CN107046852A - 一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过种子测定辣椒耐涝性的方法，通过对种子进行淹水处理，并测定其耐涝性，最终得到辣椒品种的耐涝性。本发明所述方法简便易行，成本低，结果可靠，能客观反映辣椒涝害的真实情况。可为耐涝品种培育及新品种耐涝鉴定提供技术和材料支撑。

Description

一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法

技术领域

本发明涉及一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法。

技术背景

辣椒是我国重要的蔬菜作物之一，全国有20多个省都有辣椒栽培，常年种植面积125～130万hm²(2000万亩左右)，总产量2800万吨、产值700亿元以上，。辣椒是浅根性植物，根系呼吸旺盛，耗氧量大，耐水涝能力较弱，土壤水分过多会影响其生长(邹学校，2009)。辣椒受涝后，易出现沤根死苗，叶片黄化脱落和落花落果等(王彬，2011)。中国长江中下游地区涝渍危害频繁发生，严重影响了春季和夏秋栽培辣椒等作物的产量和质量，而中国种植的辣椒60％～70％为露地栽培，涝害导致的减产减收更为严重。因此，对辣椒进行耐涝性能力评价，鉴定和筛选耐涝性较强的辣椒种质，对促进辣椒稳产和增产具有重要作用。

目前减少涝害的的途径主要为通过兴建和完善水利设施来排水减渍，降低地面水位，达到一定的减少涝害的效果，但解决涝渍灾害最根本有效的方法是选育耐涝性品种，目前已有诸多学者开展植物耐涝性的预测和评价(张路，2015；胡化广，2011；齐晓花，2011；Magneschi et al，2009)。如李阳生等(2002)利用一些形态和产量性状指标，比较分析杂交稻和常规稻对深水涝渍环境及分裂期、孕穗期对淹涝胁迫环境适应能力的差异性。尹冬梅等(2009)通过观察菊花苗期叶色、叶形态、茎色、茎形态4个外观形态指标，并定量分级来进行耐涝性综合评价。周广生等(2003)利用根系活力、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖等生理指标的耐湿系数衡量小麦的耐湿性。除通过产量或植株形态进行耐涝性评价，通过在种子发芽期进行涝渍处理进行耐涝性评价的方法也已有广泛应用，张学昆等(2007)研究发现萌发种子淹水12h后的相对活力指数与花期田间湿害后的产量性状耐湿指标显著相关，认为发芽期淹水处理可以用于评价甘蓝型油菜的耐湿性。陈洁等(2006)明确了淹水12h可以作为油菜发芽期耐渍鉴定的时间指标。邹锡玲等(2014)研究油菜不同生长阶段的耐渍性，发现油菜在发芽期和苗期的耐渍性与成熟期的耐渍性保持一致。现有研究表明辣椒的耐涝性评价多基于苗期涝害的形态特征的表型评价(郑佳秋，2012；2015)，这种方式易受土壤，气候等自然因素的影响，且评价周期长，幼苗长势不好控制，操作较为复杂，不适宜实验室室内操作，限制了辣椒耐涝性评价的时间性和可重复性。而在种子萌发期评价辣椒耐涝性的方法尚无报道，因此，对辣椒种子萌发期进行耐涝性评价，探索更加快速有效的耐涝性评价方法具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过辣椒种子测定辣椒品种耐涝性的方法。该方法简便易行，所需设备和资金投入少，成本低，结果可靠，能更为准确地反映辣椒发芽期对涝害的反应特点，并能合理、高效地评价该品种辣椒的耐涝性。

为解决本发明提出的技术问题，本发明采用的技术方案为：一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，包括以下步骤：

(1)处理：将辣椒种子完全浸入水中，淹水处理3-6d后取出；

(2)测定生理生化指标：测定淹水处理后种子的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的酶活力，以及脯氨酸(PRO)、可溶性糖、超氧阴离子和羟自由基的含量；

(3)测定种子发芽率和发芽势：测定淹水处理后种子发芽率和发芽势，将淹水后种子于湿润状态下，于27℃±0.5℃的恒温培养箱中培养，每天观察种子的发芽情况并详细记录，重复3次；

发芽率＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

发芽势＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

(4)以步骤(2)的生理生化指标为基础，采用隶属函数评估法对各品种辣椒种子的耐涝性进行综合评估。

本发明进一步包括以下优选的技术方案：

优选的方案中，所选辣椒种子为各品种辣椒种子，其籽粒健壮、饱满，一致性好、无残缺。种子淹水处理时间优选为5d。

优选的方案中，所述步骤(2)中，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的酶活力均采用试剂盒法测定。

