CN112425472A - 一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，包括苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种的田间抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种抗蚜综合评价、苜蓿品种的抗蚜机制研究。通过在室内及田间采取不同的方法对苜蓿品种的抗蚜性进行研究，再将两种方法进行综合评价得出不同苜蓿品种的抗蚜等级。然后蚜虫在侵食苜蓿时，通过对苜蓿品种外部形态特征、生理生化指标、电生理变化进行检测分析苜蓿品种的抗蚜机制，能够为不同地理环境种植苜蓿品种提供参考，确保该地区苜蓿的产量及质量，并大幅度降低了苜蓿的种植成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗虫鉴定技术领域，尤其涉及一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法。
背景技术
苜蓿是苜蓿属(Medicago)植物的通称，俗称金花菜，是一种多年生开花植物，其中最著名的是作为牧草的紫花苜蓿(Medicago sativa)，其种类繁多，营养价值高且含有最丰富的维他命K，具有清脾胃、利大小肠、下膀胱结石的功效，除食用外主要用制干草、青贮饲料、牧草等。
苜蓿在生育期间若遇到病虫害时一定要及时防治，否则会影响产量和品质。害虫以啃食农作物为生，其对植物(如苜蓿)的会造成严重的危害，严重影响苜蓿的正常生产，大量降低苜蓿的产量甚至会导致苜蓿的死亡。例如害虫中的蚜虫，其又称腻虫、蜜虫，是一类植食性昆虫，是苜蓿种植上最具破坏性的害虫之一。蚜虫具有一对腹管，用于排出可迅速硬化的防御液，腹管通常管状，吸食植物汁液，其不仅阻碍植物生长，形成虫瘿，传布病毒，而且造成花、叶、芽畸形。植株上的蚜虫过密时，有的长出两对大型膜质翅，寻找新宿主。
而不同地理环境的品种苜蓿对蚜虫的抗虫性也是不同的，种植时选择抗虫性较高的苜蓿品种，其对于确保苜蓿的产量、质量等是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，通过在室内及田间采取不同的方法对苜蓿品种的抗蚜性进行研究，再将两种方法进行综合评价得出苜蓿品种的抗蚜性。然后当蚜虫在侵食苜蓿时，通过苜蓿品种外部形态特征、生理生化指标、电生理变化进行检测分析苜蓿品种的抗蚜机制，能够为不同地理环境种植苜蓿品种提供参考，确保该地区苜蓿的产量及质量，并大幅度降低了苜蓿的种植成本。
实现发明目的的技术方案如下：一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，包括苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种的田间抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种抗蚜综合评价、苜蓿品种的抗蚜机制研究。
其中，室内苜蓿品种抗蚜鉴定与评价用于在室内采用自然侵染法，在苜蓿品种的苗期进行接蚜控制试验，对苜蓿品种的室内抗蚜性能分级并评价。
其中，田间抗蚜鉴定与评价用于在田间蚜虫自然发生高峰期，对苜蓿品种的田间抗蚜性能分级并评价。
其中，苜蓿品种抗蚜综合评价用于将室内苜蓿品种的抗蚜结果与田间苜蓿品种的抗蚜结果综合比较，得到不同苜蓿品种的抗蚜等级。
其中，苜蓿品种的抗蚜机制研究用于苜蓿品种对蚜虫的抗性机制分析。
进一步的，苜蓿品种包括皇冠、WL343HQ、三得利、德宝、柏拉图、先行者、惊喜、中苜3号、甘农4号、皇后、MF4020、SR4030。
在本发明的一个实施例中，室内苜蓿品种抗蚜鉴定与评价包括以下步骤：室内苜蓿幼苗培育、蚜虫接种侵食苜蓿幼苗、终止蚜虫侵害苜蓿幼苗、苜蓿幼苗的继续培育、苜蓿品种的室内抗蚜分级及评价。
进一步的，苜蓿品种的室内抗蚜分级及评价步骤中，苜蓿幼苗的室内抗蚜分级，如下表所示：
| 抗蚜等级 | 抗性程度 | 苜蓿幼苗被害症状 |
| 1级 | 高抗(HR) | 植株高，具正常的三小叶 |
| 2级 | 抗(R) | 植株高度适中，三小叶小 |
| 3级 | 中抗(MR) | 植株高，三小叶小且皱缩 |
| 4级 | 感(S) | 植株矮，三小叶小，皱缩且通常黄萎变色 |
| 5级 | 高感(HS) | 植株死亡 |
苜蓿品种的室内抗蚜等级中，1级-3级为抗虫植株，4级-5级为感虫植株。
苜蓿品种的抗性植株计算公式为：抗性植株数＝∑(1级株数+2级株数+3级株数)/总株数×100％，苜蓿品种的室内抗蚜评价如下表所示：
| 等级 | 抗性程度 | 抗性植株数(％) |
| 1 | 高抗(HR) | ＞50％ |
| 2 | 抗虫(R) | 31％～50％ |
| 3 | 中抗(MR) | 16％～30％ |
