促进癌细胞的生长，因而降低对肿瘤的治疗效果。相反，脂质体结构rHDL在体内能够模拟新生HDL，介导细胞内胆固醇的流出，从而促进癌细胞的凋亡，产生药效的协同作用。另外，脂质体结构rHDL具有的双层膜结构，具有融合细胞膜的仿生特性，容易使药物进入细胞。此外脂质体结构rHDL与SR-BI受体的亲和力，较纳米粒rHDL大约1个数量级，更易将药物主动传递至靶细胞。因此，作为抗肿瘤药物的载体，脂质体结构rHDL更具优势。

在盘状rHDL代谢过程中，其主要组成成分apoA-I激活血浆中的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(lecithin-cholesterol acyl transferase，LCAT)，催化rHDL卵磷脂2位的脂酰基转移至胆固醇的3位羟基生成溶血磷脂和胆固醇酯，并且rHDL由最初的脂质体双层膜结构变为纳米粒结构。这种结构的改变容易引起rHDL中包载的药物泄漏，减少药物向靶组织的转运和分布。此外，脂质体结构rHDL的制备方法一般采用胆盐透析法，apoA-I与载体脂质之间通常以疏水力、静电力等产生物理结合。该结合方式容易引起apoA-I凝聚，使得α螺旋结构中带负电荷的氨基酸残基聚集而相互排斥，导致rHDL的物理稳定性降低。

尽管目前以重组HDL作为抗肿瘤药物的载体已见文献和专利报道，但是如何制备体内稳定性较高的重组HDL尚未有报道。

发明内容

本发明通过比较摸索不同的重组方式构建重组盘状HDL载体，发现以化学重组的方式能够显著提高rHDL的物理稳定性和体内稳定性，使其具有更好的向癌细胞传输的特性及逆向转运胆固醇协同治疗癌症的作用。

一种化学重组盘状高密度脂蛋白药系统，主要包含：脂溶性药物、磷脂、胆固醇或修饰的胆固醇、修饰的载脂蛋白AI或者天然的载脂蛋白AI，该载体系统具有类似于脂质体的双层膜结构，所不同的是其缺少脂质体具有的水腔，因此适于脂溶性药物的包载；具有逆向转运胆固醇的功能。

上述盘状rHDL的制备方法有两种，一种是将抗肿瘤药物(如紫杉醇等)，磷脂和修饰的胆固醇溶解于有机相(如甲醇、乙醇、氯仿)中，水相为含有表面活性剂(胆酸钠、脱氧胆酸钠等)的pH为7.4的缓冲溶液，采用薄膜分散法或乳化蒸发法制备得到脂质体混悬液；将混悬液与天然载脂蛋白孵育，透析除去表面活性剂即得。该法的特征是通过表面活性剂介导蛋白与脂质的结合，提高蛋白与脂质的结合力，反应条件温和。该处方中各成分的用量以能够得到较高包封率和载药量的rHDL为目标进行调整，优选磷脂和药物的摩尔比为10∶1～5；磷脂和修饰胆固醇的摩尔比为10∶2～6；磷脂和载脂蛋白的摩尔比为50∶1～3。

第二种方法是将抗肿瘤药物(如紫杉醇等)和磷脂溶解于有机相(如甲醇、乙醇、氯仿)中，水相为含有表面活性剂(胆酸钠、脱氧胆酸钠等)的pH为7.4的缓冲溶液，采用薄膜分散法或乳化蒸发法制备得到脂质体混悬液；载脂蛋白与修饰后的具有活性羧基的胆固醇经酰胺化反应结合，得到化学修饰的载脂蛋白，将其与脂质体混悬液孵育，透析除去表面活性剂即得。该方法中载脂蛋白AI既可通过其结合的胆固醇嵌合于脂质双层膜，亦可通过表面活性剂的作用提高蛋白与脂质的结合率。该处方中各成分的用量以能够得到较高包封率和载药量的rHDL为目标进行调整，优选磷脂和药物的摩尔比为10∶0.5～3；磷脂和胆固醇修饰的载脂蛋白的摩尔比为50∶1～3。

本发明提供一种抑制LCAT酶反应的方法，即修饰酶底物——磷脂或胆固醇，从而抑制LCAT引起的rHDL由脂质体结构向纳米粒结构的转变，最终抑制变构行为引起的载体药物泄漏。本发明中采用酸酐包括丁二酸酐、戊二酸酐等对胆固醇进行酯化修饰，使其具有游离的羧基，并将产物代替胆固醇制备盘状rHDL，一方面可以起到胆固醇稳定脂质双层膜的功能，另一方面也能抑制LCAT引起的酶反应。