恒温培养优选为置于下垫1-2层和上盖1层滤纸作为保湿材料的10×10cm培养皿中，然后将培养皿置于培养箱中(25±1)℃培养，保持培养皿正常湿度。

优选的方案中，步骤(3)中的培养时间为14d，通过下垫和上盖滤纸作为保湿材料，发芽标准为以种子露白视为萌发，按农作物种子检验国家标准，发芽7d后统计种子发芽势，14d后统计其发芽率。

优选的方案中，培养时间优选为14d，培养时间过短不易观察辣椒种子涝害后的出芽差异，培养时间过长则容易烂种烂芽。

发芽的标准以破胸露白开始即可视为发芽。按国家农作物种子检验规程gb3543-83规定，在培养7d后测定种子发芽势，培养14d后测定种子发芽率。

优选的方案中，所述步骤(4)之前，步骤(2)和步骤(3)至少设置1个重复。

优选的方案中，步骤(4)中隶属函数评估方法为：R(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)；若某一性状与耐涝性呈负相关关系，则利用反隶属函数进行计算，即R(Xi)＝1–(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)；各项指标的隶属函数值相加得到总隶属函数值，根据总隶属函数值的大小按耐涝性评价等级进行评价；

种子各指标耐涝性计算公式：

R_发芽势＝Xi/6.67 R_发芽率(Xi)＝(Xi–53.33)/22.23

R_SOD(Xi)＝(Xi–255.99)/107.02 RO₂·^-(Xi)＝1-(Xi–44.45)/52.82

R_CAT(Xi)＝(Xi–4.40)/2.16 R_POD(Xi)＝(Xi–4.67)/6.26

R_GR(Xi)＝(Xi–0.0342)/0.0281 R_AMS(Xi)＝(Xi–6.12)/4.54

R_LPS(Xi)＝(Xi–100.91)/27.39 R_PRO(Xi)＝(Xi–40.02)/45.26

R_可溶性糖(Xi)＝(Xi–25.12)/20.62 R_·OH(Xi)＝1-(Xi–2.12)/0.35

耐涝性评价等级：

表1

其中，

Xi表示所需鉴定品种的某项指标测定值；

Xmax表示各品种中该指标测定的最大值；

Xmin表示各品种中该指标测定的最小值。

本发明的有益效果如下：

1、本发明基于种子淹水后发芽情况，以及辣椒种子超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的活力，以及脯氨酸(PRO)、可溶性糖、超氧阴离子和羟自由基的含量，建立一种快速、简便评价辣椒耐涝性的方法。可完全在实验室进行，简单易行，可控性强，不受季节和气候影响，且所需设备投入少，成本低，省工省时，重复性好。

2、能较为准确地反映出辣椒发芽期对涝害的反应特点，结果可靠。

3、加速辣椒资源品种耐涝性测定进程，可为耐涝品种培育及新品种耐涝鉴定提供技术和材料支撑。

附图说明

图1为淹水胁迫下不同品种辣椒种子SOD、POD、CAT、GR活性的变化图；

图2为淹水胁迫下不同品种辣椒种子AMS和LPS活性的变化图；

图3为淹水胁迫下不同品种辣椒种子脯氨酸、可溶性糖、羟自由基和超氧阴离子含量的变化图；

图4为不同品种辣椒的耐涝性，注：A-S15,B-A46,C-A77；1-正常,2-水涝后。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1不同品种辣椒种子在不同淹水时间下的生理生化响应

选取辣椒自交系材料S15、A46和A77(湖南省蔬菜研究所提供)3个辣椒品种的种子为材料(以下简称S15、A46、A77)进行不同淹水时间对辣椒种子生理生化特性影响试验。

具体方法为：

(1)各材料精选3000-3500粒饱满的、一致性好的种子，通过滤纸覆盖将种子完全浸入水中，淹水0h、10h、5d、10d、15d和20d后分批取出500粒种子。其中100粒用于测定发芽率和发芽势，其余400粒种子用于测定其他指标，重复3次。

(2)将经过淹水处理的种子用清水冲洗后放到恒温培养箱中进行恒温培养，恒温培养为置于下垫1-2层和上盖1层滤纸作为保湿材料的10×10cm培养皿中，然后将培养皿置于培养箱中(27±0.5)℃培养。每天对种子进行补湿和观察种子发芽情况并做详细的发芽种子数记录。