| 4 | 低抗(LR) | 6％～15％ |
| 5 | 感虫(S) | ＜5％ |
苜蓿品种的室内抗蚜评价中，1级-4级为抗虫植株，5级为感虫植株。
在本发明的一个实施例中，田间抗蚜鉴定与评价中，包括以下步骤：田间试验小组设计、苜蓿品种田间种植、田间抗虫监测及记录、苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价。
进一步的，苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价步骤中，苜蓿品种的田间抗蚜性能分级方法为蚜量比值法，即，蚜量比值＝苜蓿品种试验各小组的蚜量/苜蓿品种试验各小组的平均蚜量；
苜蓿品种的田间抗蚜评价如下表所示：
在本发明的一个实施例中，苜蓿品种的抗蚜性如下表所示：
在本发明的一个实施例中，苜蓿品种的抗蚜机制研究包括对苜蓿叶片形态特征研究、蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究、蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究。
进一步的，苜蓿叶片形态特征研究包括苜蓿叶片绒毛密度检测及蜡质含量检测。蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究包括PAL酶活性测定、PPO酶活性测定、POD酶活性测定、SOD酶活性测定、CAT酶活性测定、营养物质含量测定。蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究包括蚜虫刺吸苜蓿全过程及不同部位的EPG波形分析。
与现有技术相比，本发明型的有益效果是：由于不同地区的苜蓿蚜虫种类及适用种植的苜蓿种类均较为明确，本发明的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，通过在室内及田间采取不同的方法对苜蓿品种的抗蚜性进行研究，再将两种方法进行综合评价得出苜蓿品种的抗蚜性。然后蚜虫在侵食苜蓿时，通过苜蓿品种外部形态特征、生理生化指标、电生理变化进行检测分析苜蓿品种的抗蚜机制，能够为不同地理环境种植苜蓿品种提供参考，确保该地区苜蓿的产量及质量，并大幅度降低了苜蓿的种植成本。
附图说明
图1为本发明苜蓿的抗虫等级鉴定方法的流程图。
图2为本发明的不同苜蓿品种的茸毛密度与苜蓿抗蚜的相关性。
图3本发明的不同苜蓿品种叶片蜡质含量与苜蓿抗蚜的相关性。
图4本发明的蚜虫刺探取食过程中的一个整体波形图。
图5本发明的蚜虫刺探过程中的路径波。
图6本发明的蚜虫在韧皮部(E1、E2波)和木质部(G波)的取食波形。
具体实施方式
下面结合附图所示的各实施方式对发明进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本发明的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
本实施例提供了一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，如图1所示，包括苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种的田间抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种抗蚜综合评价、苜蓿品种的抗蚜机制研究。其中，室内苜蓿品种抗蚜鉴定与评价用于在室内采用自然侵染法，在苜蓿品种的苗期进行接蚜控制试验，对苜蓿品种的室内抗蚜性能分级并评价。其中，田间抗蚜鉴定与评价用于在田间蚜虫自然发生高峰期，对苜蓿品种的田间抗蚜性能分级并评价。其中，苜蓿品种抗蚜综合评价用于将室内苜蓿品种的抗蚜结果与田间苜蓿品种的抗蚜结果综合比较，得到不同苜蓿品种的抗蚜等级。其中，苜蓿品种的抗蚜机制研究用于苜蓿品种对蚜虫的抗性机制分析。
以下，通过实施例1至实施例4分别对苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种的田间抗蚜鉴定与评价，苜蓿品种抗蚜综合评价、苜蓿品种的抗蚜机制研究分别进行说明。
实施例1：
苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价：在室内采用自然侵染法，在苜蓿品种的苗期进行接蚜控制试验，对苜蓿品种的室内抗蚜性能分级并评价。
苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价，具体包括以下步骤：室内苜蓿幼苗培育、蚜虫接种侵食苜蓿幼苗、终止蚜虫侵害苜蓿幼苗、苜蓿幼苗的继续培育、苜蓿品种的室内抗蚜分级及评价。
苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价，选用皇冠、WL343HQ、三得利、德宝、柏拉图、先行者、惊喜、中苜3号、甘农4号、皇后、MF4020、SR4030共12个苜蓿品种进行室内试验。
