CN114634879B - 一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法 - Google Patents

一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于作物病害抗性鉴定技术领域，具体涉及一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法。本发明利用针状物连接纸板和载菌粮食颗粒形成接种体，将接种体穿刺接种在作物茎秆上，使载菌粮食颗粒和茎秆接触，本发明的方法能够实现快速、精准接种。本发明的核盘菌田间接种方法集多重保湿、微创伤、高活力病原菌为一体，且该方法操作简单、快速，接种部位灵活，可以精确定株定向，接种效率高，比传统的接种方法工效提高48.75％，质量高，接种成功率在90％以上，比传统的接种方法在喷水保湿和不保湿的情况下分别提高56.14％和120.05％，既适合大规模接种的需要，又具有其它接种方法所不具有的优点。

Description

一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法
技术领域
本发明属于作物病害抗性鉴定技术领域，具体涉及一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法。
背景技术
植物菌核病是一种由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)寄生引起的严重的真菌性病害。核盘菌是世界性分布的重要植物病原菌，是一种兼性寄生真菌，其地理分布、寄主范围十分广泛，在五大洲近100多个国家皆有发现或流行，据统计其寄主植物己达75个科，278个属的408个种和42个亚种或品种的植物，并呈蔓延和增加的趋势。核盘菌引起的病害对重要经济作物油菜、向日葵和大豆等的产量和品质构成严重威胁。
目前，传统的植物菌核病防治措施主要依赖于化学防治，忽略了以农业生态系统为整体对象和自然控制因素的作用。农业生态调控技术的一项重要措施就是培育、筛选和利用品种的抗性，研究表明，品种或种质对菌核病的抗性变异是广泛存在的，因此选育和利用抗病品种对控制该病害的发生和流行具有重要的意义。
在对作物菌核病的抗性研究中，对所鉴种质品种进行人工接菌诱发病害发生是品种抗性鉴定筛选不可缺少的手段和方法，而接种方法对抗性评价结果的可靠性至关重要，一套简单、易行、准确的鉴定方法尤其是适合大规模筛选作物种质资源的抗性鉴定方法，是开展抗作物菌核病育种工作的基础。在常规接种鉴定筛选方法上，分为室内接种鉴定和田间接种鉴定。室内接种鉴定操作简单易行，但鉴定结果与田间真实抗性水平相关性较小。田间接种鉴定反映了田间的实际情况，与自然生产条件一致，因而是抗病材料、品种、种质资源等高级鉴定中所必须采取的方法。田间接种鉴定分为苗期、开花期接种鉴定，目前主要采用开花期接种鉴定。田间接种方法有菌碟接种法、牙签接种法、菌丝子囊孢子喷雾法和种菌核法，这几种接种方法中结果虽然在一定程度上能表达抗病品种和感病品种的差异，但是其都有各自的局限性。菌碟接种法人工操作难度较大，费工费时，接种后菌碟易干病原菌失去活性且易脱落，致使接种失败；牙签接种法对作物造成的创伤较大，不能真实反映材料的抗性水平，且操作复杂；菌丝子囊孢子喷雾法和种菌核法均受一些条件的限制，接种鉴定不稳定，不适合大规模接种鉴定。目前，缺少一种既能便于操作，又能稳定鉴定作物菌核病。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种及抗性鉴定方法，本发明的方法不仅操作简便，而且能稳定鉴定作物菌核病。
本发明提供了一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，包括以下步骤：将针状物穿透纸板和载菌粮食颗粒后，再将针状物插在待接种作物茎秆阴面，使载菌粮食颗粒和茎秆接触；所述载菌粮食颗粒的表面负载有核盘菌。
优选的，所述针状物包括大头针。
优选的，所述纸板的形状为方形，每个所述纸板的长度为1.2～1.5cm、宽度为1.2～1.5cm、厚度为0.3～0.5cm。
