CN110999655A

CN110999655A - 一种用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110999655A
Application number: CN201911225614.9A
Authority: CN
Inventors: 李会勇; 贾腾蛟; 李晶晶; 曹言勇; 王利锋; 马娟; 王浩
Original assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Grain Crop Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2019-12-04
Publication date: 2020-04-14

Abstract

本发明公开了一种用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法及其应用。本发明保护的标准化样本制备方法，包括如下步骤：(A1)收集待测玉米雄穗，在特定条件下水培至盛花期，取花粉；所述特定条件为每24小时中，24℃光培养16小时/18℃暗培养8小时；(A2)将步骤(A1)得到的花粉进行高温处理，得到用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本。将所述方法制备的标准化样本利用花粉活力测定仪进行花粉活力测定，可实现高温胁迫下玉米花粉活力的简单快速准确测定。本发明对高通量筛选玉米花粉耐高温的玉米材料、挖掘耐高温相关的关键基因、解析玉米花粉耐高温的遗传机制、选育耐高温玉米新种质的选育有重要意义。

Description

一种用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法及其应用。

背景技术

近年来，随着温室效应的加剧，极端高温天气频繁发生，导致农作物大面积减产，高温胁迫已经成为制约农业生产最重要的环境因素之一。研究表明，作物生长季节，平均气温每升高1℃，作物总产量将下降3～10％，直接威胁着全球的粮食安全。据国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)和国际干旱地区农业研究中心((ICARDA)估算，到2050年全球气温将上升2-3℃，高温可能导致全球主要农作物减产30％左右。玉米是我国种植面积和总产最大的农作物，也是我国最重要的粮食、饲料和工业原料的来源，对保障我国国民经济发展具有重要的支撑作用。近年来，玉米主产区极端高温频现，对我国玉米产量和品质造成了极大的威胁，与此同时，随着畜牧业、玉米加工业的迅猛发展，我国对玉米的需求量呈现不断增加的趋势。因此，充分挖掘玉米耐高温的优异基因资源，培育耐高温的玉米品种是保障玉米单产水平持续提高的重要基础。

抽雄吐丝期是玉米高温胁迫最敏感的时期之一，此时期高温将导致花粉和花丝的数量和活力下降，授粉受精过程受阻，籽粒败育率增加，有效粒数减少。近年来，玉米生长季节后期，由于高温天气的影响，导致玉米花粉活力下降，因此，在生产上常常会出现玉米结实性差，花粒、秃尖等现象，最终玉米产量下降，甚至绝产。目前，关于玉米耐高温的研究还主要集中在生理学阶段，对玉米耐高温分子机制的解析还很少，在育种实践中可用的玉米耐高温种质资源和基因资源还十分匮乏，因此，迫切需要筛选出花粉活力耐高温的玉米种质，这是开展玉米耐高温关键基因的发掘和分子调控机制的研究的基础。但是大规模鉴定花粉活力，会受到田间试验管理水平、气温、湿度等环境因素的影响，缺乏一种可靠的技术体系对高温胁迫下的玉米花粉活力进行大规模精准鉴定。

目前现有花粉活力的检测方法通常采用染色法、花粉管培养法、田间授粉法等，但这些方法都会收到检测程序和环境等因素的影响，存在很大的局限性：(1)染色法。适用性低：同一染色剂不能涵盖所有花粉；操作复杂：需染色、样品制备复杂，染色剂的成本高，预处理时间长，需配置FDA使用液，花粉浸泡染色至少15min，显微镜下观察；可操作性差：需专业设备(荧光显微镜)、专业人员(样品制备、样品识别)；重复性差：褪色问题(镜检时间长，染色剂褪色，前后观察不一致)、人为主观(不同操作人员的观察结果经常不一致)；效率低：分析速度慢，一个视野图至少5min；通量低：一个视野仅十几个，至少十几甚至是几十个个视野的统计结果才有意义，一个样品就需要几个小时(图1，图1左侧为花粉耐高温能力差的材料，图1右侧为花粉耐高温能力强的材料)。(2)花粉管培养法。需要事先配制培养基，且需要在特定的温度和较长时间的培养才能实现，同时为了所测量结果的准确性需要一定的重复次数。(3)田间授粉法。不同日龄花粉的影响：不同日龄花粉授粉对结实率和籽粒粒重有明显差异，随着散粉的进行，花粉授粉结实率逐渐下降，同时结实籽粒的千粒重也呈下降趋势。因此，田间直接取粉的方法很难判定花粉的原始活力；环境因子的影响：随着全球温室效应的加剧，极端天气愈发频繁，大规模田间取样，不同批次间的样品很难保证花粉在田间温度、湿度的均一性，对后续的高温胁迫鉴定容易造成极大的误差。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法及其应用。

第一方面，本发明保护一种用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本制备方法，包括如下步骤：

(A1)收集待测玉米雄穗，在特定条件下水培至盛花期，取花粉；所述特定条件为每24小时中，24℃光培养16小时/18℃暗培养8小时；

(A2)将步骤(A1)得到的花粉进行高温处理，得到用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本。