首先：将12个苜蓿品种在温室播种于深度不低于20cm的花盆中，每品种120盆，各品种间作隔离处置，出苗后1d进行间苗，每盆保留1株健壮幼苗，常规管理，不作任何处理。
其次，待苜蓿品种幼苗生长到3叶期时，采用自然侵染法将苜蓿蚜虫接到苜蓿叶片上，每株苗2～5头。接种后每一品种集中用网纱罩住，以防蚜虫逃走和外来天敌入侵。28d后，喷施杀虫剂终止蚜虫危害，继续培育并在喷药7d后，评估各个品种苜蓿植株的受害程度。
苜蓿幼苗的室内抗蚜分级，如下表所示：
| 抗蚜等级 | 抗性程度 | 苜蓿幼苗被害症状 |
| 1级 | 高抗(HR) | 植株高，具正常的三小叶 |
| 2级 | 抗(R) | 植株高度适中，三小叶小 |
| 3级 | 中抗(MR) | 植株高，三小叶小且皱缩 |
| 4级 | 感(S) | 植株矮，三小叶小，皱缩且通常黄萎变色 |
| 5级 | 高感(HS) | 植株死亡 |
苜蓿品种的室内抗蚜等级中，1级-3级为抗虫植株，4级-5级为感虫植株。
苜蓿品种的抗性植株计算公式为：抗性植株数＝∑(1级株数+2级株数+3级株数)/总株数×100％，苜蓿品种的室内抗蚜评价如下表所示：
| 等级 | 抗性程度 | 抗性植株数(％) |
| 1 | 高抗(HR) | ＞50％ |
| 2 | 抗虫(R) | 31％～50％ |
| 3 | 中抗(MR) | 16％～30％ |
| 4 | 低抗(LR) | 6％～15％ |
| 5 | 感虫(S) | ＜5％ |
苜蓿品种的室内抗蚜评价中，1级-4级为抗虫植株，5级为感虫植株。
分析：通过Excel 2010和DPS统计软件进行数据处理和多重比较分析(p＜0.05)进行分析，结果如下表所示：
结论：如表所示，供试12个苜蓿品种通过室内抗蚜鉴定与评价将其抗蚜特性分为3类。其中，三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030等5个品种为抗蚜品种，其健康植株所占比例在31％～50％之间；柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3号4个品种为中抗品种，其健康植株所占比例在16％～30％之间；惊喜、WL343HQ和德宝3个品种为低抗品种，健康植株所占比例在6％～15％之间。
实施例2：
本实施例是在田间进行田间抗蚜鉴定与评价，包括以下步骤：田间试验小组设计、苜蓿品种田间种植、田间抗虫监测及记录、苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价。
本实施例田间进行田间抗蚜鉴定与评价，选用皇冠、WL343HQ、三得利、德宝、柏拉图、先行者、惊喜、中苜3号、甘农4号、皇后、MF4020、SR4030共12个苜蓿品种进行室内试验。
首先，将上述12个苜蓿品种，按随机区组设计，每一品种重复3次，种植在苜蓿主栽地区试验地内。播种时间为每年7月15日之前，平均播种量1.5kg/亩，小区面积5m×7.5m，正常田间管理。
其次，在4月底至8月田间苜蓿蚜虫发生高峰期进行调查评价。方法为：每小区5点取样，每样点调查百枝条蚜虫的成虫和若虫数量。采用震落法，调查时用铺有白纸的28.5cm×38.5cm的铁盘，将枝条地上部放入盘内拍打，然后计算其内的蚜虫成若虫数量，虫量单位为：头/百枝条。
在本实施例中，在苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价步骤中，苜蓿品种的田间抗蚜性能分级方法为蚜量比值法，即，蚜量比值＝苜蓿品种试验各小组的蚜量/苜蓿品种试验各小组的平均蚜量；
苜蓿品种的田间抗蚜评价如下表所示：
分析：通过Excel 2010和DPS统计软件进行数据处理和多重比较分析(p＜0.05)进行分析，结果如下表所示：
结论：12个苜蓿品种田间抗蚜性差异显著，基本分为4类。其中，惊喜、WL343HQ和德宝为高感品种，其蚜量比值均大于1.25，并与其它品种间差异极显著；柏拉图、中苜3号和甘农4号为感蚜品种，其蚜量比值位于0.76～1.25之间；先行者为中抗品种，蚜量比值为0.51，位于0.51～0.75之间；SR4030、MF4020、皇冠、三得利和皇后5个品种为抗蚜品种，其蚜量比值0.26～0.50之间。
实施例3：
本实施例是对实施例1和实施例2的室内苜蓿品种的抗蚜结果与田间苜蓿品种的抗蚜结果进行综合评价，即苜蓿品种抗蚜综合评价，得到苜蓿品种的抗蚜性，如下表所示：
结论：室内鉴定结果与田间鉴定结果相符，害虫侵染寄主和定植需要一定的时间，室内鉴定中蚜虫侵染不同苜蓿品种的时间长达28d，田间鉴定方法是自然侵染过程，蚜虫定植稳定。通过室内和田间鉴定结果综合分析得知，供试的12个苜蓿品种中，惊喜、WL343HQ、德宝为感蚜品种，柏拉图、中苜3号、甘农4号、先行者为中抗品种，皇冠、三得利、皇后、SR4030和MF4020为抗蚜品种。
