CN106613943B - 一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，包括温水浸种、氟啶酮处理、配制培养基、种子消毒、种子置床、发芽等步骤，所述1/2MS专用培养基的特点为，采用MS培养基配方为基础，将其中所有无机盐的浓度都减半；所述大量元素专用培养基包含的组分为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4，其浓度分别为950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，将上述四种组分按相应浓度混合，调整pH值为5.8，加入占培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌。本发明提供的高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法快速高效，14d时荒漠肉苁蓉种子发芽率高达73％。
Description
技术领域
本发明涉及农业经济作物育种技术领域，具体涉及一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法。
背景技术
肉苁蓉作为中草药在中国已有1800年的应用历史，是我国稀有的名贵中药材，有“沙漠人参”之美誉，是补肾壮阳的要药。目前生药市场上普遍使用的肉苁蓉生药有三种，分别为荒漠肉苁蓉、管花肉苁蓉和盐生肉苁蓉。肉苁蓉是一种多年生的专一性根寄生植物，成熟肉苁蓉种子的胚为球形原胚，发育简单，无胚根、胚芽和子叶的分化，在自然条件下萌发需经历一定时间的形态后熟与生理后熟期后，才能解除休眠。由于肉苁蓉种子存在复杂的休眠特性和特殊的根专性寄生生物学特性，导致自然萌发困难、发芽率极低。目前，野生肉苁蓉资源匮乏，特别是药用效果最好的荒漠肉苁蓉，野生荒漠肉苁蓉和寄主梭梭均处于濒危境地，现为国家二级保护植物，被列入《中国植物红皮书》。因此，人工栽培肉苁蓉已经成为我国西北地区发展经济作物，改善农业种植结构的重要途径，将为当地农户带来可观的经济效益。
虽然荒漠肉苁蓉人工栽培面积在逐年扩大，但荒漠肉苁蓉种子价格昂贵，一公斤种子价格高达3万元左右，但由于荒漠肉苁蓉种子萌发困难，市售的荒漠肉苁蓉种子掺假现象严重。但是目前还没有快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，常规发芽实验的方法并不适用于肉苁蓉种子，因为常规发芽方法处理下，肉苁蓉种子发芽率较低，发芽时间过长，不能快速准确地得出肉苁蓉种子的质量数据，没有数据支持的肉苁蓉种子给农户带来巨大的生产隐患。
近些年，国内外的科研工作者针对打破肉苁蓉种子休眠开展了一些研究，采用的方法多种多样，比如：欧阳杰等采用50℃高温预处理肉苁蓉种子，诱导种子形成愈伤组织；牛东玲等通过温水处理、变温以及外源GA3预处理，可以使肉苁蓉种子萌发率达到16.7％；盛晋华等对肉苁蓉种子经过2～5℃低温层积处理,发现种子内源激素GA3含量逐渐增加，ABA含量逐渐降低，最高发芽率17.8％；盛晋华研究发现氟啶酮能够打破荒漠肉苁蓉种子休眠，采用该法荒漠肉苁蓉发芽率最高可达52.5％，发芽延续时间约30天左右。虽然这些方法在一定程度上打破了肉苁蓉种子的休眠，但是发芽率依然偏低且不稳定，而且发芽时间偏长，就算在最理想状态下，管花肉苁蓉发芽率最高能达75％，荒漠肉苁蓉发芽率最低，为16.7％-52.5％，直到30d才能统计发芽率。现有的方法不便于种子质量检验，严重影响肉苁蓉种子市场流通，增加农户种植的风险。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，旨在为提出一种能够显著提高肉苁蓉种子发芽率、缩短发芽时间、为肉苁蓉种子质量检验和栽培提供技术支撑的检验方法。
本发明提供的高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，包括如下步骤：
1)温水浸种：将肉苁蓉种子首先在25-40℃温水中浸泡3-5h；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在20-30℃条件下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡24-48h，然后蒸馏水冲洗干净备用；
3)配制培养基：配制1/2MS专用培养基或大量元素专用培养基，将配制好的培养基分装至已灭菌的培养皿中备用；
4)种子消毒：在超净工作台上将步骤2)冲洗干净的种子用消毒剂进行消毒，并用无菌蒸馏水冲洗干净；
5)种子置床：采用无菌操作技术将步骤4)消毒好的种子置于步骤3)已制备好的培养皿上，每个培养皿置30-80粒种子；
6)发芽：将步骤5)种子已置床的培养皿置于25℃进行发芽。
进一步，所述1/2MS专用培养基的配制方法为，采用MS培养基配方为基础，将其中所有无机盐的浓度都减半，配制出1/2MS基础培养基，然后加入占1/2MS基础培养基重量3％的蔗糖，调整pH值为5.8，再加入占1/2MS基础培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得1/2MS专用培养基。
