CN108887235A - 一种基于刺探电位图谱技术的埃塞俄比亚芥抗蚜性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于刺探电位图谱技术的埃塞俄比亚芥(以下简称为埃芥)抗蚜性鉴定方法。本发明使用刺探电位图谱技术(the electrical penetration graph,EPG)观察蚜虫在埃芥叶片上的刺探取食过程。若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为26.51±6.00min、40.95±14.59min和42.01±5.83min，则表明该埃芥为感蚜材料；若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为55.98±14.80min、273.46±92.39min和22.20±4.17min，则表明该埃芥为抗蚜材料。随后的验证结果显示，该鉴定方法实际可用，操作性强，准确性好。同时，本发明对芸薹属作物针对刺吸式昆虫的抗性鉴定及其抗性机制的理论研究均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于刺探电位图谱技术的埃塞俄比亚芥抗蚜性鉴定方法。
背景技术
芸薹属(Brassica)是十字花科(Cruciferae)芸薹族中经济价值最大的一个属，包含油料、蔬菜、饲料以及调味品作物等，目前在世界上大约有40余种，中国有15种，在生产和生活中被广泛利用。据统计，芸薹属蔬菜是我国乃至世界上栽培面积和产量最大的一类蔬菜。常年约占我国蔬菜播种面积的40％，在保障城乡居民蔬菜的正常供应中居于重要地位。除埃芥、黑芥和甘蓝类以外，其他主要芸薹属作物均起源于我国，由于栽培历史悠久，品种类型十分丰富，存在大量的变种、生态型和野生种。然而，自20世纪以来，随着人口的急剧增长、城市化进程的加快、人们环保意识的淡薄使得环境迅速恶化，以及现代农业的发展与新品种的应用，尤其是杂交品种的大量推广，导致芸薹属蔬菜遗传资源多样性不断遭到破坏与丧失。据报道，我国1952年品种调查时大白菜的地方品种有8000多个，到了2005年仅剩下1000多个，经过半个世纪就丧失了约87％的种质资源。种质资源的锐减导致在育种过程中骨干亲本减少，培育获得的新品种其遗传背景偏窄，品种间的同质性越来越高，生产中农作物受病虫害危害的风险也越来越大，严重制约着我国芸薹属作物种业及其相关产业的可持续发展。
长期的育种实践表明，育种工作之所以能取得突破性进展，多取决于发现和利用了具有关键性基因的种质资源。而目前已有的研究结果表明，在我国芸薹属作物育种过程中所缺乏的抗逆(抗干旱、耐高温)和抗病虫等重要基因恰恰在埃芥(B.carinata L.2n＝34)和黑芥(B.nigra L.2n＝16)中存在，这些优良性状的挖掘利用和基因鉴定对芸薹属作物的遗传改良具有重要的价值。埃芥目前在非洲东北部有着大面积的种植规模，在当地的农业生产中占据着重要地位。埃芥有着很多芸薹属其它种所没有的优良农艺性状，如有较强的渗透调节能力和较强的抗逆性；对黑胫病有较强的抗性；耐叶斑病；抗多种害虫如蚜虫、跳甲等；具有更高的产量和低落籽量。为了利用控制上述重要农艺性状的基因，建立完善合理、高效、精准的筛选优良品种的鉴定评价系统就显得十分必要。室内抗蚜鉴定是根据埃芥蚜虫发生危害的特点，从植株寄居蚜虫的增殖量和植株外部表现进行综合评价。而EPG可以通过蚜虫在取食过程中所产生的不同波形来判断其对各个组织的喜好程度，从而判定植物在组织水平上是否存在对蚜虫的抗性或诱食因子。利用两类鉴定方法可以有效地从大量的埃芥或者其他芸薹属蔬菜种质资源中快速、准确地筛选出供研究者使用的抗蚜材料。