实施例4：
本实施例是对上述实施例1至实施例3的苜蓿品种的抗蚜机制进行说明。苜蓿品种的抗蚜机制研究包括对苜蓿叶片形态特征研究、蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究、蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究。
苜蓿品种抗蚜机制研究的方法：是通过人工接虫方式，在蚜虫侵食苜蓿幼苗的过程中进行试验。
1.对苜蓿叶片形态特征研究：供试虫源选用从试验地苜蓿田内采集发育健壮的蚜虫；苜蓿品种采用实施例1中的12中苜蓿；
1.1选用12个苜蓿品种播种于温室花盆中，每品种6盆，并设置保护行。测试绒毛密度及蜡质含量并记录。
绒毛密度的检测方法为：选择各品种苜蓿顶端完全展开叶下数第3片叶的相同部位(叶中脉基部1/3处)，用直径为5mm的打孔器切取叶片，在解剖镜下计数叶背茸毛，每品种取3个不同叶片的测定值，得出每平方厘米平均茸毛数。
蜡质含量的检测方法为：取各品种苜蓿取顶端完全展开叶片3g，用水洗净，有吸水纸吸干、剪碎，称取2g，放入40mL氯仿中浸泡1min，将溶液过滤到已知质量的小烧杯中，然后放入通风橱中，待使氯仿挥发完毕时，再次称烧杯质量，最后减去烧杯质量即得蜡含量。以1g鲜叶重计算蜡质含量，每品种重复6次。
绒毛密度及蜡质含量的结果采用Excel 2007进行整理，采用SAS 8.2软件进行分析。
1.2茸毛密度与抗蚜性关系
经分析知，抗蚜虫品种三得利、4020、皇后、皇冠和4030茸毛密度显著高于其他品种，叶片背面平均密度分别为：117.76±0.32根/cm2、108.03±0.12根/cm2、96.57±0.25根/cm2、96.61±0.09根/cm2和106.51±0.09根/cm2。中抗品种柏拉图、甘农四号、先行者、中苜3号，叶片背面茸毛密度为：71.98±0.12根/cm2、71.77±0.02根/cm2、63.95±0.11根/cm2、71.34±0.07根/cm2。低抗品种惊喜、WL343HQ和德宝茸毛密度显著低于其他品种，叶片背面平均密度分别为：55.82±0.06根/cm2、51.98±0.02根/cm2和56.65±0.08根/cm2。这说明苜蓿多毛品种可以阻碍蚜虫的刺吸胁迫为害。通过图2可得出，叶片中脉茸毛密度与苜蓿品种抗蚜能力呈强正相关(r2＝0.889)，回归方程为：Y＝1.482X+35.93。这说明茸毛密度越大，苜蓿品种抗蚜虫能力越强。
1.3蜡质含量与抗蚜性关系
经分析知，抗虫品种三得利叶片表面蜡质含量最高，为8.26±0.08mg/g，低抗品种惊喜含量最少，为2.51±1.15mg/g，前者是后者的3.29倍。4020的叶片蜡质含量为5.64±0.05mg/g，皇后的叶片蜡质含量为5.53±0.07mg/g，皇冠的叶片蜡质含量为4.55±0.05mg/g，4030的叶片蜡质含量为7.15±0.06mg/g，柏拉图的叶片蜡质含量为4.29±0.11mg/g，甘农四号的叶片蜡质含量为5.59±0.02mg/g，先行者的叶片蜡质含量为5.85±0.06mg/g，中苜3号的叶片蜡质含量为3.84±0.05mg/g，WL343HQ的叶片蜡质含量为3.84±0.05mg/g，德宝的叶片蜡质含量为2.85±0.08mg/g。由图3知，叶片表面蜡质含量与健康植株数所占比例呈中正相关(r2＝0.521)，即叶片蜡质含量越高苜蓿健康植株数越多，蚜虫越不选择取食，回归方程为：Y＝1.482X+35.93(r2＝0.521)。
2.蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究：试验虫源采自苜蓿草田自然发生的苜蓿蚜虫，苜蓿品种采用实施例1中的12中苜蓿。
将供试12个不同抗蚜性苜蓿品种在温室种于花盆(25cm×30cm)中，每品种6盆集中放置，品种间行距1m，常规管理，不作任何处理。出苗整齐后进行间苗，每盆保留20棵健壮苜蓿幼苗。于苜蓿苗30cm高时，采用大量蚜虫侵染幼苗法接种蚜虫进行试验，每盆接种100头蚜虫，将田间采回的健壮苜蓿蚜虫轻轻抖动于花盆中的白纸上，让其自然爬上苜蓿植株。接种后每一品种集中用网纱(1m×1m×1m)罩住，以防蚜虫逃走和外来天敌入侵。分别于接虫后3、7、10d剪取植株用于酶活性测定，以不接蚜为对照，每测定重复3次。
检测指标1：PAL酶活性测定、PPO酶活性测定、POD酶活性测定、SOD酶活性测定、CAT酶活性测定。其中，苜蓿品种的酶活性变化量为：酶活性变化量＝(接蚜后的酶活性-同期未接虫的酶活性)/同期未接蚜的酶活性；
检测指标2：营养物质含量测定，其中，苜蓿品种的营养物质含量变化为：营养物质含量变化量＝(接蚜后的含量-同期未接虫的含量)/同期未接蚜的含量。
分析方法：Excel2007进行数据统计，SAS 8.0软件进行方差分析
