CN105075698B - 一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法 - Google Patents

一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法。所述方法通过组培快繁获得长势整齐的待接种烟苗，经贴敷接种处理，将长满黑胫病菌菌丝的培养基平板小块贴于微伤的烟苗根茎部，处理后的烟苗在温湿可控的人工气候室中培养，以接种后第14天的调查结果进行抗性判别，按发病率a划分抗感性。免疫或高抗的发病率为a=0，抗病的发病率为0＜a≤25%，中抗的发病率为25%＜a≤45%，中感的发病率为45%＜a≤65%，感病的发病率为65%＜a≤80%，高感的发病率为80%＜a≤100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。所述方法鉴定结果重现性高，稳定性好，效率高，可实现大规模抗性鉴定，特别适合从数量庞大的诱变群体或突变群体、杂交变异群体中筛选抗病靶标单株。

Description

一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法
技术领域
本发明属于烟草抗病性检测技术领域，具体涉及一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法。
背景技术
烟草黑胫病是由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的，一旦被侵染，整个烟株就会死亡。自然条件下，其病原菌烟草疫霉主要侵染根、茎等地下部分，偶见叶部侵染。在品种抗性鉴定中多采用根部或根胫部接种，应用较多的室内接种鉴定(GB/T 23224)要求每份材料10～20株，才可有效评价抗性。这种方法对数量庞大的诱变群体或突变群体、杂交变异群体进行单株抗性鉴定显然不适合。因此，需要建立一种新的方法解决这类材料抗性鉴定的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法。
本发明的目的是这样实现的：所述烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法包括组培快繁、贴敷接种、烟苗培养及抗性判别工序，具体包括：
A、组培快繁：取团棵期至旺长期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织，常规消毒，切取小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，形成群体后，筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗后，按常规漂浮育苗方式继续培育至5～6片真叶苗，挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种。
B、贴敷接种：用已消毒的打孔器，从长满黑胫病菌菌丝的培养基平板中打取直径或边长4～6mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用保湿透气材料包裹烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和感病品种红花大金元进行同样的处理作为对照。
C、烟苗培养：将接种后的烟苗置于盛有水的浅盘中，维持土壤湿润，在25～28℃，相对湿度75％以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养不少于14天。
D、抗性判别：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各调查1次，以最后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩展、烟苗凋萎记作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有接种烟苗，以发病率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a＝0，抗病的发病率为0＜a≤25％，中抗的发病率为25％＜a≤45％，中感的发病率为45％＜a≤65％，感病的发病率为65％＜a≤80％，高感的发病率为80％＜a≤100％，其中免疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。
本发明由于单株通过小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，可有效保持原有单株的固有遗传特性；同时由单株组织培养形成一定数量的群体，筛选长势一致的进行抗性鉴定，湿润培养，在控温、保湿、光照相对恒定的人工可控环境条件下，以感病和抗病亲本为对照，增强了抗性结果的稳定性、不同批次结果的重复性与可比性，鉴定结果重现性高，节省了鉴定的时间与空间，鉴定过程简便易学，可程序化，减少了不同操作人员间的人为误差，节省人力，可实现大规模的抗性鉴定，特别适合从数量庞大的诱变群体或突变群体、杂交变异群体中筛选抗病靶标单株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法包括组培快繁、贴敷接种、烟苗培养及抗性判别工序，具体包括：
所述组培快繁工序指的是：取团棵期至旺长期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织，常规消毒，切取小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，形成群体后，筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗后，按常规漂浮育苗方式继续培育至5～6片真叶苗，挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种。
所述贴敷接种工序指的是：用已消毒的打孔器，从长满黑胫病菌菌丝的培养基平板中打取直径或边长4～6mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用保湿透气材料包裹烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和感病品种红花大金元进行同样的处理作为对照。
所述烟苗培养工序指的是：将接种后的烟苗置于盛有水的浅盘中，维持土壤湿润，在25～28℃，相对湿度75％以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养不少于14天。
所述抗性判别工序指的是：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各调查1次，以最后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩展、烟苗凋萎记作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有接种烟苗，以发病率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a＝0，抗病的发病率为0＜a≤25％，中抗的发病率为25％＜a≤45％，中感的发病率为45％＜a≤65％，感病的发病率为65％＜a≤80％，高感的发病率为80％＜a≤100％，其中免疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。
步骤A所述筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗，时间为5～7天。
步骤A所述挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，每盆烟苗数不少于3株，每单株系烟苗数至少12株。
步骤B所述长满黑胫病菌菌丝的培养基平板为燕麦培养基平板。
步骤B所述菌丝块的直径或边长为5mm。
步骤B所述微伤的烟苗根茎是采用弯头眼科小镊子轻刮茎基部表皮或4～6根昆虫针束轻度刺伤茎基部表皮的方法处理，以形成微伤的表面。
步骤B所述保湿透气材料为脱脂棉或育苗基质。
步骤C所述维持土壤湿润，需使土壤的含水率保持在60％～80％。
步骤C所述烟苗在人工气候室中的培养时间为14天。
实施例1
——改良单株抗黑胫病鉴定
本实施例用烟草疫霉0号生理小种(中华人民共和国烟草行业标准YC/T39-1996)为实验菌株，用抗病亲本RBST和感病亲本红花大金元(HD)作为对照，对改良红花大金元的99个单株系进行抗性鉴定。
具体操作如下：
A、组培快繁：取团棵期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织，常规消毒，切取小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗(烟草叶组织培养直接获得再生植株，莱阳农学院学报，1993，10(2):131～132)。形成一定数量的群体后，筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗6天，按常规漂浮育苗方式继续培育至5～6片真叶苗，挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，每盆烟苗数3株，每单株系烟苗数36株，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种。
B、贴敷接种：用已经过75％乙醇消毒的打孔器，从新鲜长满黑胫病菌菌丝的燕麦培养基(OA)平板中打取直径5mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用湿润的育苗基质包裹烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和感病品种红花大金元进行同样的处理作为对照。
C、烟苗培养：将接种后的烟苗置于盛有自来水的浅盘中，维持土壤湿润，使土壤含水率保持在60％～80％，在25～28℃，相对湿度75％以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养14天。
D、抗性判别：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各调查1次，以最后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩展、烟苗凋萎记作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有接种烟苗，以发病率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a＝0，抗病的发病率为0＜a≤25％，中抗的发病率为25％＜a≤45％，中感的发病率为45％＜a≤65％，感病的发病率为65％＜a≤80％，高感的发病率为80％＜a≤100％，其中免疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。
实验结果见表1，实验结果表明，99个鉴定材料中无免疫的单株系，抗病的有20个，中抗的有20个，中感的有8个，感病的有8个，高感的有43个。可以选择抗病的20个单株系持续改良。
表1 烟草品种改良单株系抗黑胫病鉴定结果