以上两种方法制备的新型重组高密度脂蛋白载药系统可用作脂溶性抗肿瘤药物的载体，达到将药物靶向传输至肝癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等固醇类组织肿瘤细胞，并介导肿瘤细胞胆固醇外流促进肿瘤细胞坏死和凋亡的功能。

本发明制备重组HDL的两种方法均以提高盘状rHDL在血液循环中的稳定性为目的，防止血浆中大量存在的LCAT酶引起载体中药物的泄漏、降低药物在靶部位的分布而降低疗效，克服了以往制备方法所得重组HDL的变构行为，并继续保留了天然HDL逆向转运胆固醇的生理活性。

本发明制备的盘状重组HDL在与载脂蛋白孵育之前为脂质体结构，与脂蛋白孵育后为堆积的盘状结构，电镜图见图1，平均粒径～60nm，包封率＞80％，Zeta电位＜-20mV。

采用透析法考察卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)介导的变构行为对普通盘状rHDL和化学重组的盘状HDL稳定性的影响，表明化学重组HDL不受血液中LCAT酶的影响，具有良好的物理稳定性。

以人乳腺癌细胞为模型细胞，体外数据显示平行加入LCAT酶后，细胞对化学重组盘状HDL的摄取量远大于对普通重组盘状HDL的摄取量，表明以化学重组方式制备的盘状rHDL能够克服LCAT酶的变构作用，提高载体的稳定性，增强靶细胞对药物的摄取量，最终达到提高药效的目的。

附图说明

图1为重组盘状HDL与载脂蛋白孵育前后的透射电镜图。在与载脂蛋白孵育之前为脂质体结构(A)，与载脂蛋白孵育后转变为缺少内水腔的堆积盘状结构(B)。

图2为不同重组HDL在LCAT酶作用下的释放结果，图中显示加入LCAT以后，普通重组的HDL释放加快，而化学重组的HDL的药物释放没有改变，表明后者具有良好的稳定性。

图3为人乳腺癌细胞在LCAT干扰作用下对化学重组盘状HDL及普通重组HDL的摄取情况结果，结果表明化学重组HDL中药物的摄取量并未因LCAT酶的加入而降低。

具体实施方式

通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1：

处方组成如下：紫杉醇： 0.01g

蛋磷脂： 0.2g

修饰胆固醇： 0.02g

胆酸钠： 0.02g

apoA-I： 0.2g

有机相：乙醇

水合介质： pH7.4的PBS缓冲液

制备工艺：将处方量的药物，蛋磷脂，修饰胆固醇置于西林瓶中，加入适量的乙醇，超声使其溶解，转移入茄形瓶中，置于旋转蒸发仪，减压除去有机相，真空干燥，加入适量溶解有胆酸钠的水合介质，超声分散均匀成半透明的悬液，再使用探头超声粉碎，使其成为透明有乳光的液体，过0.22μm滤膜，加入载脂蛋白，溶解后置于4℃冰箱，600rpm磁力搅拌5h，使用2L含有NaCl和EDTA钠的Tris-HCl缓冲液透析过夜，即得rHDL。采用透射电镜观察实施例1中rHDL与蛋白孵育前后的形态，见附图1，孵育前为脂质体结构，孵育后为盘状堆积结构，平均粒径为60nm，包封率为75.68％，蛋白结合率为40％。

实施例2：

处方组成如下：紫杉醇： 0.01g

蛋磷脂： 0.2g

修饰胆固 0.02g

胆酸钠： 0.01g

十二烷基硫酸钠： 0.01g

apoA-I： 0.2g

有机相：乙醇

水合介质： pH7.4的PBS缓冲液

制备工艺同实例1，所制备的rHDL的平均粒径为55nm，包封率为85.07％，蛋白结合率为45.9％。

实施例3：

处方组成如下：紫杉醇： 0.01g

蛋磷脂： 0.2g

胆酸钠： 0.02g

胆固醇修饰的apoA-I： 0.3g

有机相：乙醇

水合介质： pH7.4的PBS缓冲液

制备工艺：将处方量的药物，蛋磷脂置于西林瓶中，加入适量的乙醇，超声使其溶解，转移入茄形瓶中，置于旋转蒸发仪，减压除去有机相，真空干燥，加入适量溶解有胆酸钠的水合介质，超声分散均匀成半透明的悬液，再使用探头超声粉碎，使其成为透明有乳光的液体，过0.22μm滤膜，加入胆固醇修饰的载脂蛋白溶解后置于4℃冰箱，600rpm磁力搅拌5h，使用2L含有NaCl和EDTA钠的Tris-HCl缓冲液透析过夜，即得rHDL。同实例1，所制备的rHDL的平均粒径为57nm，包封率为87.07％，蛋白结合率为52.9％。