进一步，所述大量元素专用培养基包含的组分为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4，其浓度分别为950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，将上述四种组分按相应浓度混合，调整pH值为5.8，加入占培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得大量元素专用培养基。
优选地，所述温水浸种步骤中，将肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h。
优选地，所述氟啶酮处理步骤中，将肉苁蓉种子于25℃条件下，在10mg/l氟啶酮溶液中浸泡36h，然后蒸馏水冲洗干净备用。
优选地，所述种子消毒步骤为在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用。
优选地，所述种子置床步骤中，每个培养皿上置50粒种子。
优选地，将种子已置床的培养皿置于25℃，黑暗条件下进行发芽。
进一步，所述肉苁蓉种子为荒漠肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉任一种。
本发明的有益效果为：
1、提高发芽率，缩短发芽时间：资料研究表明，氟啶酮能够打破肉苁蓉种子休眠，但采用该法进行种子发芽前需要先将种子根据直径分级，选取直径大于0.5mm的种子，然后将种子消毒后浸泡在氟啶酮溶液中进行发芽，荒漠肉苁蓉的种子发芽率最高为52.5％，发芽率偏低，30d统计发芽率，发芽时间太长。本研究通过筛选适宜的氟啶酮浓度和处理时间，同时结合温水浸种处理以及发芽培养基的优化，结果表明，一定浓度的氟啶酮处理种子一段时间可有效打破荒漠肉苁蓉种子休眠，但种子要萌发还需要一定的矿物质营养，在不提供营养时，发芽率最高仅为16％，因此，一定浓度的矿物质营养也是打破荒漠肉苁蓉种子休眠的重要因素。本发明提供的方法提供了针对打破肉苁蓉种子发芽休眠的专用培养基，该方法快速高效，14d时荒漠肉苁蓉种子发芽率高达73％。采用本方法，14天时即可统计肉苁蓉种子发芽率，比目前市场上最快速的检验方法还快了16天。
2、为肉苁蓉种子质量检验和育种提供技术支撑：目前国内还没有能14天就得出结果的快速高效的肉苁蓉种子质量检验方法，本发明通过对肉苁蓉种子的前处理方法、发芽条件的特殊设计，显著的打破了肉苁蓉种子的休眠，提高了肉苁蓉种子的发芽率，缩短了发芽所需时间，该发明可为肉苁蓉种子质量检验、组织培养和转基因育种提供良好的技术平台。
3、筛选出特定发芽培养基，没有使用寄主引物即可诱导发芽。由于肉苁蓉是根专性寄生植物，在诱导种子发芽时，现有技术有些采用添加专性寄主引物，例如管花肉苁蓉使用红柳提取物，荒漠肉苁蓉使用梭梭提取物，但这些提取物是否起到实质作用并未有权威证据。有些仅采用化学药剂处理，但发芽率偏低。本发明创造性的使用了1/2MS专用培养基和采用四种大量元素配制的大量元素专用培养基，配合整套种子前处理方法，并未使用专性寄主引物，使得荒漠肉苁蓉种子发芽率大幅提高至73％。研究中发现肉苁蓉种子单纯采用药剂处理发芽率很低，只有配合使用一定浓度的四种大量元素，种子发芽率才能大幅提高。该技术方法不仅可为进一步深入研究肉苁蓉种子萌发机理提供线索，同时也可为其它寄生植物种子发芽提供一种新思路和新方法。
附图说明
图1为肉苁蓉种子发芽流程图；
图2为实施例1的荒漠肉苁蓉种子发芽照片。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明，“％”为质量百分比。
实施例1：一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率方法，具体步骤如下：
1)温水浸种：将荒漠肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h，用滤纸吸干种子表面的水分；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干种子表面水分备用；
3)配制培养基：配制大量元素专用培养基，包含组分为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4，其浓度分别为950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，将上述四种组分按相应浓度混合，调整pH值为5.8，加入占培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得大量元素专用培养基，将配制好的培养基分装至已灭菌的培养皿中备用；
4)种子消毒：在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的荒漠肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用；
5)种子置床：采用无菌操作技术将步骤4)消毒好的种子置于步骤3)已制备好的培养皿上，每个培养皿置50粒种子，种子之间间隔3mm左右，用石蜡封口膜封口；
6)发芽：将步骤5)种子已置床的培养皿置于25℃，黑暗条件下进行发芽。
14天时统计发芽率，发芽率达73％(见图2)。
实施例2：检测光照条件对荒漠肉苁蓉种子发芽的影响，具体步骤如下：
1)温水浸种：将荒漠肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h，用滤纸吸干种子表面的水分；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干种子表面水分备用；