提高抗虫性是当前芸薹属乃至整个十字花科蔬菜重要的育种目标之一。以日本学者盛永和禹长春等人提出的禹氏三角为理论基础，利用由“U三角”三个二倍体基本种芸薹(AA)、黑芥(BB)、甘蓝(CC)组成的异源六倍体复合种(AABBCC)为桥梁材料，通过回交与选择技术，可将埃芥植株中所拥有的抗虫基因较为容易地转移到白菜类、甘蓝类、甘蓝型油菜(AACC)和芥菜型油菜(AABB)等重要的蔬菜与油料作物中去，不但可以实现对上述经济作物的定向遗传改良，还可以为进一步图位克隆抗虫基因并分析其生物学功能奠定研究基础。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的在育种实践中可用的抗蚜种质资源材料的不足，提供一套适合于芸薹属蔬菜的抗蚜鉴定技术体系以及评价标准，用于从芸薹属种质资源(如埃芥)抗虫亲本的筛选以及后续抗虫基因的定位及分离等研究工作。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种埃芥抗蚜性的鉴定方法，将蚜虫饥饿处理后用银胶和金丝连接其背部，接种于埃芥叶片。蚜虫取食后形成EPG电通路，分析桃蚜6h取食过程中的取食波，若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为26.51±6.00min、40.95±14.59min和42.01±5.83min，则表明该埃芥为感蚜材料；若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为55.98±14.80min、273.46±92.39min和22.20±4.17min，则表明该埃芥为抗蚜材料。
进一步地，利用室内蚜量比值与植株生长状况进行综合评价，基于受害指数(DI)对抗蚜性进行鉴定。
进一步地，所述蚜虫为纯化后的蚜虫，纯化过程包括母蚜的选育与第一代蚜蚜龄的判定，并采用第一代及以后的二龄子蚜进行接种。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：芸薹属蔬菜新品种的遗传背景越来越狭窄，品种间的同质性越来越高，生产中农作物受病虫害危害的风险也越来越大，极大地制约了我国芸薹属作物种业及其相关产业的可持续发展。本发明利用刺探电位图谱技术形抗蚜鉴定系统，可直接用于芸薹属蔬菜各类种质资源针对刺吸式昆虫抗性的不同研究。利用该方法，不仅克服了常规选育优质品种所需的时间周期长、结果不稳定等缺点，还可以定位抗虫因子，为接下来的抗虫机理方面的研究奠定基础。同时也可利用该方法对选育后代进行QTL定位的抗性鉴定，挖掘出芸薹属蔬菜中的抗虫基因，并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解芸薹属蔬菜抗虫的分子遗传机理有积极意义。因此，本发明在芸薹属蔬菜的抗虫育种实践及其理论研究方面均具有重要意义。
附图说明
图1为抗蚜鉴定中纯化桃蚜(Myzus persicae)。其中a：成蚜与幼蚜；b：接种蚜。
图2为室内抗蚜鉴定当中的接种示意图，接蚜至顶尖心叶之上，图a为整体示意图，图b为局部放大图。箭头标记处为接蚜点。
图3为蚜虫在叶片上的取食状态与EPG系统示意图。其中，a：EPG运行系统结构图；b：蚜虫穿刺叶片各组织结构示意图。
图4为EPG系统操作过程中接蚜示意状态图。图a为整体示意图，图b为局部放大图。箭头标记处为接蚜点。
图5为桃蚜(M.persicae)在埃芥上出现的各取食图形波。其中，a为蚜虫全程取食波形图；b为pd波形图；c为E1波形图；d为E2波形图。另外，np波为非刺探波；pd波、A、B和C波为刺探波；E1和E2为韧皮部取食波。
图6为桃蚜在六份抗/感材料上前2h取食波形图。其中，BC01、BC25和BC60为感蚜材料；BC13、BC47和BC51为抗蚜材料。
具体实施方式
1.室内抗蚜鉴定方法具体步骤
(1)植株培养：首先取实验室保存的埃芥种子放在55～60℃的恒温水中浸种7～8min，期间注意不断搅拌，保证受热均匀，然后将温水倒掉，用常温自来水冲洗两次，将瘪粒及杂质剔除，最后换成干净的常温自来水浸泡1～3h。尔后在直径15cm的培养皿中铺上两层洁净的滤纸，滤纸上喷少量的自来水，使得滤纸完全湿润但没有流动的水，然后将上述温汤浸种过的种子均匀地摆放在湿润的滤纸上，最后在种子上面覆盖上一层洁净的湿润滤纸保湿。盖上培养皿的盖子，置于室内，室温催芽。催芽期间注意喷水保湿，直至胚根长到0.5～1.2cm。
将草炭、蛭石和珍珠岩按照6∶3∶1的比例混合均匀，作为植株正常生长的基质(pH5.5～6.5)。在15孔育苗穴盘的每个穴的底层，铺上足够厚度的上述基质。将材料采用随机区组设计，5次重复，3个区组。白天温度控制在25℃以上，夜间温度控制在20℃以上，出苗后至真叶展开期间，保证充足的光照，控制水分，防止产生高脚苗，之后按照常规十字花科植物所需的光照和水分进行管理，水及营养液用硝酸调节pH 5.5左右。