Claims (8)

1.一种烟草黑胫病抗性单株的鉴定方法，其特征在于包括组培快繁、贴敷接种、烟苗培养及抗性判别工序，具体包括：
A、组培快繁：取团棵期至旺长期烟草单株的最幼嫩顶叶叶片组织，常规消毒，切取小叶圆片不经愈伤组织直接培养成苗，形成群体后，筛选长势一致的单株组培苗移栽至漂浮盘上煅苗5~7天后，按常规漂浮育苗方式继续培育至5~6片真叶苗，挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，待烟苗成活后，剪叶，整苗，以备接种；
B、贴敷接种：用已消毒的打孔器，从长满黑胫病菌菌丝的培养基平板中打取直径或边长4~6mm的菌丝块，将长满菌丝的一面贴于微伤的烟苗根茎部，用保湿透气材料包裹烟苗根茎部的菌丝块贴敷处，每株烟苗贴敷菌丝块1块；以抗性品种RBST和感病品种红花大金元进行同样的处理作为对照；
C、烟苗培养：将接种后的烟苗置于盛有水的浅盘中，维持土壤湿润，在25~28℃，相对湿度75%以上，12h光照12h黑暗交替的人工气候室中培养不少于14天；
D、抗性判别：接种后第3天开始观察发病情况，第7天、第14天各调查1次，以最后一次调查的结果统计病情，烟草黑胫病以株为单位调查，以接种点病斑扩展、烟苗凋萎记作发病，以接种点病斑不扩展、烟苗直立、生长正常记作不发病，调查所有接种烟苗，以发病率a统计病情，按发病率a划分抗感性，免疫或高抗的发病率为a=0，抗病的发病率为0＜a≤25%，中抗的发病率为25%＜a≤45%，中感的发病率为45%＜a≤65%，感病的发病率为65%＜a≤80%，高感的发病率为80%＜a≤100%，其中免疫或高抗、抗病、中抗的即为抗性材料。
2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤A所述挑选长势整齐的烟苗移栽至装有育苗基质的栽培盆中，每盆烟苗数不少于3株，每单株系烟苗数至少12株。
3.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤B所述长满黑胫病菌菌丝的培养基平板为燕麦培养基平板。
4.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤B所述菌丝块的直径或边长为5mm。
5.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤B所述微伤的烟苗根茎是采用弯头眼科小镊子轻刮茎基部表皮或4~6根昆虫针束轻度刺伤茎基部表皮的方法处理，以形成微伤的表面。
6.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤B所述保湿透气材料为育苗基质。
7.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤C所述维持土壤湿润，需使土壤的含水率保持在60%~80%。
8.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于步骤C所述烟苗在人工气候室中的培养时间为14天。
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