CN111096303B - 一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，通过利用电子穿刺图谱技术(Electropenetrography/the Electrical Penetration Graph，EPG)来对蚜虫在不同品种油菜上的取食行为进行监测，并在这一基础上，分析出不同品种油菜之间的抗蚜传毒性大小。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法。
背景技术
油菜属十字花科芸薹属，目前生产上栽培的有三种类型：甘蓝型、芥菜型和白菜型油菜。油菜是仅次于谷类作物的世界第二大食物能源，是世界上大豆和棉花之后第三个主要的可食用油资源。
然而，油菜生长期常常受到病虫害的影响，制约产量的增加。大量的病虫害侵袭，造成油菜大面积毁种和缺苗断垄，严重影响油菜生长。多种蚜虫还可以非持久传播的方式传播TuMV病毒。我国10省、市油菜病害调查表明，病毒病发生严重的武汉、长沙、成都和合肥等城市郊区，发病率在30％以上，其中 TuMV占80％以上。已知植物病毒诱导植物挥发物释放的特殊变化以及改变植物的生理和形态学，而植物释放的视觉和嗅觉线索又能改变蚜虫的行为来区分未感染或感染病毒的植株。当蚜虫着陆并开始探测后，受感染的植株中存在的味觉和营养线索可能改变蚜虫定殖和繁殖的行为和能力。以非持久性方式传播的病毒，通过非定殖蚜虫在植物表面组织中的短暂穿刺细胞来获得并携带。病毒-植物，植物-载体以及病毒-载体的互作在生物学上是复杂的，一旦阐明，就会为减少病害影响的创新型防治策略提供新的观点。此外，对这些互作关系的研究或许能促进长期而有潜力的病害防治方法的发展，也为植物病毒和昆虫载体防治打开新的大门。
蚜传病毒的防治目标是载体-植物互作，大多依赖于检测和抑制载体，从而减少病毒爆发的频率和严重程度。但到目前为止，抗虫、抗病毒病油菜品种还没有商业化。农民倚赖杀虫剂来抑制蚜虫，但选择压导致蚜虫已经对许多杀虫剂产生了抗性。此外，杀虫剂对环境的消极影响表明替代的防治策略和培育抗性品种是急需的。而培育抗性品种，首先要定位植株上的抗性因子，才能找到着手点。了解蚜虫探测和取食的行为对于研究植株对蚜虫的适应性，探索病毒对蚜虫取食行为的引导性有着重要的意义。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，通过利用电子穿刺图谱技术(Electropenetrography/the ElectricalPenetration Graph，EPG)来对蚜虫在不同品种油菜上的取食行为进行监测，并在这一基础上，分析出不同品种油菜之间的抗蚜传毒性大小。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，包括如下步骤：
(1)利用电子穿刺图谱技术EPG进行甘蓝蚜对油菜植株取食行为的监测，针对甘蓝蚜在不同品种的油菜植株上的取食行为，获得第一组EPG参数，或者针对甘蓝蚜在不同品种的病毒源油菜植株上的取食行为，获得第二组EPG参数，或者针对携带病毒的甘蓝蚜在不同品种的油菜植株上的取食行为，获得第三组 EPG参数；
(2)在第一组EPG参数中，若对应于蚜虫在韧皮部取食行为的EPG参数中，与E1波相关的EPG参数越大，与E2波相关的EPG参数越小，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越强；或者在第二组EPG参数中，对应于蚜虫在叶表、叶肉取食行为的EPG参数中，若探测的总时间越少，非探测的总时间越大，开始到第一个E波的时间越短，pd波的个数和pd波的总持续期越大，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越弱；或者在第三组EPG参数中，对应于蚜虫在叶表、叶肉和韧皮部取食行为的EPG参数中，若探测的总时间越少，开始到第一个E波的时间时间越短，但每次探测中pd波的平均发生次数越多，E1波的个数也愈多，持久E2波(E2>10min)占E2波的比例越少，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越弱。