(2)接种蚜培养：在采集蚜虫两周前，种植感病品种，作为扩繁蚜虫群体的材料。在试验材料长到三片真叶之前，采集蚜虫，以单一的蚜虫群体纯化进行抗蚜虫材料筛选实验(见图1)。将蚜虫以5头为单位，刷到培养的感虫材料上(见图2)。如果空间充足，可以用整株进行扩繁。培养条件为温室(25℃，RH 60％～70％)，光周期为18h光照/6h黑暗，光照强度为60μmol·m-2s-1。注意观察，保证蚜虫繁殖速度。
(3)选择性接种试验：苗生长大致15d左右(第一三出复叶期)，用湿润的毛笔刷上接种上生长状态一致的桃蚜5头，接种到顶尖三片复叶的叶片或是心叶上，直接刷到叶子正面即可。接种上蚜虫后，在苗根部浇水，以避免对蚜虫数量的影响。每隔七天观察一次，拍照，计量蚜虫数量，最后21d后统计最后蚜虫数量和植株生长状况，计算其DI值。参试材料定植于浙江大学紫金港校区农业试验站玻璃温室中，完全随机区组排列，5次重复。常规水肥管理，不施农药，植株罩网，白天温度控制在25℃以上，夜间温度控制在20℃以上，出苗后至真叶展开期间保证充足光照，控制水分，防止产生高脚苗。
(4)抗蚜鉴定标准：根据埃芥植株发生蚜害的特点，从植株寄居桃蚜的量和植株外部本身表现两个方面进行综合评价。按5个级别划分各材料的感蚜严重度：0级，植株无损害，全株无蚜虫；1级，植株生长正常，有零星蚜虫(约100头以内)；2级，植株生长基本正常，顶部嫩茎及嫩叶有较多蚜虫(约101～300头)；3级，叶片油密，稍微卷曲，嫩茎及嫩叶布满蚜虫(约301～800头)；4级，植株矮小，叶片严重弯曲，蚜虫数在801头以上。之后换算成各材料的受害指数，最后依据全部材料受害指数的分布范围分为5级抗性级别。
(5)伤害指数分析：DI＝(∑级别×植株数)/(4×所有植株数)×100％。将DI指数算出后，若植株生长状况与蚜量增殖不一致，可将两者相加取平均数，最后算出总DI值。其中，DI＝0.0～30.0为高抗，DI＝30.1～50.0为抗，DI＝50.1～70.0为中抗，DI＝70.1～85.0为感，DI＝85.1～100.0为高感。
本试验利用室内人工蚜虫(桃蚜)接种试验法针对75份埃芥进行抗蚜性评价。利用SPSS v19.0软件对蚜虫数量进行差异显著性分析与Duncan多重比较分析，得到BC-01、BC-25、BC-60三份21d感蚜量平均数最高的材料，以及BC-13、BC-47、BC-51三份21d感蚜量平均数最低的材料。
研究结果表明，BC01、BC25、BC60，其蚜量比值(21d感蚜量与初始接种量之比)分别达到1.51、1.54、1.58；BC13、BC47、BC51，其蚜量比值分别为0.44、0.47、0.53(表1)。另外在植株形态观察中，BC47是抗性材料中最为健壮、株高株幅最大的材料，而高感材料中，BC01、BC60后期均表现对蚜虫敏感，当蚜虫达到一定的种群大小后，叶片马上出现黄化、萎焉且伴有腐臭味。
表1六份抗/感材料的鉴定结果
2.基于EPG技术筛选抗蚜性指标的具体步骤
(1)前期处理：取已经长至3～5片真叶的埃芥幼苗，将桃蚜进行饥饿处理2h之后放置冰上进行固定，再用10～20μm的金丝(蚜虫虫体较大，可以使用的金丝可适当地粗一些，使用直径20μm的金丝，金丝长度一般为1.5～3cm)用银胶粘住蚜虫背部，连通电路进行记录。一般情况下，刺吸式昆虫都是在有光照的条件下进行取食，因此，EPG实验的时间应尽可能和所饲养昆虫的光周期保持一致；EPG实验所用植物应与饲养昆虫的寄主植物保持一致。金丝黏连后的昆虫不要直接放在EPG实验所用植物上，而应该另备一株植物用于让昆虫适应背部黏有银胶金丝的情况，也可以等所有的试验昆虫都与金丝连接完毕后，再进行饥饿处理这个过程大概需要30～60min，视不同昆虫情况而定。
(2)实验操作：EPG在刺吸式昆虫传播植物病毒机理的研究中发挥着重要作用。如果只是研究寄主植物表面或叶肉层次物理化学性质对昆虫取食行为的影响，一般30min到3h的记录时间就足够了，一般用于探讨植物次生物质在植物的哪个层次对昆虫取食行为有影响，则建议记录6h。本试验所用的是北京渠道科学器材有限公司的EPG昆虫刺探电位仪。EPG实验属于行为学和电生理学方面的研究，变化因素多，方差大，需要通过增加重复数，随机选择昆虫和植物来抵消方差造成的影响。EPG对外界干扰十分敏感，外界电波的干扰会影响记录的信号，使有意义的信号变得难以辨认，而且外界嘈杂的环境会影响昆虫的取食活动。所以整个实验装置应置于一个电压比较稳定、免除外界干扰的环境中，EPG必须使用接地的法拉第笼来屏蔽噪音。
