CN104488645B - 一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法；本发明是利用苹果重茬园未经改造的土地，对多种苹果砧木实生苗进行原位抗性育种，初步筛选后验证获得抗性砧木材料。利用本发明，可以提高抗重茬育种的专一性和育种效率，大大缩短抗重茬砧木选育的时间周期，获得的植物材料抗重茬能力强，性状稳定。并且本方法也适合在其他果树种类和土壤类型上上进行抗性砧木筛选(如使用老桃园未改良土壤选育桃树砧木，利用干旱土壤进行抗旱砧木选育，使用老葡萄园土壤进行抗线虫砧木选育等等)，可以为生产上提供较为有效的苹果耐重茬砧木类型。

Description

一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法

(一)技术领域

本发明涉及一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法，属于果树育种领域。

(二)背景技术

我国目前生产上苹果园大都在上世纪八九十年代建园，现在已陆续进入衰老期，但是许多苹果大县已经缺乏足够的土地新建苹果园，许多地方不得不重茬种苹果，尚未解决的连作障碍问题势必会给果农带来严重的经济损失。

目前，生产上克服重茬障碍的传统方式措施，费时费力，污染环境，浪费资源，很难大规模改善重茬障碍造成的损失。如果针对性的选育抗性砧木，利用不同砧木对引起连作障碍的病原生物抵抗力，是相对直接有效的措施，具有重要的意义。

(三)发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法，可以为生产上提供较为有效的苹果耐重茬砧木类型。

造成苹果连作障碍的主要原因是老苹果树根系分泌的大量的代谢产物，造成土壤中自毒物质的积累及土壤微生物环境的变化。经发明人研究发现，距离原树穴越近的区域，对新生幼树的危害越大，这种危害在当年危害最大。经过大量试验验证，发明人发明了一种简便易操作的原位抗性育种方法。本发明利用苹果重茬园未经改造的土地，对多种苹果砧木实生苗进行原位抗性育种，初步筛选后再验证获得抗性砧木材料。利用本发明，可以提高抗重茬育种的专一性和育种效率，大大缩短抗重茬砧木选育的时间周期，获得的植物材料抗重茬能力强，性状稳定。并且本方法也适合在其他果树种类和土壤类型上上进行抗性砧木筛选(如使用老桃园未改良土壤选育桃树砧木，利用干旱土壤进行抗旱砧木选育，使用老葡萄园土壤进行抗线虫砧木选育等等)。

一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法，包括以下步骤：

1、第一阶段：进行抗重茬材料初选

1)选择20年以上老苹果园，将原树清除，土壤中的残留根清除干净。

2)以原树位置为中心，进行原树穴位置标记。

3)对土壤进行平整作业，尽量不破坏原土层结构。第一年春季以撒播的方式播种层积好的苹果砧木种子。

4)当年生长季结束时(9-10月)，以原树穴为中心，将其周围半径50cm内的区域内存活并且生长基本正常的植株初步筛选为较耐重茬植株，称为“初选材料”；

2、第二阶段：初选材料自生根

第二年春天将步骤1)中初步筛选获得的“初选材料”移栽到资源圃中，加强肥水管理，使每个“初选材料”促发大量枝条，以“初选材料”发出的枝条为繁育材料，根据不同植株的生根特性，采用压条生根或者扦插生根或者组织培养等方法繁育耐重茬砧木自根苗株系，其中涉及的技术条件如采用压条生根，培土时间、基质比例、培土高度和浇水施肥程序等根据具体效果采用现有技术调整。通过一年的繁育，单个“初选材料”株系自根苗繁育数量达到60株以上的作为“验证株系”。繁育数量达不到实验要求(60株)的单个“初选材料”继续繁育，达到数量标准后进行验证。

