CN101999287B - 一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法，有以下顺序步骤：池水保温循环漂浮池建造、烟苗移植、接种体制备及接种、病情调查与分级和抗性评价；本发明具有发病迅速、结果重复性好、可靠、无其他病害干扰等特点，实现了用苗期鉴定结果代替传统大田鉴定结果，实现了在较小面积上鉴定大量材料、一年多次鉴定，提高了结果的可靠性、缩短了鉴定周期、节省鉴定成本。

Description

一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，特别是一种烟草黑胫病抗性的苗期温水水培鉴定方法。

背景技术

烟草黑胫病是烟草(Nicotiana tabacum)生产上的毁灭性病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。美国北卡罗莱纳州每年因烟草黑胫病损失的烟叶约占总产量的1％～2％，1995年和1996年两年间因黑胫病造成的损失就达3610万美元，占病害总损失的35.13％，居各病害之首。该病在我国分布范围很广，除黑龙江省尚未发现之外，其余各植烟省区(含台湾省)均有发生。平均发病率为5％～12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万千克，产值损失超过1.23亿元人民币。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。

现有的烟草抗性鉴定方法主要有温室苗期鉴定接种法和病圃活体菌株人工接种鉴定法。苗期鉴定法通常采用游动孢子或菌丝体悬浮液浸根接种，病圃活体菌株人工接种鉴定是目前常用的鉴定方法，缺点是移栽缓苗后接种，时间长，工作量大。

我国烟草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是当前国际上先进的育苗新技术，具有壮苗率高、操作简便、专业化程度高、省工节时、方便管理、有利环境保护等许多优点，近年来，在我省得到了大面积推广应用，因此，在漂浮育苗基础上，建立烟草黑胫病抗性的漂浮池水培接种鉴定方法，对抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究和抗病育种具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的步骤，提供一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法，用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的土壤盆栽和大田鉴定结果。消除环境温度和湿度对鉴定结果的影响，避免其他病害对鉴定结果的干扰，提高鉴定结果的准确性，同时可节省场地和试验成本、缩短鉴定时间。

本发明通过以下技术方案予以实现：

1)池水保温循环漂浮池建造

在玻璃温室或塑料大棚温室内建造，池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺两层塑料膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温，水深5cm～20cm。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。控温电加热棒和池水循环泵通过控温装置联动。池水为深井水或自来水。根据黑胫病适宜发病温度和黑胫病区土温，设置水温为24.0℃～32.0℃。

2)烟苗移植及日常管理

烟苗一次剪叶后，苗龄30d～50d，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。以革新三号、G28品种为抗病对照，以红花大金元品种为感病对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg～250mg/kg。根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。

3)接种体制备及接种

烟草黑胫病菌活化后，接种燕麦液体培养基，在28℃、150rpm的摇床上培养2周，按质量比加0.1％硝酸钾到培养基溶液，混合得到游动孢子悬浮菌液；茎基部创伤接种：吸取游动孢子悬浮菌液注射接种于40d苗龄烟苗的茎基部，每株接种5mL菌液(1000孢子/mL)，每个品种设3个重复，每个重复接种15株。

接种后将育苗盘放入28℃恒温池，及时喷水保持较高湿度，诱发病害产生。

4)病情调查与分级

接种后3d调查发病情况，以后每隔2d～3d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到70％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。

病害严重度分级标准按GB/T 23222-2008的规定。

5)抗性评价

抗性评价标准按GB/T 23224-2008的规定。

本发明与现有技术相比具有如下的优点和有益效果：

1)在塑料拱棚温室中均匀提高土壤温度难度大，恒温温室造价高。本发明通过在普通漂浮池基础上，增加简单的保温材料、加热控温设备和水循环泵，以低成本成功解决了温度问题。