优选地，所述EPG参数包括总览性参数、叶表参数、叶肉参数和韧皮部参数；其中，
所述总览性参数和叶表参数包括：第一个E波之前非探测的持续期、开始到第一个E波的时间、探测的次数、探测的总时间、非探测的总时间、非韧皮部阶段的总持续期、开始到第一个E2波的时间、到第一次探测的时间；
所述叶肉参数包括：第一个E1波之前的探测次数、每次探测中pd波的平均发生次数、短暂探测(C波<3minutes)的次数、pd波的个数、pd波的总持续期、 C波的总持续期、从探测开始到第一个E波的时间、从第一次探测开始到第一个pd波的时间、C波所占的百分比；
所述韧皮部参数包括：E1波的个数、E1波占韧皮部阶段的百分比、后面接第一个持久E2波(>10min)的E1波的持续期、后面接持久E2波(>10min)的E1 波的总持续期、潜在的E2波指数、E波的总持续期、E1波的总持续期、E2波的总持续期、最长E2波的持续时间、持久E2波(>10min)占E2波的比例、E1 波占测试时间的百分比、E2波占测试时间的百分比。
优选地，所述病毒源油菜植株为感染TuMV病毒的油菜植株；所述携带病毒的甘蓝蚜为携带TuMV病毒的甘蓝蚜。
优选地，在第一组EPG参数中，若对应于蚜虫在韧皮部取食行为的EPG参数中，持久E2波(>10min)占E2波的比例越低，后面接第一个持久E2波的E1 波的持续期越长，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越强。
优选地，所述“利用电子穿刺图谱技术EPG进行甘蓝蚜对油菜植株取食行为进行监测”具体包括如下步骤：
(11)将甘蓝蚜用导电银胶将金丝一端固定于背部后，放置于繁育蚜虫的植株上过夜适应；同时选择油菜植株作为测试对象；
(12)将金丝的另外一端接到DC-EPG系统上，同时将植物电极插入植株土壤中，再将饥饿处理后且连接金丝的甘蓝蚜置于油菜植株上，在法拉第笼中进行试验；
当甘蓝蚜的口针刺入植物组织时，由甘蓝蚜口针为微电极和植物根部土壤为参比电极构成的回路接通，获取甘蓝蚜在油菜植株上对应至少6h取食行为产生的一系列电信号；
(13)将上述电信号经DC-EPG系统放大处理后，经过转化形成数字信号，以波形数据的形式进行记录，即为对应蚜虫在油菜上取食行为的EPG波形；
(14)将上述EPG波形进行类比、分析以及认定，对EPG波形包含的非刺探波np、路径波C、细胞内穿刺波pd、唾液分泌波E1、取食波E2对应的时间、次数进行统计、筛选，获得EPG参数，由此实现对甘蓝蚜在油菜上取食行为的监测。
优选地，所述甘蓝蚜为新羽化2天的无翅甘蓝蚜；所述油菜植株为发育到4 叶期的油菜植株；所述饥饿处理的时间优选为1h。
优选地，所述DC-EPG系统为荷兰Wageningen University生产的Giga4型号的4通道的DC-EPG系统；优选地，所述DC-EPG系统的一个通道只能连接一根金丝，一根金丝也只能连接一头甘蓝蚜。
优选地，所述试验在室内、恒定光照以及25±1℃的温度下进行；优选地，试验过程中，每株油菜植株与每头甘蓝蚜仅用于1次试验，至少有20次有效重复试验。
与现有同类检测方法相比，本发明具有以下优点：
(1)利用刺探电位图谱技术实现对不同品种油菜抗蚜传毒性的鉴定，可直接以不同品种油菜植株为测定对象，不用对植株进行其他处理。
(2)不仅克服了传统鉴定油菜抗蚜传毒的方法所需的时间周期长、结果不稳定等缺点，还可以定位抗虫因子并了解病毒对蚜虫取食行为的引导，为接下来的抗病虫机理方面的研究奠定基础。
附图说明
图1为甘蓝蚜在秦优10上取食对应的EPG波形(pd波和E波)展示；
图2亦为甘蓝蚜在秦优10上取食对应的EPG波形(pd波和G波)展示；
图3为甘蓝蚜在新油17和浙平4两个油菜品种上叶肉参数的柱状图；