3、第三阶段：耐重茬抗性验证

第三年将步骤2)繁育的耐重茬砧木自根苗“验证株系”进行重茬土抗性的验证：将繁育得到的每种砧木“初选材料”自根苗“验证株系”(60株以上)平均分为两组，一组移栽到重茬土(重茬土是步骤1所述老果园中的土)作为试验组；一组移栽到消毒土(将同样的重茬土高温消毒)中作为对照组；栽培2个月后开始分别对每个“验证株系”的两组处理进行重茬抗性指标的检测，抗性指标包括植株的株高、茎粗、叶面积和节位数等生物学指标及叶绿素含量、光合速率等生理指标。通过一个生长季的调查，待检测结束后，比较每个“验证株系”在重茬土和消毒土中的抗性指标，抗性指标统计分析没有显著性差异者，确认为抗重茬砧木材料。

(四)附图说明

图1为选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法三阶段示意图。

图1中，包括原树穴和各区组成，处代表原树穴，在原树穴周围以半径每50cm划为一个区，按照每小区距离原树穴的距离，分为A、B、C等区(即A区和B区之间的间距为50CM；B区和C区和之间的间距为50CM)；A区离树穴最近，B区次之，C区更远，以此类推，根据原果园株行距具体确定分区。C区以外的土地选择压力小，育种价值不大，可以放弃调查。

图2为2012年在莱州，泰安、蒙阴等进行原位育种时调查小区的分布情况，为了方便计量，小区划分成50cm见方的方形区域并加以编号，处为原树干。

图3为2012年进行原位育种时不同小区实生苗木株高变化(CM))。

图4为2012年进行原位育种时不同小区实生苗地径变化(mm)。

图5为2012年进行原位育种时不同小区实生苗叶片叶绿素含量变化(SPAD)。

图6为2014年初选优系L19组培自根苗在重茬土中与对照株高和径粗的变化，差异很小，反映了较强的抗重茬特性。

图7为2014年初选优系优系L20组培自根苗在重茬土中与对照株高和径粗的变化，差异很小，反映了较强的抗重茬特性。

图8为2014年初选优系优系L24组培自根苗在重茬土中与对照株高和径粗的变化，差异很小，反映了较强的抗重茬特性。

图9为2014年初选优系L31组培自根苗在重茬土中与对照株高和径粗的变化，差异极小，反映了很强的抗重茬特性

(五)具体实施方式

实施例1本发明筛选试验

第一阶段：进行抗重茬材料初选

1)选择20年以上老苹果园，将原树清除，土壤中的残留根清除干净。

2)以原树位置为中心，进行原树穴位置标记。

3)对土壤进行平整作业，尽量不破坏原土层结构。第一年春季以撒播的方式播种层积好的苹果砧木种子。尽量撒播均匀，用其余区域表土覆盖1-2cm，并覆盖地膜。

4)以原树穴为中心，将其周围半径50cm内的区域设为A区，在A区周围50cm内的区域设为B区，依次类推；每个区可继续等面积划分为多个小区，便于调查统计，期间苗木按常规方法正常管理。

5)当年生长季结束(9-10月)，开始统计各小区海棠实生苗的成活率及生物学性状。在距离原树穴最近的区域(比如A区)海棠实生苗成活率很低，存活并且生长基本正常的植株可初步定为较耐重茬的植株。在距离原树穴稍远的区域(如B区)，如果在大部分的实生苗植株长势较弱，生理指标低的情况下，其中有个别植株长势壮，各项生理指标高，这时将这些长势壮的实生苗植株初步定为较耐重茬砧木即“初选材料”。C区以外的土地选择压力小，育种价值不大，可以放弃调查。

第二阶段：初选材料自生根

1)第二年春天将初步筛选获得的“初选材料”，移栽到资源圃中，加强肥水管理，促发大量枝条，根据不同植物特性，分别采用压条生根、扦插生根、组织培养等技术繁育得到的60株以上的耐重茬砧木自根苗作为“验证株系”，此步骤中采用的技术手段均为现有常规育苗方法。