2)采用市售的肥料和自来水配制营养液，与MS营养液和无菌水相比，成本大幅度降低。

3)漂浮池恒温水培鉴定可在一个月之内完成，使得提高烟苗密度、减少水培面积可行，从而大幅度减少接种菌的数量。

漂浮池恒温水培鉴定方法的实用性在于：发病迅速，从接种到调查结束可在一个月内完成；占地面积小，在几十平方米的面积上一次可同时鉴定上千株烟苗；结果重复性高，能有效排除土壤温度差异和其他病害对抗性结果的干扰，有利于年度间和不同实验室间结果重现和比较；结果可靠性高，抗感品种的发病率和病情指数差异明显，品种的抗性评价结果与他人多年的抗性评价结果基本一致。该方法在抗病资源和育种中间材料的抗性鉴定、抗性遗传规律研究中应用潜力较大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1：一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法，在玻璃温室或塑料大棚温室内建造保温加热漂浮池。池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层塑料膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。控温电加热棒和池水循环泵通过控温装置联动。池水为深井水或自来水。水深10cm。根据黑胫病适宜发病温度设置水温为28℃。烟苗一次剪叶后，苗龄40d，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。以革新三号、G28品种为抗病对照，以红花大金元品种为感病对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在150mg/kg。根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。将保存的黑胫菌菌株使用前在燕麦培养基活化后，接种燕麦液体培养基28℃150rpm摇床培养2周，加0.1％硝酸钾溶液。茎基部创伤接种，吸取游动孢子悬浮液注射接种40d苗龄烟苗的茎基部，每株接种5mL菌液(1000孢子/mL)，每品种设3个重复，每重复接种15株。接种后将育苗盘放入28℃恒温池，及时喷水保持较高湿度，诱发病害产生。接种后3d调查发病情况，以后每隔2d～3d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到70％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。病害严重度分级标准应符合GB/T 23222-2008的规定。抗性评价标准应符合GB/T23224-2008的规定。

实施例2：重复实施例1，有以下不同点：池水温度设置为24℃。

实施例3：重复实施例1，有以下不同点：池水温度设置为32℃。

实施例4：重复实施例1，有以下不同点：苗龄50d。

实施例5：重复实施例1，有以下不同点：苗龄30d。

实施例6：重复实施例1，有以下不同点：非创伤接种。

下面为采用本发明的黑胫病苗期恒温水培鉴定与苗期盆栽鉴定、大田病圃接种发病鉴定结果的相关性分析。

1材料与方法

1.1供试材料

供试烟草材料革新三号、G28、K326、KM10、小黄金1025和红花大金元，为国内外报道的抗、感黑胫病资源。以革新三号、G28为抗病对照，小黄金1025、红花大金元为感病对照。黑胫菌强致病力菌株162#，分离自云南省文山州文山县。

1.2室内苗期抗性鉴定

1.2.1漂浮池恒温水培接种鉴定

池水保温循环漂浮池建造方法：池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层池膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。电加热棒和池水循环泵通过控温装置联动。根据黑胫病适宜发病温度设置水温为28℃。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。烟苗一次剪叶后(苗龄40d)，每个材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。将保存的黑胫菌菌株使用前在燕麦培养基活化后，接种燕麦液体培养基28℃150rpm摇床培养2周，加0.1％硝酸钾溶液。茎基部创伤接种，吸取游动孢子悬浮液注射接种40d苗龄烟苗的茎基部，每株接种5mL菌液(10000孢子/mL)，每品种设3个重复，每重复接种15株。接种后将育苗盘放入28℃恒温池，及时喷水保持较高湿度，诱发病害产生。接种后3d调查发病情况，以后每隔2d～3d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到70％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。

1.2.2土壤盆栽伤根接种鉴定

在塑料拱棚温室内进行。盆栽苗龄50d烟苗，每材料30株。采用直径12cm的一次性黑色塑料花盆，每盆装红壤土约500g。移栽成活后，在烟株两侧将刀刮伤烟苗茎基部，每株浇灌1×10⁴cfu/mL菌悬液20ml。通过温室通风帘控制室内白天温度、傍晚关闭通风帘保温。接种后每周观察一次发病情况，在感病对照发病率达到20％左右详细调查病情，以感病对照发病率达到75％左右的调查结果作为品种抗性评价标准。

1.3病圃接种发病鉴定

在烟田黑胫病圃中进行，田间设计随机排列，3次重复，每个小区种植15株，行株距为1.2m×0.50m；其它田间栽培管理按当地优质烟生产技术进行。

1.4病情调查与抗性评价

病害严重度分级标准按照GB/T 23222-2008的规定。0级：全株无病；1级：茎部病斑不超过茎围得三分之一，或三分之一以下叶片萎焉；3级：颈部病斑环绕茎围三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；5级：茎部病斑超过茎围得二分之一，但未全部环绕茎围，获二分之一至三分之二叶片凋萎；7级：茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎；9级：病株基本枯死。

