CN105191682B

CN105191682B - 一种花生网斑病抗病性鉴定方法

Info

Publication number: CN105191682B
Application number: CN201510708861.XA
Authority: CN
Inventors: 王振宇; 李绍建; 张新友; 高蒙; 崔小伟; 王娜; 桑素玲
Original assignee: Institute of Plant Protection of Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Lubao Science and Technology Development Co., Ltd.
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105191682A

Abstract

本发明公开了一种花生网斑病抗病性鉴定方法，属于作物抗病性鉴定技术领域。该方法包括以下步骤：将花生网斑病病原菌制成菌丝悬浮液，喷雾接种花生幼苗，待发病后记录各植株的病级数并计算病情指数，评价花生品种对花生网斑病的抗病性。本发明采用花生网斑病菌丝悬浮液接种花生幼苗，能够克服网斑病菌产孢难、产孢慢、产孢量小、取孢难等问题，无需等待产孢，可快速、准确地对育种材料进行网斑病抗病性鉴定。该方法可大量扩繁病原菌丝，不受时限批量生产，相较分生孢子鉴定法周期短，占用资源少，成本低，操作简便，适用于室内盆栽和田间花生材料的抗病性鉴定。

Description

一种花生网斑病抗病性鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种花生网斑病抗病性鉴定方法，属于作物抗病性鉴定技术领域。

背景技术

叶斑病是花生上发生普遍、危害严重的一类病害，主要有花生褐斑病、黑斑病以及近年新发生的花生网斑病，其中褐斑病与黑斑病常混合发生。叶斑病主要在花生生长的中、后期发生，严重时引起叶片大量提早脱落。受害花生一般减产10～20％，严重的达40％以上。然而化学药剂对花生叶部病害的防治效果不太理想，防效在60％左右，而种植抗病品种(系)仍是防治花生叶部病害的有效方法。

目前，花生网斑病仅依赖于田间自然发病进行鉴定，受自然气候及菌源约束较大，且年季间差异较大。自然病圃通过人工创造发病条件和连年重茬种植虽可解决上述问题，但受场地制约明显，不能大范围推广应用。并且花生网斑病原菌为花生茎点霉，室内培养时在常规PDA上产孢慢(30天左右)且产孢量少，在燕麦培养基上产孢相对增多，但产孢时间仍相对较长(20天以上)，另外，由于其分生孢子器为埋生或半埋生，取孢难，且产孢量对于田间接种鉴定来讲远达不到要求。非专利文献(《花生品种(系)对叶斑病的抗性鉴定》)公开的一种了人工接种鉴定花生网斑病抗病性的方法，包括：春播花生，每个品种种植2行，行长15m，每穴2粒，3次重复；田间管理为只浇水，中耕除草，不施用任何杀菌剂；接种方法为：在室内培养基上诱发花生网斑病菌的分生孢子，制成孢子悬浮液，浓度为15×10倍镜下约15个孢子，于7月10日傍晚喷雾接种；8月20日进行病害调查，每重复随机调查30株，根据病级数据计算病情指数。然而由于作物品种的抗病性受到栽培、气象、病原菌致病性等诸多因素的影响，仍有必要对上述供试品种进行异地鉴定，以验证其抗病稳定性。

花生育种目标要选择广适多抗品种，如能从人工接种方法进行突破，将极大地提高花生品种对网斑病抗病性选育的效率，加快品种选育进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种花生网斑病抗病性鉴定方法，该方法能够克服网斑病菌产孢难、产孢慢、产孢量小、取孢难等问题，快速、准确地对育种材料进行网斑病抗病性鉴定。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种花生网斑病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：将花生网斑病病原菌制成菌丝悬浮液，喷雾接种花生幼苗(苗龄20～40天)，待发病后(一般培养30～40天即可开始调查)记录各植株的病级数并计算病情指数，评价花生品种对花生网斑病的抗病性。

所述菌丝悬浮液的浓度为1.0×10^-3～2.0×10^-3g(菌丝)/mL，菌丝长度100～200μm，直径6～8μm。菌丝悬浮液的制备方法为：将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培养基中(如每皿接3个直径0.5cm的菌饼)，在温度25～27℃、光暗周期12h光照/12h黑暗条件下培养7～10天，刮取菌丝后加水研磨，再加入吐温-20，混匀即得。吐温-20的加入量为研磨菌液总量的0.1％～0.2％，其目的为增加菌丝片段或孢子的分散性，以及悬浮液在叶面上的附着能力。PDA固体培养基为：马铃薯、葡萄糖、琼脂与水按照质量比200:10～20:15～20:1000配方。