2.1PAL酶活性测定(苜蓿蚜虫为害后PAL活性变化)，结果如下表所示：
分析：12个苜蓿品种PAL酶活性比同期未接虫的对照升高，为害7d PAL酶活性最高，为害10d次之，为害3d最低。三得利、MF4020、皇后、SR4030及皇冠5个抗虫品种PAL酶活性变化量在3、7、10d均极显著高于惊喜、WL343HQ和德宝3个低抗品种(P<0.01)。三得利、MF4020、皇后、SR4030、皇冠等抗虫品种之间的酶活性变化量差异不显著，惊喜、WL343HQ、德宝等低抗品种之间的酶活性变化量差异也不显著。
蚜虫为害3d后，抗虫品种三得利PAL酶活性变化量极显著高于柏拉图、甘农4号、中苜3号、先行者4个中抗品种和惊喜、WL343HQ、德宝3个低抗品种(P<0.01)。抗虫品种MF4020、皇冠、SR4030的酶活性变化量与中抗品种柏拉图、甘农4号之间差异不显著，与中抗品种先行者、中苜3号差异极显著(P<0.01)。中抗品种柏拉图、甘农4号与低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝间的差异极显著(P<0.01)。中抗品种先行者、中苜3号与低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝间的差异不显著。7d后，抗虫品种三得利、皇后的酶变化量极显著高于中抗品种甘农4号、中苜3号和低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝(P<0.01)。中抗品种甘农4号与极显著低于5个抗品种和极显著高于3个低抗品种；中抗品种先行者与抗虫品种MF4020、皇冠、SR4030和中抗品种柏拉图、甘农4号差异极显著。在为害10d后，5个抗虫品种的PAL酶活性变化量极显著低于3个低抗品种(P<0.01)，但极显著高于中苜3号。其中抗虫品种三得利的PAL酶活性变化量在供试的12个品种中一直保持着较高的水平，而低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝的酶活性变化则是较低水平的。
2.2PPO酶活性测定(苜蓿蚜虫为害后不同苜蓿品种PPO活性变化)，结果如下表所示：
分析：12个苜蓿品种的PPO酶活性增加量随苜蓿蚜虫为害时间的延长呈下降趋势，在苜蓿蚜虫为害的不同时期PPO酶活性均较同期未接虫的对照高。5个抗虫品种在为害3、7、10d后酶活性变化量均极显著高于3个低抗品种(P<0.01)；4个中抗品种PPO酶活性变化量位于5个抗虫品种和3个低抗品种之间；抗虫品种三得利PPO酶活性变化量极显著高于其他品种，低抗品种WL343HQ、德宝PPO酶活性变化量极显著低于其他品种(P<0.01)。
苜蓿蚜虫为害3d后，抗虫品种三得利、MF4020、皇后、SR4030极显著高于其他品种(P<0.01)。为害7d后，抗虫品种三得利、MF4020、皇冠、SR4030极显著高于其他品种(P<0.01)。低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝的PPO酶活性变化极显著低于其他品种，差异不显著。为害10d后，各苜蓿品种的PPO酶活性变化量下降较快，降至苜蓿蚜虫为害后的最低值。抗虫品种三得利、皇后、皇冠与中抗品种柏拉图、甘农4号差异不显著，但极显著高于中抗品种先行者、中苜3号和3个低抗品种。其中抗虫品种三得利的PPO酶活性变化量在所有供试品种中一直保持较高的水平，而低抗品种WL343HQ、德宝的PPO酶活性变化量在所有供试品种中一直保持较低水平。
2.3POD酶活性测定(苜蓿蚜虫为害后POD活性变化)，结果如下表所示：
分析：12个苜蓿品种的POD酶活性增加量随苜蓿蚜虫为害时间的延长持续升高，为害10d后，POD升高量达到最大，7d次之，3d最低。在为害后的每个时期5个抗虫品种增加量均极显著高于3个低抗品种(P<0.01)。
苜蓿蚜虫为害3d后，柏拉图、甘农4号、中苜3号和先行者4个中抗品种POD酶活性变化量处于5个抗虫品种和3个低抗品种之间。低抗品种惊喜、WL343HQ极显著低于其他品种(P<0.01)。抗虫品种三得利、MF4020极显著高于其他品种(P<0.01)，抗虫品种三得利、MF4020与皇后差异不显著，但三者极显著高于其他品种，低抗品种惊喜与WL343HQ、德宝差异不显著，WL343HQ增加量为0.173极显著低于其他品种。在为害7d后，抗虫品种三得利、皇后和中抗品种柏拉图POD酶活性增加量极显著高于其他品种。抗虫品种MF4020、皇后、皇冠、SR4030间的POD酶活性变化量差异不显著，中抗品种甘农4号、先行者、中苜3号和低抗品种惊喜、WL343HQ、德宝间的差异极显著(P<0.01)，三得利增加量最大为0.640，惊喜增加量最小为0.444。为害10d后，抗虫品种三得利酶活性升高较其他品种快，极显著高于其他品种(P<0.01)。低抗品种德宝有酶变化量极显著低于其他品种(P<0.01)，三得利增加量最大为0.889，德宝增加量最小为0.759。