抗性评价标准按照GB/T 23224-2008的规定。抗性评价标准：高抗或免疫(I)：病情指数为0；抗病(R)：病情指数0.1～20；中抗(MR)：病情指数20.1～40；中感(MS)：病情指数40.1～60；感病(S)：病情指数60.1～80；高感(HS)：病情指数80.1～100。

2.结果与分析

2.1苗期恒温水培接种黑胫病抗性鉴定方法发病情况

表1不同方法和不同浓度接种对黑胫病病情的影响

在塑料拱棚温室内，在苗期漂浮池恒温水培接种试验中，不同抗性品种的病情指数差异明显见表1。创伤接种的烟苗病情指数明显高于非创伤接种病指，接种浓度高发病重。说明用原液创伤接种效果更好。

表2不同温度和不同苗龄接种对黑胫病病情的影响

在塑料拱棚温室内，在苗期漂浮池恒温水培接种试验中，感病对照红花大金元、小黄金1025接种后第3d开始零星发病，随后发病迅速，且无其他病害干扰。40d苗龄接种、池内水温28℃鉴定结果比较适宜品种的抗性鉴定与评价见表2。

2.2恒温水培接种、土壤盆栽接种与田间病圃接种的抗性结果比较

表3恒温水培接种、土壤盆栽接种与田间病圃接种的抗性结果

在苗期漂浮池恒温水培抗性鉴定中，已知抗黑胫病的G28、革新三号、K326表现为中抗，感病对照红花大金元和小黄金1025表现为感病，高感的KM10表现为高感。在苗期土壤盆栽伤根接种抗性鉴定中，已知抗黑胫病的G28、革新三号、K326表现为中抗，感病对照红花大金元和小黄金1025表现为感病，高感的KM10表现为高感。苗期漂浮池恒温水培接种法与苗期土壤盆栽伤根接种法得到的供试品种的病情指数表现为正相关，相关系数为0.9405。田间病圃接种抗性鉴定中，已知抗黑胫病的G28、革新三号、K326表现为中抗，感病对照红花大金元和小黄金1025表现为感病，高感的KM10表现为高感。苗期漂浮池恒温水培接种法与田间病圃接种法得到的供试品种的病情指数表现为正相关，相关系数为0.8295。漂浮池恒温水培接种、土壤盆栽伤根接种和田间病圃接种鉴定的结果与品种本身抗性基本吻合，见表3。

Claims (1)

1.一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法，其特征在于按以下顺序步骤：

1）池水保温循环漂浮池建造

在玻璃温室或塑料大棚温室内建造漂浮池，池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺两层塑料膜，池壁四周用泡沫塑料板保温；池内水深5cm～20cm，一端设控温电加热棒和池水循环泵，控温电加热棒和池水循环泵通过控温装置联动，池水为深井水或自来水，控制水温为24.0℃～32.0℃；

2）烟苗移植

以革新三号、G28品种为抗病对照，以红花大金元品种为感病对照，烟苗一次剪叶后，苗龄30d～40d时，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中；漂浮池营养液的氮素浓度控制在100 mg/kg～250 mg/kg，所述的营养液为市售的烟草漂浮育苗专用肥料配制；根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深，采用自动温湿度记录仪每小时记录一次水温；

3）接种体制备及接种

烟草黑胫病菌活化后，接种燕麦液体培养基，在28℃、150rpm的摇床上培养2周，按质量比例加0.1%硝酸钾到培养基溶液中，混合得到游动孢子悬浮菌液；吸取游动孢子悬浮菌液注射接种于40d苗龄烟苗的茎基部，每株接种5mL菌液，1000孢子/mL，每个品种设3个重复，每个重复接种15株；接种后将育苗盘放入28℃恒温池，及时喷水保持较高湿度，诱发黑胫病产生；

4）病情调查与分级

接种后3 d调查发病情况，以后每隔2d～3d调查一次发病情况，记录发病率及病情指数；以感病对照发病率，达到70%的病情指数作为品种抗性评价标准，病害严重度分级标准按GB/T 23222-2008的规定；

5) 抗性评价

抗性评价标准按GB/T 23224-2008的规定。