优选的，所述载菌粮食颗粒包括载菌小麦粒。
优选的，所述穿透载药粮食颗粒为从载菌小麦粒的腹沟中间穿过。
优选的，所述针状物插在待接种作物茎杆上的深度为0.5～0.8cm。
优选的，所述载菌粮食颗粒的制备方法包括以下步骤：对粮食颗粒依次浸水和煮制，得到待接种粮食颗粒，将所述待接种粮食颗粒接种于长满核盘菌菌丝的培养基中进行培养，直到粮食颗粒的表面长满核盘菌菌丝，得到载菌粮食颗粒。
优选的，所述待接种作物包括油菜、大豆或向日葵。
本发明还提供了一种作物菌核病田间鉴定方法，包括以下步骤：
采用上述方案所述的作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法接种核盘菌，在接种核盘菌7～10d后调查发病率和病斑扩展长度。
优选的，还包括在成熟期调查病情指数。
本发明提供了一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，本发明将针状物穿透纸板和载菌粮食颗粒后形成接种体，将接种体穿刺接种在作物茎秆上阴面，使载菌粮食颗粒和茎秆接触；所述载菌粮食颗粒的表面负载有核盘菌。本发明利用针状物连接纸板和载菌粮食颗粒，穿刺接种在作物茎秆上，能够实现快速、精准接种。本发明中，纸板通常由各种植物纤维为原料，具有较强的吸水保湿性，同时又可以阻挡明水对病原菌菌丝的浸泡；并且，粮食颗粒营养丰富且吸湿性强，吸湿速率大，容易吸收空气中的水分，尤其是空气湿度较大时，会使粮食颗粒含水量增加，能够为核盘菌菌丝体的生长提供一定的湿度和营养条件，有利于病菌的生长侵染保证核盘菌活力；此外，针状物可以起到穿刺植物茎秆创造病菌入侵点以及连接、固定病原菌、作物与纸板的作用，还可传导植物汁液与水分作用。本发明在田间接种核盘菌后，能够通过测量病斑长度和记录病情指数，衡量材料的抗病性水平，并从中筛选抗性优良的材料。本发明的核盘菌田间接种方法集多重保湿、微创伤、高活力病原菌为一体，且该方法操作简单、快速，接种部位灵活，可以精确定株定向，接种效率高，比传统的接种方法工效提高48.75％，质量高，接种成功率在90％以上，比传统的接种方法在喷水保湿和不保湿的情况下分别提高56.14％和120.05％，既适合大规模接种的需要，又具有其它接种方法所不具有的优点。
附图说明
图1为厚度为0.5cm、大小为1.5cm×1.5cm小纸板+大头针群体图；
图2为厚度为0.5cm、大小为1.5cm×1.5cm小纸板+大头针个体图；
图3为长满核盘菌菌丝的小麦粒；
图4为用本发明接种方法在油菜上接种核盘菌田间侵染情况。
具体实施方式
本发明提供了一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，包括以下步骤：将针状物穿透纸板和载菌粮食颗粒后，再将针状物插在待接种作物茎秆阴面，使载菌粮食颗粒和茎秆接触；所述载菌粮食颗粒的表面负载有核盘菌。
在本发明中，所述针状物优选的包括大头针。
在本发明中，所述纸板的形状优选为方形，每个所述纸板的长度优选为1.2～1.5cm、宽度优选为1.2～1.5cm、厚度优选为0.3～0.5cm。在本发明中，所述纸板优选的经过浸水处理，浸水量以纸板充分吸胀即可。在本发明中，所述纸板厚度为0.3～0.5cm，有利于保证吸水量和保湿效果，同时这一厚度利于纸板加工，可提高工效。本发明的纸板长1.2～1.5cm、宽1.2～1.5cm，既有利于覆盖载菌粮食颗粒，又不会超过作物茎秆直径，以避免被相邻植株茎秆剐蹭掉接种组合体。在本发明中，所述纸板能够吸水保湿，为菌丝体生长提供湿度环境，又为接种麦粒遮阴。在本发明中，所述纸板优选为表面无杂质的新纸板。
在本发明具体实施过程中，将纸板划分为1.2～1.5cm×1.2～1.5cm大小的方块。在本发明中，所述大头针从每个所述方块的中心穿过，使方块纸板位于大头针的中间位置，再将插有大头针的各个方块裁剪开，收集备用。
在本发明中，所述粮食颗粒优选的包括大米粒、玉米粒或小麦粒，更优选为小麦粒，小麦粒大小适中、载菌量适宜，且易于操作和菌丝体附着生长。在本发明具体实施过程中，所述载菌粮食颗粒为载菌小麦粒。