(3)生理生化指标测定：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的酶活力均采用试剂盒法(南京建成生物工程研究所)测定，脯氨酸(PRO)含量测定采用酸性茚三酮法，可溶性糖含量测定采用蒽酮法，超氧阴离子和羟自由基采用试剂盒法(南京建成生物工程研究)测定。

(3)统计分析：发芽标准：以种子露白视为萌发，按农作物种子检验国家标准，发芽7d后统计种子发芽势，14d后统计其发芽率。计算公式为：

种子发芽势＝(规定天数种子发芽数/试验总粒数)×100％

种子发芽率＝(规定天数种子发芽粒数/试验总粒数)×100％

使用Excel和SPSS进行数据分析，差异显著性用邓肯氏检验法进行多重比较。参照周广生等方法计算隶属函数值，R(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。

表2不同淹水时间对辣椒种子发芽势的影响

注：小写字母代表同一品种不同淹水时间下发芽势比较，大写字母代表同一淹水时间不同品种发芽势的比较(P＜0.05)。

从表2可以看出，随着淹水处理时间的延长，辣椒种子发芽势总体呈先上升后下降的趋势。在淹水0h、5h和5d三个处理中，A46和S15种子发芽势接近0，A77的发芽势略优于A46和S15；淹水处理10d后，A77种子的发芽势仅为8.33％，而A46和S15的发芽势较A77显著升高，分别高出220.17％和353.54％。淹水处理15d后，3个品种的辣椒种子的发芽势都达到最大，分别为20％、56.67％和55％，随后辣椒种子发芽势均有不同程度的降低。

表3不同淹水时间对辣椒种子发芽势的影响

注：小写字母代表同一品种不同淹水时间下发芽率比较，大写字母代表同一淹水时间不同品种发芽率的比较(P＜0.05)

由表3可以看出，随着淹水时间的延长，辣椒种子发芽率呈先升高再降低的趋势，其中A77的发芽率最早出现降低的趋势。淹水0-10h，A77的发芽率升高，但未达到显著水平；随后降低，淹水10d后发芽率显著降低。A46的发芽率则在淹水10h、15d后显著升高，淹水20天后显著降低。在淹水10h和5d两个处理中，S15的发芽率都有显著升高，淹水15d后显著降低。淹水5d时，A77的发芽率开始显著低于A46和S15，分别低出22.29％和29.42％。水淹20d后，A77发芽率下降至20％，较淹水10h时降低了67.57％；而A46、S15在水淹处理20d时发芽率仍有64.40％和60％，显著高于A77。

且从图1可以看出，淹水胁迫下，种子超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性，随淹水胁迫时间的延长总体呈先上升后下降的趋势。其中A46和S15的SOD、POD活性均在第15d达到最大值，A77的SOD活性保持在较低的水平，在第10d达到最大值，随后逐渐降低；POD活性则随淹水时间的延长持续增加。A77的CAT活性在淹水10h即达到最大，随后逐渐下降；A46、S15的CAT活性则在第5d后达到最大值，且CAT活性始终高于A77。在整个淹水胁迫过程中A77的SOD活性较低，导致了超氧化物的积累，是致使其抗涝性较低的原因之一。辣椒种子谷胱甘肽还原酶(GR)在淹水0h时均处于较低水平，10h后活性迅速升高至最高值，然后降低，至淹水10d后又逐渐回升，其中A46淹水5d后随淹水时间的延长GR活性变化较小，而S15和A77则有较大幅度的变化。

图2显示，随着淹水时间的延长，辣椒种子淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)活性呈现先上升再下降的趋势。淹水处理5d时，A77的AMS活性达到最大，淹水处理15d后，AMS活性显著下降；A46和S15的AMS活性则在淹水处理的第10d达到最大值，15d后显著降低。淹水胁迫1-10h时，品种之间的AMS活性相差不大，淹水5-20d时，三者之间的酶活性表现为S15>A46>A77，其中淹水5d时，S15的AMS活性较A46高29.06％，较A77高74.18％。淹水处理0h时，A77的LPS活性明显高于A46、S15，在淹水5d后达到最大值，然后逐渐降低；淹水处理10d后A77的LPS活性明显低于其他两个品种；淹水20d时，A77的LPS活性较淹水0h下降了39.31％。淹水10h后，A46和S15的LPS活性迅速增大，较淹水0h分别升高了241.56％、320.91％；其中S15在淹水5d后达到最大值，A46在水淹10d后达到最大值。