第三阶段：耐重茬抗性验证

2)将繁育的自根苗“验证株系”进行重茬土抗性的验证，对每个“验证株系”平均分为两组，即试验组(重茬土)和对照组(重茬消毒土)，将“验证株系”自根苗分别移栽到重茬土和重茬消毒土中，培育二个月后进行重茬抗性的检测，主要检测抗性指标包括植株的株高、茎粗、叶面积和节位数等生物学指标及叶绿素含量、光合速率等生理指标。

3)待检测结束后，比较重茬土和消毒土间试验值的差异，在两组处理中主要抗性指标没有差异者为具有抗性的砧木材料，最终获得抗重茬砧木材料。因为原位土壤的不均一性，这是田间土壤必然存在的自然特性，极有可能某一区位的土壤危害性不强，“初选材料”株系可能具有偶然性，通过本阶段的具体检测，可进一步确认其抗性特征。

验证例：

1.如图1所示，利用这种原位抗性育种的调查方法,于2012年开始分别在莱州，泰安、蒙阴等地选取20年以上的老果园进行试验调查。

2.将原树刨除，清除残留根系，平整土地。

3.以原树穴的位置为中心，每个树穴及周围土地为一个选育单位，按照距离原树穴每50cm的距离划分为一个小区，依次分为A、B、C等区(见图2所示)。为方便记录，对A、B、C每个区再按照50cm见方划分成小区并进行编号(图2)。数据均为莱州，泰安、蒙阴等三地平均结果。

4.以撒播的方式在每个小区均匀播种层积好的杂交海棠种子，对每个小区的环境及海棠生长状况进行调差比较。计算每个小区的成活率，对每株海棠的株高、地径、叶绿素进行调查测定。将成活率、株高、地径、叶绿素、光合速率等初步作为生长状况的评价指标，对每个小区的生长状况作出整体评价。

4.1原树穴周围土壤状况调查

试验结果表明：距原树干不同距离的小区内的土壤状况有一定的差异。

表1 各小区地表土壤温度统计表 单位：℃

注：小区编号为2012年在莱州，泰安、蒙阴等进行原位育种时调查小区的分布情况，为了方便计量，小区划分成50cm见方的方形区域并加以编号(参见附图2)，表中数据均为三地平均数据。下同。

表2 各区平均地表土壤温度比较 单位：℃

试验结果表明，随着距原树干距离的增加，各小区地表土壤温度有降低的趋势(表1)。每远离原树干50CM，地表土壤温度降低0.3℃，且这种趋势贯穿于海棠整个生长季(表2)。地表土壤含水量，A区最多，B区次之，C区最少(表3)。随着距原树干距离的增加，各小区地表土壤水分有减少的趋势(表4)。地表土壤含盐量，A区、B区和C区没有明显的变化趋势(表5)。

表3 各小区地表土壤水分统计表

表4 各区平均地表土壤水分比较

表5 各小区地表土壤盐分统计表

表6 各区平均地表土壤盐分比较

对原树干周围地表土壤温度、水分、盐含量总结调查分析，与B区和C区相比，距离原树干最近的A区温度偏高、含水量略高。表明原树干周围重茬土存在明显的差异性分布，这种情况是受原根系生长状态影响造成的，我们称之为“根控区”，根控区的半径范围为50CM左右。

4.2原树穴周围播种实生苗生物学性状差异

试验对不同小区的实生苗生物学性状(成活棵树、叶片数、株高、地径、叶绿素等)进行了调查测量。试验结果表明，老果园的植株清除后，仍对果园的土壤和植株有一定的影响。

1株高

试验结果表明，距原树干的距离不同，实生苗的株高有明显的差异(图3)；前期调查B>C>A，与根控区周围土壤条件有关，水、温较为协调，此时生长主要靠苗木自身贮藏营养，根控区的重茬效应表达还补充，到7月这个时期苗木生长动力已经转化为当年光合营养，重茬效应表现突出，株高变化为C>B>A。至于后期A区平均株高略高于B区，与存活株数有关。A区存活数量最少，均具有较强抗性，整齐度高，平均株高亦较高，而B区虽然总生长量大于A区，但存活数较多，个体间差异大，平均数反而不及A区，在以后的数据中也有这种情况。C区后期基本没有受到重茬效应的显著影响。