3)配制培养基：配制1/2MS专用培养基，采用MS培养基配方为基础，将其中所有无机盐的浓度都减半，配制出1/2MS基础培养基，然后加入占1/2MS基础培养基重量3％的蔗糖，调整pH值为5.8，再加入占1/2MS基础培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得1/2MS专用培养基，将配制好的培养基分装至已灭菌的培养皿中备用；
4)种子消毒：在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的荒漠肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用；
5)种子置床：采用无菌操作技术将步骤4)消毒好的种子置于步骤3)已制备好的培养皿上，每个培养皿置50粒种子，种子之间间隔3mm左右，用石蜡封口膜封口；
6)发芽：将步骤5)种子已置床的培养皿置于25℃，光照(1000lux)或黑暗条件下进行发芽，20d统计发芽率。
光照条件下的荒漠肉苁蓉种子发芽率达53％，黑暗条件下荒漠肉苁蓉种子发芽率达51％，说明荒漠肉苁蓉种子属于光不敏感种子，在光照和黑暗条件下都可以很好的发芽。
实施例3：检测不同发芽床对荒漠肉苁蓉种子发芽的影响，步骤如下：
1)温水浸种：将荒漠肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h，用滤纸吸干种子表面的水分；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干种子表面水分备用；
3)发芽床的制备：1/2MS专用培养基配制同实施例2；
A.纸床：以3层滤纸作发芽床，用蒸馏水完全润湿后备用；
B.脱脂棉：将脱脂棉铺一薄层(3mm厚)于培养皿底部，压平，用蒸馏水完全润湿后备用；
C.砂床：砂子直径0.05～0.8mm，pH 6.0～7.5，洗净后150℃消毒2h，无菌水拌成湿砂使用，手捏成团，放手即散开)，在培养皿中铺5mm厚的湿砂后，置床时将种子压入砂内即可。
4)种子消毒：在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的荒漠肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用；
(5)种子置床：将消毒好的种子整齐的摆放在发芽床上，每个培养皿50粒，其中培养基发芽床采用无菌操作技术将种子置床，用石蜡封口膜封口。
(6)种子发芽条件：在20℃黑暗条件下进行种子发芽。
20天统计发芽率，其中脱脂棉发芽床的发芽率为9％，砂床发芽床的发芽率为12％，纸床发芽床的发芽率为16％，培养基发芽床的发芽率为52.5％。由此看出，发芽床对荒漠肉苁蓉种子发芽至关重要，所有种子置床前先用温水浸种，然后再用氟啶酮处理，但发芽床不同，种子发芽率差异显著。用砂床、纸床和脱脂棉作发芽床，发芽率均很低，最高仅为16％，但以培养基作发芽床发芽率显著升高，达到52.5％。由此可见，氟啶酮可以有效的打破沙漠肉苁蓉种子休眠，但营养物质不可缺少，使用培养基可极大地促进种子的萌发。
实施例4：检测不同发芽温度对荒漠肉苁蓉种子发芽的影响，步骤如下：
1)温水浸种：将荒漠肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h，用滤纸吸干种子表面的水分；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干种子表面水分备用；
3)培养基的制备：1/2MS(无机盐减半)专用培养基配制同实施例2；
4)种子消毒：在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的荒漠肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用；
5)种子置床：采用无菌操作技术将种子置于培养皿的培养基上，每个培养皿50粒种子，种子之间间隔3mm左右，用石蜡封口膜封口。
6)种子发芽条件：将置床后的种子分别置于变温(15℃～25℃)、15℃、20℃、25℃和30℃黑暗条件下进行培养。
20天统计发芽率，变温(15℃～25℃)发芽率为15％，15℃发芽率为1％，20℃发芽率为53％，25℃发芽率为61.76％，30℃发芽率为48.33％。由此6可知，变温和15℃低温不利于荒漠肉苁蓉种子发芽，随着温度的升高种子发芽率显著升高，25℃发芽率最高，达61.76％，当温度升高到30℃发芽率降低为48.33％。因此，25℃是荒漠肉苁蓉种子适宜的发芽温度。
实施例5：检测不同营养成分对荒漠肉苁蓉种子发芽的影响，步骤如下：
1)温水浸种：将荒漠肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h，用滤纸吸干种子表面的水分；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在25℃下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡36h，然后蒸馏水冲洗2遍，用滤纸吸干种子表面水分备用；
3)不同营养培养基的制备：1/2MS(无机盐减半)专用培养基配制同实施例2；大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机和蔗糖培养基，指的是培养基中分别只含有大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机或蔗糖，其物质含量同1/2MS专用培养基，pH5.8，琼脂0.8％。