图4为甘蓝蚜在新油17和浙平4两个油菜品种上韧皮部参数的柱状图。
具体实施方式
实施例1
甘蓝蚜在油菜上取食行为的EPG监测：
(1)试验昆虫和油菜品种的准备
甘蓝蚜收集于浙江农科院蔬菜研究所种植油菜的温室中，在甘蓝Brassicaoleracea var.capitata L.上饲养超过一年。室内温度25±1℃，75±5％RH，16:8 (L:D)光周期下饲养；收集最近两天羽化的无翅成虫用于实验。
油菜品种为安徽省农科院植物育种实验室提供的秦优10。植株种植于13cm 直径的塑料花盆中，土壤为泥煤苔，蛭石，有机肥(N+P2O5+K2O≥2％，organic matter≥40％，Zhongnuo，Huaian，Jiangsu，China)和珍珠岩按照10:10:10:1的比例配成的混合物。植株置于25±1℃,75±5％RH和12:12(L:D)光周期下，常规浇水，但不再额外施肥。发育到4叶期的油菜植株用于实验。
(2)预处理蚜虫用于EPG测定
用水溶性的电导银胶(Electrolube，Swadlincote，Derbyshire，The UnitedKingdom)将一根长2cm，直径18μm的金丝轻轻地粘附到新羽化的无翅蚜成虫的背部。固定后，蚜虫被放回繁育的植株上过夜。第二天早上的8点半开始，每头蚜虫饥饿1小时后，用于EPG试验。
(3)监测蚜虫取食行为的EPG试验
使用Tjallingii(1988)修正的EPG技术监测蚜虫行为。原理:将蚜虫及其取食的植物接入同一电路，蚜虫的口针作为电极，当口针刺破植物时电路闭合形成回路。在蚜虫取食过程中，蚜虫本身的电阻以及口针所在植物组织或细胞的电位都会发生变化。以时间为横坐标,测量电位Vi为纵坐标输出的波形图就是 EPG的波形记录。
将蚜虫电极利用金丝连接到4通道的DC-EPG系统(Giga-4；EPG Systems，Wageningen，The Netherlands)上，使用PROBE 3.5(hardware and software from EPG-Systems，Wageningen，The Netherlands)记录EPG输出的结果。在法拉第笼中，将饥饿处理后的蚜虫快速放到盆栽发育到4叶期的油菜植株成熟叶片的下表面中脉附近，将植物电极插入土壤中。当蚜虫口针刺入植物组织时，整个回路接通，回路电流经生物电流放大器放大后在输出端输出一系列不同的电流信号。该系统可以同时在4棵分开的植株上检测4头蚜虫的取食行为。每次记录中蚜虫和植株只被使用一次。根据我们的预备实验，每次记录持续6h，每个处理进行20次重复，整个实验在室内恒定光照和25±1℃下进行。
(4)EPG试验的数据记录
EPG波形通过口针在植株中的位置来定义，复杂的口针行为如表1所示。波形以可区分的形式被分组，功能上相关的行为主要分成四个行为阶段：叶表，表皮-叶肉，叶肉以及韧皮部阶段。波形解释如下：(i)非探测(np波形：口针在植株外部)；(ii)路径期(C波形：包括穿刺，唾液分泌以及其它在叶肉中的行为；pd波形：电势降，意味着路径期间的细胞内穿刺)；(iii)韧皮部阶段(E波形：包括E1波形代表着韧皮部筛管分子中的唾液分泌以及E2波形代表着韧皮部摄食)(Tjallingii,1986；Pelletier and Giguere,2009；He et al.,2013)。
EPG特征参数由A/D card(DI-710format，Dataq Instruments Incorporated，The United States of America)记录。电流信号经Stylet+软件转换为数字信号保存在电脑硬盘上，再用Probe 2.0软件转化成波形图像输出在电脑屏幕上供判读、分析用。
(5)分析结果
经过我们的预实验，分析后发现与甘蓝蚜在油菜上取食相关的参数主要有 93个，就该93个参数对甘蓝蚜在秦优10上的取食行为进行研究，结果如下表 1所示
表1甘蓝蚜在秦优10上的取食行为EPG参数