2.4SOD酶活性测定(苜蓿蚜虫为害后SOD活性变化)，结果如下表所示：
分析：苜蓿蚜虫为害后，12个苜蓿品种均比对照未接虫的SOD酶活性升高，为害7d后，酶活性升高量达最大，10d次之，3d最小。5个抗虫品种在为害3、7、10d后酶活性变化量均极显著高于3个低抗品种(P<0.01)；柏拉图、甘农4号、中苜3号、先行者4个中抗品种SOD酶活性增加量位于三得利、MF4020、皇后、SR4030、皇冠5个抗虫品种和惊喜、WL343HQ、德宝3个低抗品种之间；抗虫品种三得利SOD酶活性变化量极显著高于其他品种，3个低抗品种SOD酶活性变化量极显著低于其他品种，3个低抗品种间SOD酶活性增加量差异不显著。
苜蓿蚜虫为害3d后，5个抗虫品种与中抗品种柏拉图间差异不显著，它们极显著高于中抗品种甘农4号、先行者、中苜3号和3个低抗品种(P<0.01)，3个低抗品种间酶增加量差异不显著，抗虫品种三得利酶活性增加量为0.102，极显著高于其他品种，德宝增加量为0.058，极显著低于其他品种。为害7d后，5个抗虫品种间差异不显著，三得利增加量为0.212，惊喜增加量最低为0.151。柏拉图与甘农4号、先行者差异不显著，但极显著高于中苜3号和3个低抗品种(P<0.01)，3个低抗品种差异不显著。为害10d后，抗虫品种三得利、MF4020、皇冠极显著高于其他品种，柏拉图与甘农4号差异不显著，但两者极显著低于先行者、中苜3号，先行者与中苜3号间差异不显著，三得利增加量最高为0.167，WL343HQ增加量最低为0.088。
2.5CAT酶活性测定(苜蓿蚜虫为害后CAT活性变化)，结果如下表所示：
分析：12个苜蓿品种的CAT活性均比未接虫的对照品种下降，为害7d后下降迅速，为害10d次之，为害3d最小。苜蓿蚜虫为害10d后5个抗虫品种CAT酶活性下降量均极显著高于3个低抗品种(P<0.01)，4个中抗品种CAT酶活性变化量处于5个抗虫品种和3个低抗品种之间。
苜蓿蚜虫为害3d后，5个抗虫品种与柏拉图之间CAT酶活性变化差异不显著，3个低抗品种之间CAT酶活性变化差异不显著，抗虫品种皇冠下降最少为0.150，低抗品种惊喜下降最多为0.209。为害7d后，5个抗虫品种间酶变化量差异不显著，3个低抗品种间差异不显著，抗虫品种皇冠下降最少为0.306，低抗品种德宝下降最多为0.468。为害10d后，抗虫品种三得利、MF4020酶变化量极显著高于皇冠、SR4030，与皇后差异不显著，抗虫品种4020下降最少为0.150，低抗品种惊喜下降最多为0.312。柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3号4个中抗品种间CAT酶变化量差异不显著。惊喜、WL343HQ和德宝3个低抗品种间差异不显著。
2.6营养物质含量测定(可溶性糖含量变化)，结果如下表所示：
分析：供试苜蓿品种的可溶性糖含量变化量随着为害时间的延长呈现先下降后上升再下降趋势。为害3d、10d后，三得利、MF4020、皇后、SR4030、皇冠5个抗虫品种可溶性糖含量变化量极显著低于惊喜、WL343HQ、德宝3个低抗品种(P<0.01)。所有品种在苜蓿蚜虫为害3d后接虫的可溶性糖含量变化量较未接虫的对照低，MF4020下降率最大，为0.219，而德宝下降率最小，为0.141；为害7d后，接虫品种可溶糖含量较未接虫的对照高，惊喜可溶性糖含量变化量极显著低于三得利、MF4020、皇后、SR4030、柏拉图(P<0.01)与其他品种间差异不显著，低抗品种惊喜较同期未接虫上升0.179，与其他品种差异极显著；为害10d后，接虫三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030、柏拉图、先行者8个品种可溶糖含量较未接虫的对照低，中苜3号、惊喜、WL343HQ、德宝3个品种高于对照，抗虫品种柏拉图较对照下降0.140。
2.7营养物质含量测定(可溶性蛋白质含量变化)，结果如下表所示：
分析：苜蓿蚜虫为害3d、7d、10d后，所有品种均较同期未接虫对照可溶性蛋白质含量降低。为害3d后，抗虫品种SR4030可溶性蛋白质含量下降率极显著低于其他品种(P<0.01)，低抗品种WL343HQ可溶性蛋白质含量下降率极显著高于其他品种(P<0.01)，WL343HQ下降了0.019，极显著高于其他品种(P<0.01)，抗虫品种SR4030下降了0.165，极显著低于其他品种(P<0.01)。为害7d后，抗虫品种三得利、皇后和低抗品种WL343HQ显著高于其他品种，分别较对照下降了0.051、0.013、0.068。中抗品种中苜3号下降了0.233，极显著低于其他品种(P<0.01)。为害10d后，抗虫品种三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030分别下降了0.103、0.047、0.050、0.131、0.021，极显著高于其他品种(P<0.01)。