图3显示，随着淹水时间的延长，脯氨酸(PRO)和可溶性糖含量总体呈先上升再下降的趋势。淹水10h后，S15的PRO含量较A77和A46分别高114.29％、81.01％；淹水15d后，其含量明显降低，20d后其脯氨酸含量略高于A77、A46。A46的PRO含量在淹水0h时较A77和S15分别高出68.71％和156.36％，淹水后其含量降低。在整个淹水胁迫过程中A77的可溶性糖含量较低，随淹水时间的延长，其含量在5d时达到最高值，较A46和S15分别低出37.81％和45.08％。淹水胁迫5-20d时，A46和S15的可溶性糖含量明显高于A77，且S15的可溶性糖含量高于A46。

从图3可以看出，随着淹水时间的延长，羟自由基含量持续增加；同一淹水时长下，辣椒的抗涝性越差，种子中羟自由基和超氧阴离子含量越高，与抗涝性呈负相关。淹水0h时，3个品种辣椒的羟自由基、超氧阴离子很低，但随淹水时间的延长含量逐渐升高。其中羟自由基含量在淹水0h，10h和5d时均无明显变化，但淹水10d后含量显著升高，A77升高幅度最大，淹水10d、15d和20d后较增幅最小的S15分别高出58.66％、103.60％和80.68％。超氧阴离子含量则在淹水10h后即有明显升高，且A77增幅最大，各淹水时间下均高于A46和S15辣椒种子，但淹水10d后，随淹水时间的延长三者的超氧阴离子含量已无明显变化，均呈A77＞A46＞S15的趋势。

表4淹水胁迫处理天数对各项生理生化指标的影响及辣椒品种耐涝性综合比较

为了比较不同水淹时间下，辣椒种子抗涝性差异，采用多性状指标的隶属函数法进行评价。若一个指标在不同水涝敏感度材料中数值差异越大，则能更直观的评价不同材料的耐涝性。因此，在进行隶属函数分析前先将不同淹水时间下3个材料不同生理生化指标的具体数据值求得极差值，通过极差值求得隶属函数，隶属函数越大，则极差越大，对不同耐涝性材料的鉴定区分也越明显。羟自由基、超氧阴离子含量与植物的抗涝性呈负相关关系，但由于是通过极差值求隶属函数，计算其隶属函数值时仍使用R(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。

实施例2不同品种辣椒发芽期耐涝性评价

试验中所用的材料选取辣椒自交系材料S15、A46和A77(湖南省蔬菜研究所提供)3个辣椒品种的种子为材料(以下简称S15、A46、A77)，进行淹水处理5d对辣椒种子生理生化特性影响试验。

具体方法为：

(1)处理：将三个材料精选的辣椒种子通过滤纸覆盖完全浸入水中，淹水5d后分别取出500粒种子。

(2)生理生化指标测定：分别取400粒种子用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、淀粉酶(AMS)和脂肪酶(LPS)的活力，以及脯氨酸(PRO)、可溶性糖、超氧阴离子和羟自由基的含量。

(3)催芽：分别取100粒用于测定发芽率和发芽势，均匀置于铺有两层滤纸的培养皿中，保持滤纸湿润，于27℃±0.5℃的恒温培养箱中萌发，每天观察种子的发芽情况并详细记录，重复3次。

发芽率＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

发芽势＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

(4)统计分析：通过隶属函数评价品种的耐涝性

参照周广生等方法计算隶属函数值，R(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)；若某一性状与耐涝性为负相关，则利用反隶属函数进行计算，即R(Xi)＝1–(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。各项生理生化指标隶属函数值相加得到总隶属函数值。

辣椒耐涝等级的确定：按照说明书中的表1进行耐涝性评价。

表5淹水处理5d下不同品种辣椒种子各项生理生化指标隶属函数

根据实施例1的结果，淹水5d时3个辣椒品种已表现出明显的抗涝性差异，为了具体地评价其抗涝性高低，以3份辣椒种子淹水5d后的各项生理生化指标值为依据，采用隶属函数法对各品种的耐涝性进行综合评定。从表5可以看出，S15的总隶属值最大，其次是A46，A77的总隶属函数值最小。三个品种的抗涝性表现为：S15>A46>A77。