由表1可见，有些波形在我们所测试的时间内并未测试到，但大多数波形都存在，根据不同的实验设计及实验目的，波形的出现可能会不同，但基本都在以上的93个参数中。部分波形图如图1(时间为横坐标，测量电位Vi为纵坐标)所示：
图1、图2中，序号1对应的波形图为整体波形；序号2为pd波；序号3为 pd波；序号4为pd波加E波；序号5为E1+E2波；序号6为E2波；序号7为完整probe前段；序号8为pd波加E波；序号9为G波；序号10为加大的G 波。
由上表1可知，甘蓝蚜在秦优10上出现了典型的蚜虫取食波，也即甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为可以通过EPG技术很好的反映出来，而且不同组织部位蚜虫所具有的不同行为特征对于详细了解蚜虫的取食过程非常重要。
经过多次的预备实验，我们得出了上述提及的各项测试条件，用来测定甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为EPG参数是可行的。比如，测试时间，我们发现连续测试6h对于了解甘蓝蚜在油菜植株上的取食行为就已足够，也就是说6h 是甘蓝蚜在油菜植株上取食的一个循环，更多的测试时间对结果没有明显的影响，反而会造成时间和精力的浪费。在进行EPG研究之前，蚜虫饥饿1h，可以加快EPG的开始进程，由于后续的实验是在相同条件下的比对，所以饥饿1h 依然可以很好的辨别叶表的抗性水平。相反，如果不进行饥饿处理，蚜虫可能因为饱足感，迟迟不进行探测，不仅浪费时间而且还会造成叶表存在抗性的假象。我们还对119个与蚜虫相关的EPG参数进一步的筛选，选出其中的93个参数，与甘蓝蚜在油菜上的取食行为相关性较大。根据不同的实验目的，可以从这93个参数中继续选择相关性更强的参数进行研究，以减少数据处理的强度，提高数据分析的精准度。但同时要注意，因个体的差异，要保证足够的重复次数，以精确处理数据。
实施例2
利用EPG技术鉴定不同油菜品种的抗蚜传毒性
(1)试验昆虫和油菜品种的准备
甘蓝蚜收集于浙江农科院蔬菜研究所种植油菜的温室中，在甘蓝Brassicaoleracea var.capitata L.上饲养超过一年。室内温度25±1℃，75±5％RH，16:8 (L:D)光周期下饲养；为了避免甘蓝蚜对易感油菜品种的行为偏好性，将甘蓝蚜种群在甘蓝上进行饲养续代。实验中使用的所有蚜虫均来自单头孤雌生殖的无翅蚜新建立的甘蓝蚜种群。收集最近两天羽化的无翅成虫用于实验。
油菜品种为安徽省农科院油料作物育种实验室提供的两个油菜Brassica napusvar.napus L.品种：新油17，浙平4。两个品种的油菜植株种植于13cm直径的塑料花盆中，土壤为泥煤苔，蛭石，有机肥(N+P2O5+K2O≥2％，organic matter ≥40％，Zhongnuo，Huaian，Jiangsu，China)和珍珠岩按照10:10:10:1的比例配成的混合物。植株置于25±1℃，75±5％RH和12:12(L:D)光周期下，常规浇水，但不再额外施肥。发育到4叶期的油菜植株用于实验。
(2)TuMV病毒及获毒植物和获毒蚜虫的准备
TuMV病毒由安徽农科院烟草所提供，为实验室长期保存的病毒株系。以 CaCl2冷冻干燥法保存于-80℃冰箱中待用。
用作病毒源的植株，使用接种体组织机械法接种于子叶期。接种后，病毒源植株种植在无蚜虫的温室中，直到4片真叶期。相同发育阶段的模拟接种的油菜植株(仅使用蒸馏水摩擦)被用作非感染对照。接种过程中所用一切器具和物品,包括栽培油菜的土壤、盆钵均经高压蒸气灭菌。
蚜虫经饥饿处理2小时后，放在患病的植株上经历3h的获取期。然后挑移至健株上进行EPG测定。测定完成后，对蚜虫及测试完的植株进行TuMV病毒检测。蚜虫和植株都没有测到病毒的认为蚜虫未获毒或已丢失病毒，丢弃该数据。
(3)监测蚜虫取食行为的EPG试验