实施例4：

处方组成如下：紫杉醇： 0.02g

蛋磷脂： 0.2g

胆酸钠： 0.01g

十二烷基硫酸钠： 0.01g

胆固醇修饰的apoA-I： 0.3g

有机相：乙醇

水合介质： pH7.4的PBS缓冲液

制备工艺同实例3，所制备的rHDL的平均粒径为62nm，包封率为89.7％，蛋白结合率为57％。

载体物理稳定性考察：采用透析法考察LCAT酶介导的变构行为对普通盘状rHDL和化学重组的盘状HDL稳定性的影响，结果表明加入LCAT，普通盘状rHDL中药物的释放加快，而化学重组盘状HDL中药物的释放并未因LCAT的加入而加快。因此，化学方式重组的盘状HDL在血液中能够具有更好的物理稳定性。

体外细胞摄取实验：采用人乳腺癌细胞株MCF-7为模型细胞，分别加入化学重组的盘状HDL和普通盘状rHDL，考察在LCAT酶作用下，肿瘤细胞对rHDL包载药物的摄取情况。结果表明在LCAT酶的作用下，细胞对普通盘状rHDL包载的药物的摄取量显著降低；而化学重组盘状HDL所包载的药物在MCF-7细胞中的吞噬百分比并未因LCAT的加入而降低。另外，与一般的重组HDL相比较，化学重组盘状HDL所包载药物的的细胞摄取量显著增大。

Claims

1.一种新型的化学重组盘状高密度脂蛋白载体系统，其特征是包含下列几种组分：脂溶性抗肿瘤药物，磷脂，修饰的胆固醇，自天然高密度脂蛋白分离得到的载脂蛋白或者经胆固醇修饰的载脂蛋白，具有盘状形态，并且避免普通盘状高密度脂蛋白在卵磷脂胆固醇酰基转移酶作用下发生的药物泄漏现象。

2.权利要求1中所述的载药系统，其制备方法是将药物、磷脂、(修饰)胆固醇溶解于有机相中；旋转蒸发除去有机相，形成干燥的脂质薄膜；含有表面活性剂的缓冲液作为水合介质水合后，形成混悬液，超声处理后，用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到含药的载体；加入含有表面活性剂的载脂蛋白溶液，低温搅拌孵育；透析除去表面活性剂，冻干即得。

3.权利要求1，2中所述的载药系统，其处方组成有两种：a)磷脂和药物的摩尔比为10∶1～5，磷脂和修饰胆固醇的摩尔比为10∶2～6，磷脂和载脂蛋白的摩尔比为50∶1～3；b)磷脂和药物的摩尔比为10∶0.5～3，磷脂和胆固醇修饰的载脂蛋白的摩尔比为50∶1～3。

4.权利要求1～3所述的载药系统，其中磷脂可以为大豆磷脂(SPC)，蛋黄卵磷脂(EPC)，二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)，二棕榈酰卵磷脂(DPPC)，二硬脂酰卵磷脂(DSPC)中的一种或几种。

5.权利要求1～3所述的载药系统，其中修饰的胆固醇是胆固醇与丁二酸酐或戊二酸酐经酯化反应得到的，其目的是改变卵磷脂酰基转移酶的反应底物胆固醇从而抑制其介导的酶反应。

6.权利要求1～3所述的载药系统，其中载脂蛋白是组成高密度脂蛋白的主要蛋白成分载脂蛋白AI；修饰的载脂蛋白为修饰的胆固醇与载脂蛋白AI经酰胺反应得到。

7.权利要求1～6中所述的化学重组高密度脂蛋白，其特征在于通过修饰卵磷脂酰基转移酶的底物来改善盘状高密度脂蛋白载体的稳定性，用于脂溶性抗肿瘤药物的传递。