所述鉴定包括室内盆栽接种鉴定和田间鉴定，室内盆栽接种鉴定的条件为：温度20～30℃，湿度95％以上；田间鉴定的条件为：通过灌溉控制环境温度20～35℃，湿度控制以有晨露为准(控制土壤含水量在25％左右，冠层的相对湿度＞90％)，接种时选择无风或风速小于2m/s的傍晚进行。

所述病级数参照通用的花生叶斑病国际9级标准优化改良，病害分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积不超过叶面积的10％；

2级：病斑面积不超过叶面积的20％；

3级：叶片无病斑性脱落，病斑面积不超过叶面积的30％；

4级：叶片脱落不超过总叶片的10％，病斑面积不超过叶面积的40％；

5级：叶片脱落不超过总叶片的25％，病斑面积不超过叶面积的50％；

6级：叶片脱落不超过总叶片的50％，病斑面积不超过叶面积的60％；

7级：叶片脱落不超过总叶片的75％，病斑面积不超过叶面积的75％；

8级：叶片脱落不超过总叶片的95％，病斑面积不超过叶面积的95％；

9级：叶片脱落达95％以上，叶片全部有病斑。

所述病情指数的计算公式如下：

病情指数％＝Σ(病级值×相应病株数)/(调查总株数×9)×100。

所述抗病性评价标准可采用下述两种评价标准中的任意一种，当两种评价标准不一致时，以病种的级别或指数为准进行判定。

按病级评价标准：0级，免疫(I)；1级，高抗(HR)；2级、3级，抗(R)；4级、5级、6级，中抗(MR)；7级、8级，感(S)；9级，高感(HS)。

按绝对病指数(无统一标准)：0，免疫；＞0且≤10％，高抗；＞10％且≤30％，抗；＞30％且≤70％，中抗；＞70％且≤90％，感；＞90％且≤100％，高感。

本发明的有益效果：

本发明采用花生网斑病菌丝悬浮液接种花生幼苗，能够克服网斑病菌产孢难、产孢慢、产孢量小、取孢难等问题，无需等待产孢，可快速、准确地对育种材料进行网斑病抗病性鉴定。该方法可大量扩繁病原菌丝，不受时限批量生产，相较分生孢子鉴定法(目前仅能做小批量盆栽鉴定，而不能大规模地应用于田间材料的筛选)，周期短，占用资源少，成本低，操作简便，适用于室内盆栽和田间花生材料的抗病性鉴定，克服了田间自然发病受气候约束，不发病或发病不匀的弊端，增加对材料选育的准确性，有利于加快抗病育种进程。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中花生网斑病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：

1)制备花生网斑病菌丝悬浮液

将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培养基(马铃薯、葡萄糖、琼脂与水的质量比为200:20:18:1000)上，每个培养皿分散接种3个直径0.5cm的菌饼，在26±1℃光照培养箱内光暗交替培养(12h光照/12h黑暗)8天，至菌丝长满整个培养基，刮取菌丝并将其装入盛有玻璃珠的2mL PE离心管中，在离心管内加入200μL无菌水，于Bullet Blender STORM研磨仪(Next Advance)8档研磨45s，镜检菌丝长度100～200μm，直径6～8μm，取出研磨液并稀释至菌丝浓度为1.6×10^-3g/mL，按0.15％加入吐温-20后摇匀备用；

2)接种菌丝并培养

将菌丝悬浮液置于100mL喷壶中，喷雾接种苗龄20天的花生幼苗(豫花22号，夏播生育期113天，室内盆栽接种15株)，整株喷施并采用薄膜罩保湿(12h光照不保湿和12h黑暗保湿)，在温度20～30℃、湿度＞95％条件下培养(注：室内盆栽培养条件不固定，温度亦为范围值，方便操作和节能)；接种后5天花生幼苗开始显现症状(病斑有针尖大小)，接种15天时病斑直径为0.5cm左右，30天时病斑直径扩展至1cm左右，形状不规则，并伴随叶片脱落，接种40天、60天和80天(收获前10天)分别记录每棵花生植株的病级数，并以最后一次调查结果为准，结果见下表1。

表1菌丝片段悬浮液接种豫花22号调查结果

从表1可知，按照最后一次调查结果，豫花22号无论从病级还是病指数判定均为中抗品种。

对比例

分生孢子接种鉴定与实施例1中菌丝片段接种鉴定的比较

本对比例中分生孢子接种鉴定方法，包括以下步骤：

1)制备分生孢子悬浮液

将花生网斑病病原菌接种至燕麦培养基(此燕麦片50g，琼脂15g，蒸馏水500mL)上，在25℃光照培养箱内光暗交替培养(12h光照/12h黑暗)25天，用无菌水冲洗培养皿得到孢子液(备注：此时得到的孢子量较少，若先用接种针挑破分生孢子器后再冲洗，得到的孢子多，但操作麻烦，两种方法的效率均较低)，稀释后镜检孢子浓度为10⁷个/mL，按0.15％加入吐温-20，摇匀备用；