4)种子消毒：在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的荒漠肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用；
5)种子置床：采用无菌操作技术将种子置于培养皿的培养基上，每个培养皿50粒种子，种子之间间隔3mm左右，用石蜡封口膜封口。
6)种子发芽条件：在25℃黑暗条件下，进行种子发芽。
14天统计发芽率，培养基中营养成分组成不同，荒漠肉苁蓉种子发芽率差异显著，当培养基中仅含有蔗糖、有机或微量元素时，各组发芽率均低于10％，与只含水的对照相比差异不显著，因此，这几种营养物质对荒漠肉苁蓉种子发芽没有促进作用；当培养基中仅含有钙盐和铁盐时，发芽率分别为17.5％和18.67％，较对照有所升高，但没有进步意义；当培养基为1/2MS专用培养基和仅含大量元素的培养基作发芽床时发芽率显著升高，分别为60.7％和73.1％。因此，促进荒漠肉苁蓉种子发芽的营养物质主要是大量元素。
经过系列试验确定了实施例1所述高效快速检验荒漠肉苁蓉种子发芽率的方法为最优操作方法。
本发明的研究结果可为肉苁蓉人工栽培提供一定的理论依据和技术支撑，本发明的高效快速的肉苁蓉种子发芽方法，可用于荒漠肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉、沙苁蓉的任一种。
以上对本发明所提供的一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)温水浸种：将肉苁蓉种子首先在25-40℃温水中浸泡3-5h；
2)氟啶酮处理：将步骤1)所得肉苁蓉种子在20-30℃条件下，用10mg/L氟啶酮溶液浸泡24-48h，然后蒸馏水冲洗干净备用；
3)配制培养基：配制1/2MS专用培养基或大量元素专用培养基，将配制好的培养基分装至已灭菌的培养皿中备用；
4)种子消毒：在超净工作台上将步骤2)冲洗干净的种子用消毒剂进行消毒，并用无菌蒸馏水冲洗干净；
5)种子置床：采用无菌操作技术将步骤4)消毒好的种子置于步骤3)已制备好的培养基上，每个培养皿置30-80粒种子；
6)发芽：将步骤5)种子已置床的培养皿置于20-30℃条件下进行发芽；
所述1/2MS专用培养基的配制方法为，采用MS培养基配方为基础，将其中所有无机盐的浓度都减半，配制出1/2MS基础培养基，然后加入占1/2MS基础培养基重量3％的蔗糖，调整pH值为5.8，再加入占1/2MS基础培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得1/2MS专用培养基；
所述大量元素专用培养基包含的组分为KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O和KH2PO4，其浓度分别为950mg/L、825mg/L、185mg/L、85mg/L，将上述四种组分按相应浓度混合，调整pH值为5.8，加入占培养基重量0.8％的琼脂，搅拌均匀后高压湿热灭菌，获得大量元素专用培养基。
2.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述温水浸种步骤中，将肉苁蓉种子在30℃温水中浸泡4h。
3.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述氟啶酮处理步骤中，将肉苁蓉种子于25℃条件下，在10mg/l氟啶酮溶液中浸泡36h，然后蒸馏水冲洗干净备用。
4.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述种子消毒步骤为在超净工作台上将经氟啶酮处理并冲洗干净的肉苁蓉种子先用75％的乙醇漂洗10s，将乙醇倾倒干净，然后倒入0.1％的HgCl2浸泡2min，其间震荡多次，将HgCl2倾倒干净，再用2％的NaClO浸泡5min，其间震荡多次，将NaClO倾倒干净，最后用无菌蒸馏水冲洗3次，将无菌蒸馏水倾倒干净后备用。
5.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述种子置床步骤中，每个培养皿上置50粒种子。
6.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述发芽步骤中，将种子已置床的培养皿置于25℃，黑暗条件下进行发芽。
7.根据权利要求1所述高效快速检验肉苁蓉种子发芽率的方法，其特征在于，所述肉苁蓉种子为荒漠肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉的任一种。
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- 2016-10-14 CN CN201610898340.XA patent/CN106613943B/zh active Active
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|---|---|
| CN106613943A (zh) | 2017-05-10 |
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