在本发明中，所述穿透载药粮食颗粒为从载菌小麦粒的腹沟中间穿过；麦粒腹沟是麦粒的中心线，从腹沟中间穿过一是确保载菌小麦粒稳定不易掉落，二是确保麦粒腹沟面和吸水纸板充分接触，接触面较大。
在本发明中，所述针状物优选的依次穿透纸板和载菌粮食颗粒。
在本发明中，所述载菌粮食颗粒优选的分别和纸板以及作物茎杆紧贴。
在本发明中，所述针状物插在待接种作物茎杆上的深度优选为0.5～0.8cm；所述针状物插入到待接种作物的茎秆上的接种深度不用过深，能够使载菌粮食颗粒和茎秆接触且接种体不易掉落即可，避免了对茎杆的过多破坏，具有微创的优势。
在本发明中，所述载菌粮食颗粒的制备方法包括以下步骤：对粮食颗粒依次浸水和煮制，得到待接种粮食颗粒，将所述待接种粮食颗粒接种于长满核盘菌菌丝的培养基中进行培养，直到粮食颗粒的表面长满核盘菌菌丝，得到载菌粮食颗粒。
在本发明中，所述培养基优选为PDA培养基；所述培养的温度优选为20～24℃。
在本发明中，所述浸水的时间优选为20～24h；所述煮制的时间优选为40～45min，所述煮制的温度优选为80～100℃。在所述煮制后，优选的还包括对煮制后的麦粒进行沥干。
在本发明中，所述待接种作物包括油菜、大豆或向日葵。
本发明还提供了一种作物菌核病田间鉴定方法，包括以下步骤：
采用上述方案所述的作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法接种核盘菌，在接种核盘菌7～10d后调查发病率和病斑扩展长度。
在本发明中，还包括在成熟期调查病情指数。
当本发明的作物菌核病田间鉴定方法用于对育种材料进行抗性筛选时，优选的还包括在接种的第0～10d对载菌粮食颗粒进行喷水，以增加载菌粮食颗粒湿度，增大病害压力，所述喷水的时间优选为接种的第0～7d。
如果是育种材料的抗性鉴定则不用喷水保湿，本发明的接种方法能够满足抗性鉴定所需的条件。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
以下是以鉴定、筛选油菜和大豆对菌核病的抗性为本发明方法的一种具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，该接种方法同样适用于其它作物和病菌在作物的茎秆进行接种鉴定。
实施例1
本实施例的目的在于本发明接种方法与常规菌碟接种法的比较。主要包括接种的效率、效果和发病率。
1.1试验材料
陕西省杂交油菜研究中心油菜育种室提供的50份甘蓝型油菜。
1.2试验方法
50份甘蓝型油菜每份种8行，每行保证至少25株准备接种的油菜，采用本发明的接种方法和常规菌碟接种法接种。每种接种方法设喷水保湿和不喷水两种处理，每个处理接种50株，统计接种时间，接种3天后观察统计接种菌体状态，包括病原菌体存在否及存在状态，7～10d调查发病率。
本发明接种：
(1)一张厚度为0.5cm的纸板画线分成1.5cm×1.5cm大小的小方块，大头针从小方块纸板中心穿过，小方块纸板位于大头针的中间位置，用剪刀延画的线剪开，收集备用。
(2)活化后的核盘菌菌种接种在盛有PDA培养基的培养皿中，放在24℃培养箱中培养。
(3)将饱满完整的普通小麦粒淘洗干净，在清水中浸泡24h，再在锅中加水煮45min，沥干水麦粒接种在刚好长满核盘菌菌丝的培养皿中进行培养，直到菌丝长满麦粒表面。
(4)接种前把加工好的大头针+小纸板在水中浸湿，小纸板充分吸胀水沥干明水，把大头针从长满菌丝的小麦腹沟中间插过，使小麦粒和小纸板紧贴，大头针插在需要接种的作物茎秆阴面，使麦粒和作物的茎秆紧贴。接种完成后每天喷水增加湿度，保湿7～10d。
(5)接种7～10d后调查发病率和病斑扩展长度。成熟期调查病情指数。
常规菌碟接种：用直径0.7cm的打孔器在刚好长满核盘菌菌丝的含有PDA培养基的培养皿最外周打下接种菌碟，用镊子把菌碟接种在油菜叶掖处。
1.3试验结果
表1两种接种方法比较
本发明接种与常规菌碟接种比较结果由表1可以看出，4人接种用时分别为450min、875min，本发明接种效率比菌碟接种方法提高48.57％，而且3天后的菌基存在率两种条件下(喷水与不喷水)本发明接种法极显著高于常规菌碟接种法，菌基的存在状态极显著好于常规菌碟接种法，两种条件下3天调查和10天调查的发病率基本在80％以上，说明本发明接种法的接种质量极佳。