无论是携带还是未携带病毒的蚜虫预处理的步骤同前述实施例1，将每头蚜虫在实验前饥饿1h，未携带病毒的蚜虫持续在病毒源植株和非感染植株上进行口针穿刺电位实验(同前述实施例1)，获得两组EPG记录；携带病毒的蚜虫持续在非感染植株上进行口针穿刺电位实验(同前述实施例1-2)，获得另一组 EPG记录，记录完成后，植株进行TuMV病毒检测，被蚜虫取食的植株中没有感染TuMV病毒的植株数据被放弃(采用芜菁花叶病毒酶联免疫分析试剂盒测定是否接毒成功)。
(4)EPG试验的数据记录
EPG波形通过口针在植株中的位置来定义，复杂的口针行为如表2所示。波形以可区分的形式被分组，功能上相关的行为主要分成四个行为阶段：叶表，表皮-叶肉，叶肉以及韧皮部阶段。波形解释如下：(i)非探测(np波形：口针在植株外部)；(ii)路径期(C波形：包括穿刺，唾液分泌以及其它在叶肉中的行为；pd波形：电势降，意味着路径期间的细胞内穿刺)；(iii)韧皮部阶段(E波形：包括E1波形代表着韧皮部筛管分子中的唾液分泌以及E2波形代表着韧皮部摄食)(Tjallingii,1986；Pelletier and Giguere,2009；He et al.,2013)。
EPG特征参数由A/D card(DI-710format，Dataq Instruments Incorporated，The United States of America)记录。电流信号经Stylet+软件转换为数字信号保存在电脑硬盘上，再用Probe 2.0软件转化成波形图像输出在电脑屏幕上供判读、分析用(Tjallingii,1988)。使用SAS 9.2软件(SAS Institute Inc.2008)进行数据统计分析，数据间的比较使用单因素方差分析中的LSD方法。时间类型数据在分析前进行自然对数转换，其中数据为0的，加1后再进行转化；频次数据在分析前进行平方根转化；百分比数据在分析前进行反正先平方根转化。两个处理间的比较使用Student t-test(Gaussian variables)或者Mann-Whitney U test(for non-Gaussian variables)。
(5)分析结果
在实施例1研究的基础上，通过相关性和主成分分析，继续筛选了与抗蚜性鉴定相关的29个EPG参数(参照表2)，就该29个参数对甘蓝蚜在新油17，浙平4的取食行为进行研究，基于各EPG参数与抗性因子在植物特异组织中的关系与实际波形，甘蓝蚜在油菜上取食相关的三组EPG参数可以分为总览性参数、叶表参数、叶肉参数以及与韧皮部参数几类。结果如下表2所示：
表2不同品种之间抗蚜传毒性鉴定的相关性最强的EPG参数
结合EPG参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在新油17，浙平4两个油菜品种上的总览性和叶表参数，结果如下表3所示：
表3甘蓝蚜在2个油菜品种上的总览性和叶表参数
注1：数字后的*代表两个品种上的对照值之间的差异显著。#代表植株感染后与对照值相比存在显著的差异。^代表蚜虫携带病毒后与对照未携带相比存在显著差异。
注2：“对照”为未携带病毒的蚜虫在非感染植株上获取的关于取食行为的 EPG参数；“植株感染”为未携带病毒的蚜虫在病毒源植株上获取的关于取食行为的EPG参数；“蚜虫携带”为携带病毒的蚜虫在非感染植株上获取的关于取食行为的EPG参数。
如表7所示，与浙平4相比，蚜虫在新油17上探测的时间(s_Pr探测的总时间)更短，开始第一次探测的时间(t_1Pr到第一次探测的时间)更长，意味着新油17叶表对蚜虫存在一定的阻碍性。
与对照相比，蚜虫在感染病毒的新油17上每次探测的时间(s_Pr探测的总时间与n_Pr探测的次数的比值)显著减少，非探测时间(s_np非探测的总时间) 延长，韧皮部之前花费的时间(t_1Erec从EPG开始到第一个E的时间)缩短。开始第一次穿刺的时间(t_1Pr到第一次探测的时间)也显著缩短。而在浙平4 上，植株感染病毒后，蚜虫探测的时间(s_Pr探测的总时间)减少，韧皮部之前的非探测时间缩短(s_np.1E第一个E之前非探测的持续期)，韧皮部之前所花费的时间(t_1Erec从EPG开始到第一个E的时间)也缩短。