3.蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究包括蚜虫刺吸苜蓿全过程及不同部位的EPG波形分析。
3.1蚜虫刺吸苜蓿全过程的EPG波形分析：
选用6个不同抗蚜性苜蓿品种，分别是：抗蚜品种(MF4020)、中抗品种(柏拉图、BR4010、WL354HQ)、低抗品种(巨能牧歌37CR)、感蚜品种(WL343HQ)。将供试6个苜蓿品种在温室种于9×7cm塑料杯中，每品种20盆，每盆5株，每品种集中放置，常规管理，按需浇水。出苗后1d进行间苗，每盆保留1棵健壮的苜蓿幼苗，于苜蓿苗生长至6叶期用于试验。
从苜蓿草田采集发育健壮的优势种苜蓿蚜虫成虫。并将其放置在5℃的冰箱内冷藏，进行1h的饥饿处理后用于试验。
EPG的转换、记录与分析：采用DC-EPG GIGA-8d(荷兰)8通道昆虫刺探电位图谱记录仪，将蚜虫与EPG昆虫电极连接，昆虫电极是一段长2～3cm、直径18.5μm的金丝，末端用水溶性导电银胶粘在蚜虫前胸背板上。EPG植物电极直接插在苜蓿根茎的土壤中。整个记录系统置于法拉第金属屏蔽罩内，以防止外源声波的干扰。受试蚜虫饥饿处理1h后，于每天10∶00开始EPG记录。每头蚜虫的测定时间为5h，每一苜蓿品种取有效刺探取食蚜虫10头，即有效重复数10次进行统计。当蚜虫口针刺入苜蓿组织时，回路接通，电流经转换器转换为数字信号，再由Probe 3.4软件转化成波形图谱输出在电脑屏幕上保存。
数据处理：将连续记录的EPG数据按不同的行为波形进行分类统计，再经EPGStylet analyse 2015将波形图谱转化为相应的数据后，采用统计分析软件DPS13.01进行单因素方差分析，应用Duncan新复极差法进行品种间多重比较。
分析：苜蓿蚜虫刺吸取食不同苜蓿品种共产生8种EPG波形，以其取食苜蓿品种MF4020为例分析(图4至图6)，非刺探波(np波)表示蚜虫的爬行、休息等行为活动，路径波A波发生在刺探初始阶段，其持续时间一般不超10s，频率为5～15Hz，该波形表示蚜虫口针刚接触叶片表面，与水溶性唾液分泌有关；B波紧随其后，1个周期持续时间约5s，此时蚜虫口针刺破叶表皮，位于表皮与薄壁组织之间；C波的主要特征是各个波的频率和振幅差异较大，此时蚜虫口针在细胞壁组织间穿刺以寻找取食位点，时间由几秒至2h不等。pd波反映了口针刺破细胞膜时所测的膜内外电位差，分3个亚波段：pd-Ⅰpd-Ⅱ和pd-Ⅲ。E1波表示蚜虫口针到达筛管后分泌水溶性唾液的相关波形，持续时间较长；E2波持续时间较短。8种波形中，G波持续时间长，说明蚜虫在木质部吸食时间比较长，蚜虫在6种苜蓿品种的刺吸过程中非刺探总时间、pd波次数、E1波持续的总时间等存在显著差异(P<0.05)。
3.2蚜虫刺吸苜蓿不同部位的EPG波形分析，其结果如下表所示：
注：上表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同小写字母表示经Duncan新复极差法检验在P＜0.05水平差异显著。
3.2.1苜蓿蚜虫口针到达苜蓿品种韧皮部取食之前的刺探行为，由上表可知：苜蓿蚜虫在6个抗性不同苜蓿品种上开始至第一次到达韧皮部前的刺探次数差异显著(P<0.05)，苜蓿蚜虫在抗蚜品种MF4020上开始至第一次刺探所需时间与其它5个苜蓿品种间差异显著(P<0.05)，而其它5个品种间差异不显著(P>0.05)；5h监测过程中，苜蓿蚜虫在低抗品种巨能牧歌37CR上C波的总持续时间最长，中抗品种柏拉图次之，抗性品种MF4020最短，并与低抗品种巨能牧歌37CR和中抗品种柏拉图差异显著(P<0.05)；抗性品种MF4020的pd波次数最少，中抗品种BR4010为中抗品种柏拉图的1倍。
3.2.2苜蓿蚜虫口针在苜蓿品种木质部的刺探行为，由上表可知：苜蓿蚜虫在6个苜蓿品种上G波总时间差异显著(P<0.05)，在中抗品种柏拉图上G波持续时间最长，为108.18±6.84min，表明在中抗品种柏拉图上苜蓿蚜虫花费在木质部主动摄取汁液的时间大于其它5个品种。
3.2.3苜蓿蚜虫口针在韧皮部的刺探行为，由上表可知：苜蓿蚜虫在抗蚜品种MF4020、中抗品种柏拉图、BR4010、WL354HQ及低抗品种巨能牧歌37CR和感蚜品种WL343HQ、6个苜蓿品种韧皮部刺探取食过程中，E1波持续的总时间及E1占总E波比例(％)分别为36.83min、99.23％，16.7min、49.8％，14.6min、42.4％，11.0min、25.9％，1.50min、9.99％，7.97min、19.9％，均差异显著(P<0.05)，在抗蚜品种MF4020 E1波持续的总时间最长，为36.83min，与中抗品种BR4010、WL354HQ、柏拉图、低抗品种巨能牧歌37CR和感蚜品种WL343HQ差异显著(P<0.05)，中抗品种与低抗品种和感蚜品种间差异也显著(P<0.05)，同一抗性级别内品种间也存在一定差异，如三个中抗品种中，柏拉图和BR4010之间差异不显著(P>0.05)，但其均与WL354HQ差异显著(P<0.05)，低抗品种巨能牧歌37CR和感蚜WL343HQ间也差异显著(P<0.05)；表明苜蓿蚜虫在抗性品种MF4020韧皮部刺吸过程中需要多次、长时间分泌水溶性唾液，说明苜蓿品种抗性越强，E1波越长。