实施例2
将本发明的方法用于油菜抗菌核病育种，从2000年至今在陕西省杂交油菜研究中心育种病圃对上万份材料进行接种筛选。每年接种筛选的抗性较好材料，第2年继续在病圃接种再筛选，直到筛选到抗性好且稳定的材料，再用这些材料作为亲本培育油菜新品种。
2.1试验材料
从2000年至今，材料由陕西省杂交油菜研究中心的油菜育种室提供，每材料每年接种50株。
2.2试验方法
本发明接种：同实施例1。
收获期选择抗性好的材料，第2年继续在病圃接种再筛选。
2.3试验结果
从2000年至今在陕西省杂交油菜研究中心的育种病圃对上万份材料进行接种筛，从中筛选到一批低抗-中抗菌核病的材料，用这些材料培育的品种组合抗性水平均达到低抗-中抗。这充分说明本发明接种方法在大规模抗性材料的筛选应用是成功的。
表2利用本发明接种方法筛选的抗性材料及其培育的油菜品种
实施例3
将本发明的接种方法用于50份大豆品种材料抗菌核病鉴定。
3.1试验材料
材料由陕西省杂交油菜研究中心大豆育种室提供，每材料接种50株。
3.2试验方法
本发明接种：同实施例1。
接种7～10d后调查发病率和病斑扩展长度。采用直尺直接测量病斑长度，并记录数据，成熟期调查病情指数。根据Boland、韩广振等大豆菌核病抗病性分级和评价标准对本研究中大豆菌核病田间接种鉴定方法的材料进行评价，具体指标见表3。按照菌核病病情指数的大小，结合菌丝体侵染大豆植株直径的比例，将大豆植株对菌核病的抗性分为0～6个等级，分别对应的抗性水平为高抗、抗病、中抗、中感、感病、高感Ⅰ和高感Ⅱ。
表3大豆菌核病病情指数的抗病性分级和评价标准
抗性级别 抗性水平 评价标准 病情指数DSI
0 高抗(HR) 无明显症状 0
1 抗病(R) 茎上有微小病斑 1～20
2 中抗(MR) 茎上病斑直径达2mm 21～35
3 中感(MS) 病斑扩大到直径的1/3到2/3 36～50
4 感病(S) 病斑扩大到直径的2/3以上 51～70
5 高感Ⅰ(HS-Ⅰ) 病斑包围整个直径 ＞70
6 高感Ⅱ(HS-Ⅱ) 植株死亡 100
病情指数(DSI)＝0，表示植株没有发病，DSI＝100，表示植株全株出现死亡。
3.3试验结果
用本发明接种法鉴定大豆材料的抗性水平，材料发病率在80％以上，依据表3的抗性分级和评价标准，在鉴定的50份大豆材料其中高抗材料0份，抗病材料4份，中抗7份，中感12份，感病材料13份，高感Ⅰ9份，高感Ⅱ5份，由结果可以看出，在供试材料当中抗病品种的材料所占比例较少，只有22％，大多数为感病材料品种。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，包括以下步骤：将针状物穿透纸板和载菌小麦粒后，再将针状物插在待接种作物茎秆阴面，使载菌小麦粒和茎秆接触；所述载菌小麦粒的表面负载有核盘菌；
所述纸板经过浸水处理；
所述纸板的形状为方形，每个所述纸板的长度为1.2～1.5cm、宽度为1.2～1.5cm、厚度为0.3～0.5cm；
所述针状物穿透载菌小麦粒为从载菌小麦粒的腹沟中间穿过；
所述针状物插在待接种作物茎杆上的深度为0.5～0.8cm；
所述针状物为大头针。
2.根据权利要求1所述的作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，其特征在于，所述载菌小麦粒的制备方法包括以下步骤：对小麦粒依次浸水和煮制，得到待接种小麦粒，将所述待接种小麦粒接种于长满核盘菌菌丝的培养基中进行培养，直到小麦粒的表面长满核盘菌菌丝，得到载菌小麦粒。
3.根据权利要求1所述的作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法，其特征在于，所述待接种作物包括油菜、大豆或向日葵。
4.一种作物菌核病田间鉴定方法，包括以下步骤：
采用权利要求1～3任意一项所述的作物菌核病病原菌核盘菌田间接种方法接种核盘菌，在接种核盘菌7～10d后调查发病率和病斑扩展长度。
5.根据权利要求4所述的作物菌核病田间鉴定方法，其特征在于，还包括在成熟期调查病情指数。
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