2地径

结果表明，各小区地径存在明显差异(图4)；A区地径小于B区的，生长后期(7月份和10月份)地径呈现A<B<C的变化趋势；这一趋势自7月之后再没有改变过，说明重茬效应对实生苗的地径影响更加显著，是比株高更灵敏的数据，在选育中应注意应用。

3叶绿素

在生长过程中，各区实生苗的叶绿素含量均有一定程度的增加(图5)；早期A区叶绿素含量要高于B和C区，一般在逆境胁迫初期叶绿素含量升高是一个普遍性反应，但随着时间的延长这种应急反应逐渐消退，且较强的逆境胁迫会抑制叶绿素的合成。所以到了七月份，B、C区叶绿素含量均有显著性增长，均高于A区，而A区增加极少，侧面印证了根控区的抑制效应。

4存活株数

可以看出，在不同区域中存活株数具有极显著差异，并且在生长过程中，后续死亡率从原树穴向外持续降低。到生长后期，A区只有46.7％的苗木存活，B区存活率为61.8％，高于A区但无显著差异，说明筛选抗性植株这两个区域是具有相近效果的。C区明显高于前两个区，存活率为89.5％，表明该区重茬抑制效应的显著减弱。其他指标数据具有类似效果，值得注意的是株高、地径C区略低于A、B区的情况，主要是C区存活株数数量过多，互相竞争导致株间差异加大所致，说明有很多生长弱势的植株也存活了下来，表明该区的重茬胁迫确实比根控区要弱得多(表7)。

表7 A、B、C三区苗木生物学性状比较

老果园的植株清除后，这些植株仍对原树干周围的地表土壤，如温度、水分，存在影响。在原树干周围形成一个半径约0.5M的根控区，其地表温度和含水量都高于周围土壤。根控区内播种的实生苗，成活率显著降低。到当年10月，苗存活率仅有46.7％，存苗量仅有总存苗的13.5％。存活的实生苗生长高度、粗度尚优于根控区外地苗木。这表明存活苗木可能有较强的连作抗性。

根控区外50～100CM范围内，称为次根控区。次根控区内播种的实生苗，苗木存活率较根控区内高。当年10月统计，苗存活率超过60％，但平均生长高度、粗度稍逊于根控区内苗木，其中优势苗木应该有连作抗性。次根控区外实生苗生长状况明显优于根控区和次根控区，不是连作抗性育种的理想筛选区。

调查结果显示，三区杂交海棠实生苗成活棵树存在一定的规律，离树穴越远，成活率越高；成活棵树随时间延长而减少。A、B、C三区中的成活率具有C>B>A的规律，株高、径粗、叶绿素含量等生长量总的变化基本存在A>B>C的规律。之所以出现和成活率相反的结果，主要是在抑制较为严重的A区和B区，具有一些长势较好，各生理指标较高的实生苗植株才能存活下来，弱势苗木逐渐死亡，而C区存活株数数量过多，互相竞争导致株间差异加大所致，说明有很多生长弱势的植株也存活了下来，生长量等平均指标反而不及A、B区，表明该区的重茬胁迫确实比根控区要弱得多，A、B区长势较好，各生理指标较高的实生苗植株初步筛选作为抗重茬砧木的材料。

