CN114271066A - 一种快速检测野生大豆种子活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了一种快速检测野生大豆种子活力的方法，其包括以下步骤：S1)制备TTC染色液：取适量NaH2PO4·2H2O溶于双蒸水中得到浓度为15.6g/L的溶液A；取适量Na2HPO4·12H2O溶于双蒸水中得到浓度为35.82g/L的溶液B；按照比例39：61取溶液A与溶液B混合均匀得到磷酸缓冲液；取适量红四氮唑粉剂溶解于所述磷酸缓冲液中得到浓度为2％的TTC染色液；S2)将野生大豆种子用小刀轻轻划破种皮后使用蒸馏水浸泡12h；S3)采用所述TTC染色液浸泡野生大豆进行染色，染色结束后，根据染色部位及染色深浅判断种子生活力的高低。本发明能够快速的、准确的测定野生大豆种子活力，提高野生大豆种子的质量检测效率。
Description
【技术领域】
本发明属于生物安全和生物多样性技术领域，特别是涉及一种快速检测野生大豆种子活力的方法。
【背景技术】
种子是农业最基本的生产资料，种子质量是作物生产的基础，作物产品的生产产量和品质与种子质量息息相关，因此，种子质量检测是种子生生产、加工和销售必不可少的环节。种子活力作为全面衡量种子质量状况的一个重要指标，已列入到种子质量检验技术规程。种子活力水平或强度反映在种子一些特殊属性上，即活力组分上，包括从酶活性到发芽、出苗、生长发育以及产量上。高活力的种子在田间发芽速度快、出苗整齐、抵抗逆环境生长的能力强；低活力的种子在田间发芽速度较慢、出苗不规整，很容易受到生长环境的影响而造成农产品减产。
目前国际上较为常用的检测种子生活力的方法为种子发芽实验，即把种子放在最适宜的温度等环境条件下，测定其在一定时间内(通常为7天)发芽并能长成正常幼苗的能力。使用种子发芽实验可测定如栽培大豆、栽培水稻等休眠性较低的种子生活力，但这种方法并不适用于硬实种子活力的测定。在自然界中有许多因种皮不透水而不能发芽的种子，这些种子的种皮上有控制水分进出的特化结构，如栅栏细胞层，骨状石细胞层、种脐、珠孔等，能够阻止水分的进入，使得种子无法在短时间内吸水膨胀打破硬实而萌发，若使用发芽实验测定硬实种子活力，则可能将一些未萌发的活种子统计为无活力种子，造成测定的种子活力严重低于实际种子活力水平，导致不必要的误差。
四唑(2，3，5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，缩写TTC)染色法，是测定有休眠性质的种子的生活力的一种方法，它能够快速的判断种子潜在的发芽能力，测定原理是种胚中与种子的活力有关系的过氧化氢酶，发生了化学反应种胚就会变成红色，然后根据染色的面积和颜色的深浅可以判断种子活力的水平，在一般的状态下，种胚的红色越深，说明种子的活力水平越高。TTC法可快速的测定和反映种子的生活力，但针对不同物种，TTC测定条件差异较大，尤其是TTC染色浓度和染色时间，对种子生活力测定均表现极显著影响。
野生大豆(Glycine soja)为豆科、蝶形花亚科、大豆属、Soja亚属，为栽培大豆(G.max)的近缘祖先种，国家二级保护植物，主要分布于东亚的中北部地区，在中国、日本列岛、朝鲜半岛和俄罗斯远东地区集中分布。野生大豆在我国资源丰富、生态类型多样，作为栽培大豆的近缘祖先种，许多丰富的功能基因并未因人为筛选而丢失，具有丰富的遗传变异和多种优良特性，高蛋白、多花多荚，种子繁殖系数高、有很强的环境适应能力和对病虫害的抵抗性，是进行遗传多样性、系统进化和大豆品种改良的重要资源。
与其他豆科植物相似，为抗拒恶劣的环境，野生大豆种子外围在长期进化过程中形成了坚固的保护层，使得种子硬实率在96％以上。由于种子粒径小和硬实的存在，野生大豆在自然条件下种子休眠长、发芽率低、出苗不整齐，自然状态下野生大豆吸水发芽甚至需要5～7年。野生大豆种子的硬实特性，增加了准确测定种子生活力的难度，不利于野生大豆种子研究、检验和加工利用，制约野生大豆的应用推广发展。因此，如何准确地快速测定野生大豆种子生活力是当前迫切需要解决的问题。
目前使用TTC测定种子活力主要应用于农作物、蔬菜和中药材种子，而对于粒小、具泥膜的野生大豆种子的活力检测尚未见报道。为了更准确地评价野生大豆种子活力，需要探索合适的野生大豆TTC染色前处理方法和TTC染色条件，以快速、精确的评价野生大豆种子活力。
【发明内容】
本发明的主要目的在于提供一种快速检测野生大豆种子活力的方法，能够快速的、精准的检测野生大豆种子的活力，解决当前技术方法中存在的不能真实反应野生大豆种子活力的问题。
本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种快速检测野生大豆种子活力的方法，其包括以下步骤：