苜蓿蚜虫在6个不同抗性苜蓿品种的第1次韧皮部持续取食时间也存在显著差异，抗蚜品种MF4020在第1次韧皮部持续取食时间最短，为6.44min，与中抗品种BR4010、WL354HQ、柏拉图、低抗品种巨能牧歌37CR和感蚜品种WL343HQ差异显著(P<0.05)。苜蓿蚜虫在抗蚜品种MF4020上E2波持续的总时间显著短于其它5个品种，表明苜蓿蚜虫在抗性品种MF4020上用较短时间在韧皮部取食，说明其在韧皮部存在对苜蓿蚜虫的取食阻碍因素。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：包括苜蓿品种的室内抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种的田间抗蚜鉴定与评价、苜蓿品种抗蚜综合评价、苜蓿品种的抗蚜机制研究；
其中，所述室内苜蓿品种抗蚜鉴定与评价用于在室内采用自然侵染法，在苜蓿品种的苗期进行接蚜控制试验，对苜蓿品种的室内抗蚜性能分级并评价；
其中，所述田间抗蚜鉴定与评价用于在田间蚜虫自然发生高峰期，对苜蓿品种的田间抗蚜性能分级并评价；
其中，所述苜蓿品种抗蚜综合评价用于将室内苜蓿品种的抗蚜结果与田间苜蓿品种的抗蚜结果综合比较，得到不同苜蓿品种的抗蚜等级；
其中，所述苜蓿品种的抗蚜机制研究用于苜蓿品种对蚜虫的抗性机制分析。
2.根据权利要求1所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿品种包括皇冠、WL343HQ、三得利、德宝、柏拉图、先行者、惊喜、中苜3号、甘农4号、皇后、MF4020、SR4030。
3.根据权利要求1所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述室内苜蓿品种抗蚜鉴定与评价包括以下步骤：室内苜蓿幼苗培育、蚜虫接种侵食苜蓿幼苗、终止蚜虫侵害苜蓿幼苗、苜蓿幼苗的继续培育、苜蓿品种的室内抗蚜分级及评价。
4.根据权利要求3所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿品种的室内抗蚜分级及评价步骤中，苜蓿幼苗的室内抗蚜分级为：
苜蓿品种的室内抗蚜等级中，1级-3级为抗虫植株，4级-5级为感虫植株；
苜蓿品种的抗性植株计算公式为：抗性植株数＝∑(1级株数+2级株数+3级株数)/总株数×100％，苜蓿品种的室内抗蚜评价为：
苜蓿品种的室内抗蚜评价中，1级-4级为抗虫植株，5级为感虫植株。
5.根据权利要求4所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述田间抗蚜鉴定与评价中，包括以下步骤：田间试验小组设计、苜蓿品种田间种植、田间抗虫监测及记录、苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价。
6.根据权利要求5所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿品种的田间抗蚜性能分级及评价步骤中，苜蓿品种的田间抗蚜性能分级方法为蚜量比值法，即，蚜量比值＝苜蓿品种试验各小组的蚜量/苜蓿品种试验各小组的平均蚜量；
苜蓿品种的田间抗蚜评价为：
7.根据权利要求5或6所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿品种的抗蚜性为：
8.根据权利要求1所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿品种的抗蚜机制研究包括对苜蓿叶片形态特征研究、蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究、蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究。
9.根据权利要求8所述的苜蓿品种抗蚜等级鉴定与评价方法，其特征在于：所述苜蓿叶片形态特征研究包括苜蓿叶片绒毛密度检测及蜡质含量检测；
所述蚜虫侵食苜蓿后苜蓿生理生化指标研究包括PAL酶活性测定、PPO酶活性测定、POD酶活性测定、SOD酶活性测定、CAT酶活性测定、营养物质含量测定；
所述蚜虫刺吸苜蓿时苜蓿电生理变化研究包括蚜虫刺吸苜蓿全过程及不同部位的EPG波形分析。
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