蚜虫携带病毒后，与对照相比，在新油17上，蚜虫探测时间(s_Pr探测的总时间)减少，韧皮部之前需要的时间(t_1Erec从EPG开始到第一个E的时间) 减少。在浙平4上，携带病毒的蚜虫探测时间(s_Pr探测的总时间)减少，非探测时间(s_np非探测的总时间)延长，韧皮部之前花费的时间(t_1Erec从EPG 开始到第一个E的时间)减少。
结合EPG参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在新油17，浙平4两个油菜品种上的叶肉参数，结果如下图3所示：
注1：*代表两个品种上的对照值之间的差异显著。#代表植株感染后与对照值相比存在显著的差异。^代表蚜虫携带病毒后与对照未携带相比存在显著差异。
注2：白色填充的柱状图为“对照”，即为未携带病毒的蚜虫在非感染植株上获取的关于取食行为的EPG参数；斜杠填充的柱状图为“植株感染”，即为未携带病毒的蚜虫在病毒源植株上获取的关于取食行为的EPG参数；黑色填充的柱状图为“蚜虫携带”，即为携带病毒的蚜虫在非感染植株上获取的关于取食行为的EPG参数。
由图3可知，与新油17相比，蚜虫在浙平4上每次探测中的细胞穿刺频率 (n_pd/n_Pr每次探测中pd波的平均发生次数)显著减少，探测开始后到第一次细胞穿刺的时间(t_1C.1pd从第一次探测开始到第一个pd的时间)也显著缩短，但路径期的总时间(s_C C波的总持续期)显著延长。
植株感染病毒后，与对照相比，蚜虫在新油17上短暂探测的次数(n_bPr 短暂探测的次数)显著增多，细胞穿刺的频率和时间(n_pd pd波的个数、s_pd pd 波的总持续期)增加，探测开始后韧皮部之前的时间(t_1EinPr从探测开始到第一个E的时间)显著缩短，开始探测后到第一次细胞穿刺的时间(t_1C.1pd从第一次探测开始到第一个pd)的时间也显著缩短。而在浙平4上，与对照相比，蚜虫穿刺细胞的频率(n_pd pd波的个数)增加，探测开始后到第一次韧皮部接触之间的时间(t_1EinPr从探测开始到第一个E的时间)缩短，探测开始后第一次细胞穿刺的时间(t_1C.1pd从第一次探测开始到第一个pd)缩短。
蚜虫携带病毒后，与对照相比，蚜虫在新油17上穿刺细胞的频率和时间 (n_pd pd波的个数、s_pd pd波的总持续期)显著增加，探测开始后到韧皮部接触之前的时间(t_1EinPr从探测开始到第一个E的时间)显著缩短，韧皮部之前的探测次数(n_Pr_1E1第一个E1之前的探测次数)减少，探测开始后到第一次细胞穿刺的时间(t_1C.1pd从第一次探测开始到第一个pd)显著缩短。在浙平4上，蚜虫穿刺细胞的频率和时间(n_pd pd波的个数、s_pdpd波的总持续期)均增加，每次探测中的细胞穿刺频率(n_pd/n_Pr每次探测中pd波的平均发生次数)增加，探测开始后韧皮部之前的时间(t_1EinPr从探测开始到第一个E的时间)显著缩短，总路径期(s_C C波的总持续期)显著缩短。
结合EPG参数与植物抗性因子之间的相关性，记录并分析甘蓝蚜在新油17，浙平4两个油菜品种上的韧皮部参数，结果如下图4所示：
注1：标准误上的相同小写字母代表差异不显著，P＝0.05。
注2：白色填充的柱状图、斜杠填充的柱状图、黑色填充的柱状图的指代和图2相同。
如图4所示，蚜虫在浙平4上取食时长的比例(％sE2/E2,持久E2占E2的比例％E2>10min)显著低于新油17，第一次取食前的唾液分泌 (d_E1followedby1sE2,后面接第一个持久E2的E1波的持续期)显著多于新油 17。
植株感染病毒后，与对照相比，蚜虫在新油17上，唾液分泌的频率(n_E1 E1 的个数)显著增加，唾液分泌期(s_E1 E1的总持续期)延长，唾液分泌所占的比重(％_E1/E12 E1占韧皮部阶段的百分比)增加，最长取食时间(s_longestE2 最长E2的持续时间)缩短，取食所占的比重(％sE2/E2持久E2占E2的比例) 降低，取食前的唾液分泌减少。在浙平4上，蚜虫唾液分泌的频率(n_E1 E1的个数)增加，取食占比(％sE2/E2持久E2占E2的比例)减少，取食前的唾液分泌也减少。