S1)制备TTC染色液：取适量NaH2PO4·2H2O溶于双蒸水中得到浓度为15.6g/L的溶液A；取适量Na2HPO4·12H2O溶于双蒸水中得到浓度为35.82g/L的溶液B；按照比例39：61取溶液A与溶液B混合均匀得到磷酸缓冲液；取适量红四氮唑粉剂溶解于所述磷酸缓冲液中得到浓度为2％的TTC染色液；
S2)将野生大豆种子用小刀轻轻划破种皮后使用蒸馏水浸泡12h；
S3)采用所述TTC染色液浸泡野生大豆进行染色，染色结束后，根据染色部位及染色深浅判断种子生活力的高低。
进一步的，所述野生大豆为江浦野生大豆。
进一步的，所述步骤S3)中的染色在避光条件下进行，染色温度为30～35℃，染色时间4h～6h。
进一步的，所述步骤S3)中的最优染色条件是染色温度为35℃，染色时间为4h。
进一步的，所述TTC染色液避光保存，存储温度为3～5℃。
与现有技术相比，本发明一种快速检测野生大豆种子活力的方法的有益效果在于：
首先，通过利用有生命力的种胚在呼吸过程中产生氧化还原反应来检测野生大豆生活力，较为真实的反应种子的生活力——有生命力的种胚在呼吸过程中产生氧化还原反应，而无生命力的种胚则无此反应；当TTC无色溶液渗入种胚的活细胞内并作为氢受体被脱氢辅酶工或Ⅱ(NADH2或NADPH2)上的氢还原时，便变为红色的三苯基甲酯(TTF)，并且由于种子的活力不同，胚被染成红色的程度也不同，故可根据染色部位及染色深浅可以更准确的判断种子的生活力及生活力高低；
其次，本发明测定方法所需的大型仪器和设备较少，种子经过简单预处理、样品准备和染色鉴定等简单步骤就可以取得结果；
再次，使用该方法测定种子活力一般仅仅需要16h，而标准种子发芽试验方法至少需要7天以上，且每日需要补充发芽所用蒸馏水、更换发芽纸等，其步骤繁琐，耗时费力，而本方法简单易行，大幅度降低了时间成本。
【具体实施方式】
实施例一：
本实施例为一种快速检测野生大豆种子活力的方法，其包括以下步骤：
(1)制备TTC染色液：
称取2.0g红四氮唑粉剂(TTC)溶解于100mL磷酸缓冲液中，得到TTC染色液，于棕色瓶中3～5℃冰箱避光保存备用；所述磷酸缓冲液由195mL溶液A与305mL溶液B混合而成，所述溶液A为称取7.80gNaH2PO4·2H2O溶于500mL双蒸水中获得；所述溶液B为称取17.91gNa2HPO4·12H2O溶于500mL双蒸水中获得；
(2)将野生大豆种子用小刀轻轻划破种皮后使用蒸馏水浸泡12h；
(3)采用所述TTC染色液浸泡野生大豆进行染色，染色结束后，根据染色部位及染色深浅判断种子生活力的高低。
所述野生大豆为江浦野生大豆。
所述染色在避光条件下进行，染色温度为30～35℃，染色时间4h～6h。优选的，所述染色温度为35℃，染色时间为4h。
为了验证本方法的有效性，本实施例进行了测试实验。具体如下：
试验一：
测试材料为江浦野生大豆，采集自南京市江浦地区(43.15°N，125.20°E)，种子初始含水量14.8％，种子初始发芽率为94.2％。
精确称取7.80gNaH2PO4·2H2O和17.91gNa2HPO4·12H2O，分别溶解于500mL双蒸水中，得到NaH2PO4·2H2O溶液A与Na2HPO4·12H2O溶液B，取195mL溶液A与305mL溶液B均匀混合得到磷酸缓冲液；
精确称取2.0g红四氮唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲液中，充分溶解后得到2％TTC染色液，置于棕色瓶中备用。
取江浦野生大豆400粒，用小刀割破种皮后(或使用98％H2S2O4浸泡10min)，随机分配到8个90mm培养皿中，使用蒸馏水浸泡野生大豆12h，随后使用2％TTC染色液浸染野生大豆，35℃避光染色4h；染色结束后，将种子纵切后在体视显微镜下观察种子的切面染色效果，活力种子鉴定原则按照GB/T3543.7-1995大豆种子活力判定方法进行。
我们以江浦野生大豆为材料，用未处理的野生大豆种子和小刀破皮处理后的种子做常规发芽实验，测定野生大豆种子发芽率，并用本方法作比较，结果归纳为表1：
表1不同测试方法野生大豆种子生活力
结果说明，野生大豆种子未打破种子种皮限制时，其7d的种子发芽率仅为9.12％，而种子割皮处理，种子发芽率达到93.86％，说明有活力的野生大豆种子因种皮的限制，无法透气透水而发芽，使的种子活力值和真实值差异较大。使用2％TTC染色液测定的种子活力为96.35％，与割皮处理后野生大豆种子真实发芽率无显著性差异，说明本方法具有较高的可行性和可靠性。
试验二：
评价宁夏野生大豆种子生活力：
宁夏野生大豆采集自青铜峡市小坝镇(106.07°E，38.02°N)，种子含水量9.8％，7d破皮处理种子萌发率90％。