(3)数据分析：分析桃蚜(M.persicae)取食行为结果发现，桃蚜在埃芥上出现了典型的蚜虫取食波。所有的参试埃芥均出现了6种波，即C波(包括A波、B波和C波)、np波、E1波、E2波、G波、pd波。Pd波表示此时蚜虫口针未刺入植物表皮内，产生的波形几近直线；A波代表口针刚刺入表皮并伴随有水溶性唾液分泌产生的波形，此时波形不稳定，变化幅度较大，其真实频率在各次实验中分布在5～10Hz之间；B波幅度很小，是紧随A波之后产生的，此时口针位于植物表皮及薄壁组织内，并分泌凝胶型唾液进入植物组织中；C波表示蚜虫口针表皮与维管束之间，其典型的特征是有很多的电势差；E波表示口针位于植物韧皮部，E1波表示蚜虫分泌水溶型唾液阶段，E2波则与吸食韧皮部汁液有关(见图5)；G波的波峰向下，规律重复，代表蚜虫在木质部吸取汁液。
以EPG Stylet ana v21软件分析桃蚜在埃芥材料6h取食记录数据，用EPG Styletdnd v19软件进行分类统计，参照刺探电位图谱各参数与抗性因子在植物特异组织中的关系(见表2和表3)与实际波形，桃蚜取食埃芥汁液所产生的EPG参量可以分为非韧皮部参量与韧皮部参量两大类。在非韧皮部参量中，第一次刺探的时间点与表面因子相关，第一次刺探的持续时间与表面因子和叶肉组织有关，第一次到达韧皮部前的刺探次数与表面因子、叶肉和其他软组织相关，韧皮部取食比例与表皮、叶肉和其他软组织有关。而在韧皮部参量中，第一次取食时间点与所有组织都相关，第一次到达韧皮部和第一次取食间隔时间(E2)则与导管和筛管组织相关，单次E1、E2波平均持续时间则都与韧皮部组织相关。
表2刺探电位图谱各参数与抗性因子在埃芥叶片非韧皮部参量的关系
随后，本试验以BC01高感材料和BC47抗性材料进行桃蚜的刺探电位图谱观察，每个样本观察6h，取到5个足够的可靠重复。以EPG Stylet ana v21软件分析桃蚜在两份埃芥材料6h取食记录数据，用EPG Stylet dnd v19软件进行分类统计，取食波部分结果如下图6所示。参照刺探电位图谱各参数与抗性因子在植物特异组织中的关系与实际波形，桃蚜取食埃芥汁液所产生的EPG参量可以分为非韧皮部参量与韧皮部参量两大类。在非韧皮部参量中，第一次刺探的时间点与表面因子相关，第一次刺探的持续时间与表面因子和叶肉组织有关，第一次到达韧皮部前的刺探次数与表面因子、叶肉和其他软组织相关，韧皮部取食比例与表皮、叶肉和其他软组织有关。而在韧皮部参量中，第一次取食时间点与所有组织都相关，第一次到达韧皮部和第一次取食间隔时间(E2)则与导管和筛管组织相关，单次E1、E2波平均持续时间则都与韧皮部组织相关。
表3刺探电位图谱各参数与抗性因子在埃芥叶片韧皮部参量的关系
从取食波形分析当中，可以直观地看到蚜虫在不同的材料上的取食行为差异很大，主要表现在各取食波出现时间与持续时间上。从下图中我们可以看到，刺探波(pd)占取食初始阶段的50～80％，其中电势差最大的C波又在刺探波中所占比例最大，只可能是由于桃蚜口针在叶肉细胞的刺探过程当中唾液鞘分泌凝胶唾液致使电势差不稳定，而同时此过程在初期蚜虫固定取食部位一直到韧皮部不断取食阶段所间隔的时间长使得C波出现的频率非常高。桃蚜在韧皮部或木质部吸食的波形一般先是短暂的水溶性唾液分泌的波形见图6所标注E1波形，而后是振幅比较低但很规律的吸食波形E2，E波所出现的最早时间和持续时间可以在一定程度上反映材料对蚜虫的抗性。
进一步利用SPSS 19.0对感蚜材料BC01(5个有效样本)和抗蚜材料BC47(5个有效样本)进行Mann-Whitney U检验(见表4)，结果显示，在EPG参量中，总的刺探次数、非取食波时间、总刺探波时间和E波时间参量检验p值均大于0.05，呈不显著差异；而到达韧皮部的时间点、第一次刺探时间与G波时间检验p值小于0.05，但大于0.01，呈显著差异。其中，抗蚜材料在到达韧皮部的时间点要比感蚜材料要晚将近一半时间，而第一次刺探时间也比感蚜材料要晚。另外，桃蚜在感蚜材料上主动取食的时间(G波)要比抗蚜材料显著要长。