蚜虫携带病毒后，与对照相比，新油17上唾液分泌频率和时间(n_E1 E1的个数，s_E1 E1的总持续期)增加，唾液分泌所占的比重(％_E1/E12 E1占韧皮部阶段的百分比)增加，最长取食时间(s_longestE2最长E2的持续时间)减少，取食时间所占的比重(％sE2/E2,持久E2占E2的比例)也减少，但第一次取食前的唾液分泌d_E1followedby1sE2,后面接第一个持久E2的E1波)也减少。在浙平 4上，唾液分泌的频率(n_E1 E1的个数)增加，取食比重(％sE2/E2,持久E2占E2 的比例)降低，第一次取食之前的唾液分泌(d_E1followedby1sE2,后面接第一个持久E2的E1波)的持续期减少。
由上表3和图3、图4可知，新油17的叶表相较于浙平4对蚜虫有一定的阻碍性，但叶肉和韧皮部均是浙平4对蚜虫有阻碍。总的来说，浙平4对蚜虫的抗性更强。
然而，病毒感染植株后，相较于对照，蚜虫探测时间(s_Pr探测的总时间) 减少，韧皮部之前花费的时间(t_1Erec从EPG开始到第一个E的时间)缩短，穿刺细胞的频率和时间(n_pd pd波的个数；s_pd pd波的总持续期)都增加，说明病毒感染的植株对蚜虫的吸引力增加，蚜虫对植株的破坏增加，而病毒存在于细胞中，多次的穿刺细胞，增加了蚜虫获得病毒的几率。在韧皮部，植株感染病毒后，又表现出排斥蚜虫取食，蚜虫唾液分泌(n_E1 E1的个数)增加，取食 (％sE2/E2持久E2占E2的比例)减少，这样就减少了长时间取食造成了病毒丢失。这些行为都对蚜虫获取病毒有利。与浙平4相比，新油17在感染病毒后，叶表的抗性消失，对蚜虫的吸引力增加要超过浙平4，所以也显示出新油17更容易使蚜虫获得病毒。
在蚜虫携带病毒后，与植株感染病毒相似，探测时间(s_Pr探测的总时间) 减少，韧皮部之前所需的时间(t_1Erec从EPG开始到第一个E的时间)也减少，但穿刺细胞(n_pd/n_Pr每次探测中pd波的平均发生次数)增加，唾液分泌(n_E1 E1的个数)增多，取食(％sE2/E2持久E2占E2的比例)减少。这样的行为对于蚜虫成功接种病毒也是必要的。但相比于浙平4，在新油17上，携带病毒的蚜虫更快的开始穿刺细胞，取食被抑制的更强，可见，新油17更加适合蚜虫接种病毒。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用电子穿刺图谱技术EPG进行甘蓝蚜对油菜植株取食行为的监测，针对甘蓝蚜在不同品种的油菜植株上的取食行为，获得第一组EPG参数，或者针对甘蓝蚜在不同品种的病毒源油菜植株上的取食行为，获得第二组EPG参数，或者针对携带病毒的甘蓝蚜在不同品种的油菜植株上的取食行为，获得第三组EPG参数；
（2）在第一组EPG参数中，若对应于蚜虫在韧皮部取食行为的EPG参数中，与E1波相关的EPG参数越大，与E2波相关的EPG参数越小，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越强；或者在第二组EPG参数中，对应于蚜虫在叶表、叶肉取食行为的EPG参数中，若探测的总时间越少，非探测的总时间越大，开始到第一个E波的时间越短，pd波的个数和pd波的总持续期越大，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越弱；或者在第三组EPG参数中，对应于蚜虫在叶表、叶肉和韧皮部取食行为的EPG参数中，若探测的总时间越少，开始到第一个E波的时间时间越短，但每次探测中pd波的平均发生次数越多，E1波的个数也愈多，持久E2波>10 min占E2波的比例越少，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越弱。