选取宁夏野生大豆种子1200粒，分为20％甲醇胁迫组、未破皮处理种子阴性对照组和2％TTC处理组，每处理组400粒种子，每100粒为一个重复。甲醇胁迫处理先将种子以20％甲醇浸泡种子6h后自然晾干，随后和2％TTC处理组、阴性对照组种子一起，分别使用蒸馏水浸泡12h后，在35℃于温箱中使用2％TTC避光染色4h后取出，染色结束后，将种子纵切后保留胚的一半种子，于培养皿内摆放整齐拍照鉴定。
染色实验在温度为35±1℃干燥箱中避光进行。
统计方法
使用SPSS19.0软件中的ANOVA程序对各组染色结果进行显著性差异分析(α＝0.05)。
表2 2％TTC测定宁夏野生大豆种子活力
由表2可知，20％甲醇处理种子后，宁夏野生大豆种子劣变明显，种子活力降低至23％，而未劣变的种子使用2％TTC染色后，种子活力到达92％，而以同样的条件对未破皮处理种子进行染色发现，仅有8％的种子进行了染色，而种子初始发芽率为90％，说明未进行破皮处理的活种子因染色液无法透入种子内部而无法判定种子是否具有活力。
通过对以上有效、可靠的试验，经过对所得数据分析，得出结论：使用标准发芽实验方法测得种子发芽率为91％，生活力为93％，种子生活力略大于发芽率，符合同一种子样品中，种子生活力应该大于或者等于发芽率的规范要求。采用本方法2％TTC染色液染色法测定野生大豆种子的生活力时，浸种时间加上染色时间仅需16h，而常规发芽试验至少需要7d，因此当生产中急需了解野生大豆种子质量时，可先用TTC染色法测定种子的生活力来判断种子潜在的发芽能力，本研究结果表明，TTC染色法测定野生大豆种子生活力具有可行性，在生产实践中有一定的应用价值。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种快速检测野生大豆种子活力的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1)制备TTC染色液：取适量NaH2PO4·2H2O溶于双蒸水中得到浓度为15.6g/L的溶液A；取适量Na2HPO4·12H2O溶于双蒸水中得到浓度为35.82g/L的溶液B；按照比例39：61取溶液A与溶液B混合均匀得到磷酸缓冲液；取适量红四氮唑粉剂溶解于所述磷酸缓冲液中得到浓度为2％的TTC染色液；
S2)将野生大豆种子用小刀轻轻划破种皮后使用蒸馏水浸泡12h；
S3)采用所述TTC染色液浸泡野生大豆进行染色，染色结束后，根据染色部位及染色深浅判断种子生活力的高低。
2.如权利要求1所述的快速检测野生大豆种子活力的方法，其特征在于：所述野生大豆为江浦野生大豆。
3.如权利要求1所述的快速检测野生大豆种子活力的方法，其特征在于：所述步骤S3)中的染色在避光条件下进行，染色温度为30～35℃，染色时间4h～6h。
4.如权利要求3所述的快速检测野生大豆种子活力的方法，其特征在于：所述步骤S3)中的染色温度为35℃，染色时间为4h。
5.如权利要求1所述的快速检测野生大豆种子活力的方法，其特征在于：所述TTC染色液避光保存，存储温度为3～5℃。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116806485A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-09-29 | 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 | 基于cielab色空间的水稻种子生活力定量检测分析方法 |
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| CN104686011A (zh) * | 2015-03-19 | 2015-06-10 | 北京市农林科学院 | 一种测定茄子种子生活力的四唑染色方法 |
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2021
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Patent Citations (2)
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| CN116806485B (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-31 | 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所 | 基于cielab色空间的水稻种子生活力定量检测分析方法 |
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