经过两年的调查结果及对比试验，经初步筛选共获得抗性优系338棵，其中蒙阴116棵，莱州98棵，泰安124棵。

5.以初步得到的耐重茬抗性植株为材料，于2013年5月开始以其中部分植株嫩梢为材料，以组织培养的方式进行自根苗繁育，经过外植体的培养、芽的增殖、生根培养、炼苗、移栽的过程，2014年春季共获得4种株系(L19、L20、L24、L31)足够的组培自根苗“初选材料”(60株以上)进行重茬土验证。其他数量不足(移栽成活少于60株的)的，继续进行扩繁，留待二期实验。

6.2014年3月30日将通过组织培养培育得到并移栽成活60株以上的每个“初选材料”株系(L19、L20、L24、L31)均移栽至重茬土和消毒土中(将同样的重茬土消毒处理后作为对照，消毒方法为高温蒸汽消毒)进行盆栽实验，即每个“初选材料”株系均平均分为两组，一组移栽到重茬土中；一组移栽到消毒土中作为对照；5月至9月每隔一个月对株高、地径、叶绿素等进行测定，并在适宜天气分别选择每个处理中每种自根苗新梢第5～6片叶，用CI-310型光合测定仪对叶片的光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、单叶水分利用效率(WUE)及胞间CO2浓度(Ci)等指标进行测定。以株高、径粗和光合参数为例，如图2、图3、图4、图5所示。

各优系植株的株高和径粗虽然都因重茬环境受到不同程度的影响，四个优系【L19、L20、L24、L31】经重茬土处理的株高平均比消毒土处理低8.6％、5.0％、7.1％和1.5％；径粗平均比消毒土处理低5.0％、6.4％、9.5％和2.6％。方差分析结果表明差异均不显著，均体现了很好的耐重茬特性。特别是L31，在重茬土中表现了出色的生长特性，体现了很强的抗重茬性能，是复选株系中的佼佼者。说明这四个株系都是抗重茬砧木材料。

综上所述，利用原位抗性育种的方法，能够在未经改造的老果园可靠地选育出耐重茬砧木，同时也可为苹果其他抗性(如抗旱、寒、盐碱)砧木的选育做出参考。

Claims (1)

1.一种三阶段选育苹果耐重茬砧木的原位育种方法，其特征在于包括以下步骤：

A、第一阶段：进行抗重茬材料初选

1)选择20年以上老苹果园，将原树清除，土壤中的残留根清除干净；

2)以原树位置为中心，进行原树穴位置标记；

3)不破坏原土层结构，对土壤进行平整作业，第一年春季以撒播的方式播种层积好的苹果砧木种子；

4)当年9-10月生长季结束时，以原树穴为中心，将其周围半径50cm内的区域内存活并且生长基本正常的植株初步筛选为较耐重茬植株，获得“初选材料”；

B、第二阶段：初选材料自生根

第二年春天将步骤A中初步筛选获得的“初选材料”移栽到资源圃中，加强肥水管理，使每个“初选材料”促发大量枝条，以“初选材料”发出的枝条为繁育材料，根据不同植株的生根特性，采用压条生根或者扦插生根或者组织培养方法繁育耐重茬砧木自根苗株系；通过一年的繁育，单个“初选材料”株系自根苗繁育数量达到60株以上的作为“验证株系”；繁育数量达不到60株的单个“初选材料”继续繁育；

C、第三阶段：耐重茬抗性验证

第三年将步骤B繁育的耐重茬砧木自根苗“验证株系”进行重茬土抗性的验证：将繁育得到的每种砧木“初选材料”自根苗“验证株系”平均分为两组，一组移栽到重茬土作为试验组；一组移栽到消毒土中作为对照组；栽培2个月后开始分别对每个“验证株系”的两组处理进行重茬抗性指标的检测，抗性指标包括植株的株高、茎粗、叶面积和节位数生物学指标及叶绿素含量、光合速率生理指标；通过一个生长季的调查，待检测结束后，比较每个“验证株系”在重茬土和消毒土中的抗性指标，抗性指标统计分析没有显著性差异者，确认为抗重茬砧木材料。