2.根据权利要求1所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述EPG参数包括总览性参数、叶表参数、叶肉参数和韧皮部参数；其中，
所述总览性参数和叶表参数包括：第一个E波之前非探测的持续期、开始到第一个E波的时间、探测的次数、探测的总时间、非探测的总时间、非韧皮部阶段的总持续期、开始到第一个E2波的时间、到第一次探测的时间；
所述叶肉参数包括：第一个E1波之前的探测次数、每次探测中pd波的平均发生次数、短暂探测C波<3 minutes的次数、pd波的个数、pd波的总持续期、C波的总持续期、从探测开始到第一个E波的时间、从第一次探测开始到第一个pd波的时间、C波所占的百分比；
所述韧皮部参数包括：E1波的个数、E1波占韧皮部阶段的百分比、后面接第一个持久E2波>10 min的E1波的持续期、后面接持久E2波>10 min的E1波的总持续期、潜在的E2波指数、E波的总持续期、E1波的总持续期、E2波的总持续期、最长E2波的持续时间、持久E2波 >10min占E2波的比例、E1波占测试时间的百分比、E2波占测试时间的百分比。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述病毒源油菜植株为感染TuMV病毒的油菜植株；所述携带病毒的甘蓝蚜为携带TuMV病毒的甘蓝蚜。
4.根据权利要求1所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，在第一组EPG参数中，若对应于蚜虫在韧皮部取食行为的EPG参数中，持久E2波>10 min占E2波的比例越低，后面接第一个持久E2波的E1波的持续期越长，则表明该品种油菜的抗蚜传毒性越强。
5.根据权利要求1所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述“利用电子穿刺图谱技术EPG进行甘蓝蚜对油菜植株取食行为的监测”具体包括如下步骤：
（11）将甘蓝蚜用导电银胶将金丝一端固定于背部后，放置于繁育蚜虫的植株上过夜适应；同时选择油菜植株作为测试对象；
（12）将金丝的另外一端接到DC-EPG 系统上，同时将植物电极插入植株土壤中，再将饥饿处理后且连接金丝的甘蓝蚜置于油菜植株上，在法拉第笼中进行试验；
当甘蓝蚜的口针刺入植物组织时，由甘蓝蚜口针为微电极和植物根部土壤为参比电极构成的回路接通，获取甘蓝蚜在油菜植株上对应至少6h取食行为产生的一系列电信号；
（13）将上述电信号经DC-EPG系统放大处理后，经过转化形成数字信号，以波形数据的形式进行记录，即为蚜虫在油菜上取食行为的EPG波形；
（14）将上述EPG波形进行类比、分析以及认定，对EPG波形包含的非刺探波np、路径波C、细胞内穿刺波pd、唾液分泌波E1、取食波E2对应的时间、次数进行统计、筛选，获得EPG参数，由此实现对甘蓝蚜在油菜上取食行为的监测。
6.根据权利要求5所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述甘蓝蚜为新羽化2天的无翅甘蓝蚜；所述油菜植株为发育到4叶期的油菜植株；所述饥饿处理的时间为1h。
7.根据权利要求5所述的鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述DC-EPG 系统为荷兰Wageningen University 生产的Giga4 型号的4 通道的DC-EPG 系统；所述DC-EPG 系统的一个通道只能连接一根金丝，一根金丝也只能连接一头甘蓝蚜。
8.根据权利要求5所述鉴定不同品种油菜抗蚜传毒性的方法，其特征在于，所述试验在室内、恒定光照以及25±1℃的温度下进行；试验过程中，每株油菜植株与每头甘蓝蚜仅用于1次试验，至少有20次有效重复试验。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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