实施例3

对各项生理生化指标进行相关性分析，由表1可以看出，羟自由基和超氧阴离子与其他指标呈负相关关系，过氧化氢酶(CAT)活性与过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(PRO)含量、脂肪酶(LPS)活性呈负相关关系。辣椒种子的各项生理生化指标相关性不显著，说明这9项指标之间没有相互重叠，都可以在一定程度上反映辣椒种子对淹水胁迫的耐受能力。

表6淹水胁迫下辣椒种子各生理生化指标的相关系数

实施例4

将出芽萌发的S15、A46、A77种子进行种植，并于苗期(六叶一心期)分两组种于大田。组1：缓苗5d后进行淹水胁迫处理，将所种辣椒地都为用泥堆一圈高于田垄的田埂，向田埂中灌水至水面高出根际2cm以上；组2：田间正常水分管理。验证种子淹水鉴定辣椒耐涝性的准确性。根据图4的结果可以看出，持续淹水状态5d后淹水处理组S15较正常处理组S15相比无叶片黄化萎焉等明显变化；淹水处理组A46较正常处理组A46相比下四叶叶片明显黄化萎焉，但上不叶片保持正常生长；淹水处理组A77较正常处理组A477相比除顶部新叶外其他叶片均萎焉黄化。因此表型鉴定为：S15耐涝性最强，A46次之，A77最差。

Claims (9)

1.一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)处理：将辣椒种子完全浸入水中，淹水处理3-6d后取出；

(2)测定生理生化指标：测定淹水处理后种子的超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、淀粉酶和脂肪酶的酶活力，以及脯氨酸、可溶性糖、超氧阴离子和羟自由基的含量；

(3)测定种子发芽率和发芽势：测定淹水处理后种子发芽率和发芽势，将淹水后种子于湿润状态下，于27℃±0.5℃的恒温培养箱中培养，每天观察种子的发芽情况并详细记录，重复3次；

发芽率＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

发芽势＝规定天数发芽种子数/种子总粒数×100％

(4)以步骤(2)的生理生化指标为基础，采用隶属函数评估法对各品种辣椒种子的耐涝性进行综合评估。

2.根据权利要求1所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：所选辣椒种子为各品种辣椒种子，其籽粒健壮、饱满，一致性好、无残缺。

3.根据权利要求1或2所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：

所述步骤(2)中，超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、淀粉酶和脂肪酶的酶活力均采用试剂盒法测定。

4.根据权利要求3所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：脯氨酸(PRO)的含量采用酸性茚三酮法测定。

5.根据权利要求3所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：可溶性糖含量采用蒽酮法测定。

6.根据权利要求3-5任一项所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：超氧阴离子和羟自由基的含量采用试剂盒法测定。

7.根据权利要求1所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：

步骤(3)中的培养时间为14d，通过下垫和上盖滤纸作为保湿材料，发芽标准为以种子露白视为萌发，按农作物种子检验国家标准，发芽7d后统计种子发芽势，14d后统计其发芽率。

8.根据权利要求1所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：所述步骤(4)之前，步骤(2)和步骤(3)至少设置1个重复。

9.根据权利要求1所述的一种通过种子测定辣椒品种耐涝性的方法，其特征在于：

步骤(4)中隶属函数评估方法为：R(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)；若某一性状与耐涝性呈负相关关系，则利用反隶属函数进行计算，即R(Xi)＝1–(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)；各项指标的隶属函数值相加得到总隶属函数值，根据总隶属函数值的大小按耐涝性评价等级进行评价；

种子各指标耐涝性计算公式：

R_发芽势＝Xi/6.67 R_发芽率(Xi)＝(Xi–53.33)/22.23

R_SOD(Xi)＝(Xi–255.99)/107.02 RO₂·^-(Xi)＝1-(Xi–44.45)/52.82

R_CAT(Xi)＝(Xi–4.40)/2.16 R_POD(Xi)＝(Xi–4.67)/6.26

R_GR(Xi)＝(Xi–0.0342)/0.0281 R_AMS(Xi)＝(Xi–6.12)/4.54

R_LPS(Xi)＝(Xi–100.91)/27.39 R_PRO(Xi)＝(Xi–40.02)/45.26

R_可溶性糖(Xi)＝(Xi–25.12)/20.62 R_·OH(Xi)＝1-(Xi–2.12)/0.35

其中，

Xi表示所需鉴定品种的某项指标测定值；

Xmax表示各品种中该指标测定的最大值；

Xmin表示各品种中该指标测定的最小值。