因此，若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为26.51±6.00min、40.95±14.59min和42.01±5.83min，则表明该埃芥为感蚜材料；若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为55.98±14.80min、273.46±92.39min和22.20±4.17min，则表明该埃芥为抗蚜材料。结合EPG参量与植物因子之间的相关性，第一次刺探时间点与表面因子相关，到达韧皮部组织的时间点与植物表皮组织与叶肉组织相关，而主动吸食的持续时间则与植物木质部相关，由此推测，埃芥材料抗蚜性的差异主要来自于叶片表面组织、叶肉组织以及木质部，可以快速地将抗蚜因子定位在这三者之上。
表4桃蚜在埃芥抗/感蚜品种上的EPG参数(总记录时间为6h，五个有效重复)
注：采用曼-惠特尼U检验进行显著性分析，显著水平定于0.05和0.01。在利用比例或比率的试验中，卡方检验的水平也是0.05和0.01。Ns为没有显著性差异(P>0.05)，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
3.埃芥抗蚜性评价指标的验证
为了进一步验证上述EPG将抗蚜因子定位于叶肉组织与木质部以及到达韧皮部时间点、第一次刺探时间和G波时间是鉴定抗蚜性的三个重要指标等结果，利用业已建立的EGP实验体系，以高感材料BC25、BC60与抗性材料BC13B、BC51进行刺探电位图谱分析(见表5)。结果显示，抗/感材料试验过程中的EPG参量在总刺探次数、非取食波时间和总刺探波时间并无显著性差异，而在达到韧皮部时间点和第一次的刺探时间点，抗蚜材料明显比感蚜材料到达的时间点要晚，抗/感材料之间存在显著性差异。其中第一次的刺探时间点在试验过程中由于操作和蚜虫取食习性的差异，往往波动很大。而在主动取食波G波持续时间上，抗性材料BC13虽然G波时间比感蚜材料短，但其间达不到显著性差异，而另一份材料BC51则与感蚜材料存在显著性差异，比三份材料的G波取食时间均要短。在E波时间上，之前所处理的BC01与BC47并无显著性差异，而在此处抗蚜材料的E波取食时间比感蚜材料要短，且存在显著性差异，这也许跟种质材料的特异性相关，其具体机理还有待于今后做进一步的研究。
从上述4份抗/感材料的检测中，研究结果验证了上述基于EPG抗蚜鉴定体系与评价指标具有较好的重复性和较高的实用价值。一般而言，常规的7项EPG参量可以用来判别抗/感蚜程度，其中，到达韧皮部时间点、第一次刺探时间和G波时间可以作为埃芥抗蚜性鉴定的三个重要指标。
表5桃蚜在埃芥抗/感蚜品种上的EPG参数的验证结果(总记录时间为6h，5个有效重复)
注：采用曼-惠特尼U检验进行显著性分析，显著水平定于0.05和0.01。在利用比例或比率的试验中，卡方检验的水平也是0.05和0.01。Ns为没有显著性差异(P>0.05)，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
Claims (3)
1.一种埃芥抗蚜性的鉴定方法，其特征在于，将蚜虫饥饿处理后用银胶和金丝连接其背部，接种于埃芥叶片。蚜虫取食后形成EPG电通路，分析桃蚜6h取食过程中的取食波，若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为20.51～32.51、26.36～55.54min和36.18～47.84min，则表明该埃芥为感蚜材料；若到达韧皮部时间、第一次刺探时间和G波时间分别为41.18～70.78min、181.07～365.85min和18.03～26.37min，则表明该埃芥为抗蚜材料。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，进一步利用室内蚜量比值与植株生长状况进行综合评价，基于受害指数(DI)对抗蚜性进行鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蚜虫为纯化后的蚜虫，纯化过程包括母蚜的选育与第一代蚜蚜龄的判定，并采用第一代及以后的二龄子蚜进行接种。
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