2)接种孢子并培养

将孢子悬浮液置于100mL喷壶中，喷雾接种苗龄20天的花生幼苗(室内盆栽，豫花22号中抗品种)，整株喷施并采用薄膜罩保湿(12h光照不保湿和12h黑暗保湿)，培养温度20～30℃，湿度＞95％；接种后5天花生幼苗开始显现症状(病斑有针尖大小)，接种15天时病斑直径为0.5cm左右，30天时病斑直径扩展至1cm左右，形状不规则，并伴随叶片脱落，症状基本同实施例1，具体见下表2。

表2室内盆栽菌丝片段与分生孢子接种鉴定比较

从表2可知，菌丝片段接种与分生孢子接种的致病性一致，对花生网斑病而言，可以采用菌丝片段接种替代分生孢子接种进行鉴定，以提高鉴定效率。

实施例2

本实施例中花生网斑病抗病性鉴定方法，包括以下步骤：

1)种子准备及田间播种

选择如下表3所示种子质量达标且表现稳定的品种(均为河南省参试鉴定品种)，将颗粒饱满均匀的籽粒于田间分行播种，播种完毕覆土约3cm，常规管理，适时灌溉；

2)制备花生网斑病菌丝悬浮液

将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培养基(同实施例1)上，每个培养皿分散接种3个直径0.5cm的菌饼，在26±1℃光照培养箱内光暗交替培养(12h光照/12h黑暗)10天，至菌丝长满整个培养基，刮取菌丝并将其装入盛有玻璃珠的2mL PE离心管中，在离心管内加入200μL无菌水，于Bullet Blender STORM研磨仪(Next Advance)8档研磨45s，镜检菌丝长度100～200μm，直径6～8μm，取出研磨液并稀释至菌丝浓度为1.8×10^-3g/mL，按0.15％加入吐温-20后摇匀备用；

3)接种菌丝及培养

将菌丝悬浮液置于田间用喷壶中，按下表3中接种方式喷雾接种花生幼苗，各花生品种(麦套花生，生育期120天左右)按照种植设置逐一均匀喷施，常规管理，自然条件通过浇水来控制田间温湿度，保持温度在20～30℃，湿度＞95％。接种40天后按照改良的花生叶斑病国际通用9级标准调查各品种网斑病的发病情况，共调查3次(初始调查在苗后90天左右)，间隔10天，根据病级数据计算病情指数，评价各花生品种的抗病性(根据生育期不同，最后一次调查于收获前10天完成)。收获前10天调查结果见下表3。

表3人工接种和田间自然发病的鉴定结果对照

Claims

1.一种花生网斑病抗病性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：将花生网斑病病原菌制成菌丝悬浮液，喷雾接种花生幼苗，待发病后记录各植株的病级数并计算病情指数，评价花生品种对花生网斑病的抗病性；

菌丝悬浮液的浓度为1.0×10^-3～2.0×10^-3g/mL，菌丝长度100～200μm，直径6～8μm；菌丝悬浮液的制备方法为：将花生网斑病病原菌接种至PDA固体培养基中，在温度25～27℃下培养7～10天，刮取菌丝后加水研磨，再加入吐温-20，混匀即得；喷雾接种花生幼苗的苗龄为20～40天；

病级数按如下病害分级标准判断：0级：无病斑；1级：病斑面积不超过叶面积的10％；2级：病斑面积不超过叶面积的20％；3级：叶片无病斑性脱落，病斑面积不超过叶面积的30％；4级：叶片脱落不超过总叶片的10％，病斑面积不超过叶面积的40％；5级：叶片脱落不超过总叶片的25％，病斑面积不超过叶面积的50％；6级：叶片脱落不超过总叶片的50％，病斑面积不超过叶面积的60％；7级：叶片脱落不超过总叶片的75％，病斑面积不超过叶面积的75％；8级：叶片脱落不超过总叶片的95％，病斑面积不超过叶面积的95％；9级：叶片脱落达95％以上，叶片全部有病斑；

病情指数的计算公式为：病情指数％＝Σ(病级值×相应病株数)/(调查总株数×9)×100；

抗病性的评价标准为：按病级评价：0级，免疫I；1级，高抗HR；2级、3级抗R；4级、5级、6级，中抗MR；7级、8级，感S；9级，高感HS；

或抗病性的评价标准为：按绝对病情指数：0，免疫；＞0且≤10％，高抗；＞10％且≤30％，抗；＞30％且≤70％，中抗；＞70％且≤90％，感；＞90％且≤100％，高感。