第一方面所述方法中，所述待测玉米雄穗是在玉米抽雄后开始散粉时收集。

所述高温处理在可实现温度控制的装置中进行。

所述可实现温度控制的装置具体可为PCR仪。

所述高温处理可为40℃处理30-70min。

所述高温处理更具体可为40℃处理30min、40℃处理50min或40℃处理70min。

在本发明的实施例中，同时设置40℃处理30min、40℃处理50min和40℃处理70min三组进行实验，比较高温处理不同时间对花粉活力的影响。

第一方面所述方法在高温胁迫下玉米花粉活力测定中的应用也属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明保护一种高温胁迫下玉米花粉活力的测定方法，包括如下步骤：

(B1)按照第一方面所述方法制备待测玉米标准化样本；

(B2)对步骤(B1)制备得到的标准化样本进行花粉活力测定。

所述步骤(B2)中，采用花粉活力测定仪测定花粉活力；

所述花粉活力测定仪具体可为AmphaTMZ32。

以上第一方面和第二方面中任一所述方法在高通量测定高温胁迫下玉米花粉活力中的应用也属于本发明的保护范围。

以上第一方面和第二方面中任一所述方法在检测或辅助检测玉米高温耐性中的应用也属于本发明的保护范围。

以上第一方面和第二方面中任一所述方法在耐高温玉米新种质的鉴定与创制中的应用也属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明保护检测或辅助检测玉米高温耐性的方法，包括如下步骤：

(D1)检测待测玉米花粉原始活力；

(D2)按照第二方面所述方法检测待测玉米高温胁迫下花粉活力；

(D3)计算(D1)和(D2)的差值，差值越小的玉米高温耐性越高；

步骤(D1)中，所述“检测待测玉米花粉原始活力”的方法包括如下步骤：

(1)收集待测玉米雄穗，在特定条件下水培至盛花期，取花粉；所述特定条件为每24小时中，24℃光培养16小时/18℃暗培养8小时；

(2)对步骤(1)获得的花粉进行活力测定，得到待测玉米花粉原始活力。

所述(1)中，所述待测玉米雄穗是在玉米抽雄后开始散粉时收集。

所述(2)中，所述活力测定具体可使用花粉活力测定仪进行测定。

所述花粉活力测定仪具体可为AmphaTMZ32。

第四方面，本发明保护耐高温玉米新种质的鉴定与创制方法，包括如下步骤：按照第三方面中所述方法检测玉米高温耐性，筛选高温耐性高的玉米作为创制耐高温玉米新种质的基础材料。

第五方面，本发明保护一种用于花粉活力测定的标准化培养方法：收集待测玉米雄穗，在特定条件下水培至盛花期，取花粉；所述特定条件为每24小时中，24℃光培养16小时/18℃暗培养8小时。所述待测玉米雄穗是在玉米抽雄后开始散粉时收集。

上述任一方法中，取花粉时，具体可从同一待测样品的3个雄穗中等量提取花粉并充分混合。

上述任一待测玉米具体可为表1中所示的玉米。

本发明提供的用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本制备方法由以下两部分组成：(1)雄穗的离体培养：可最大程度降低外界环境的不稳定性对花粉生长发育的影响，取粉更加便捷；玉米雄穗离体培养不仅可以消除外部环境对花粉活力的影响，而且离体培养可以实现高通量室内操作，保证了花粉处理前的均一性，不会破坏花粉，节省测定时间及劳动成本，并可得到大量可供分析的信息和实时数据。(2)PCR温控系统：实现了对花粉温度处理的高通量标准化操作、方便、快捷。

将本发明制备的用于高温胁迫下玉米花粉活力高通量测定的标准化样本利用花粉活力测定仪(AmphaTMZ32)进行花粉活力测定，可实现高温胁迫下玉米花粉活力的简单快速准确测定。

本发明提供的高温胁迫下玉米花粉活力测定方法可实现高效、简便、快捷的花粉活力测定及评估，与传统的测量方法相比，花粉样品用量少、测定过程简单、快捷(测量过程仅需2分钟)，能够实现同时对多种玉米材料花粉活力的比较。本发明对于高通量筛选玉米花粉耐高温的玉米材料、通过全基因组关联分析挖掘耐高温相关的关键基因、解析玉米花粉耐高温的遗传机制、选育耐高温玉米新种质的选育有重要意义。

附图说明

图1为40℃条件下不同处理时间利用常规染色的方法检测玉米花粉活力。

图2玉米雄穗水培条件下的散粉情况。

图3为玉米自交系的花粉活力(％)。

图4为玉米自交系花粉活力的箱式图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本制备

一、供试材料

国内常用自交系、美国玉米自交系共计27份材料(详见表1)，这些自交系材料由河南省农业科学院粮食作物研究所玉米种质资源研究室提供，均为社会公开使用或已过保护期的常用自交系，公众也可以从河南省农业科学院粮食作物研究所获得。

二、花粉的标准化培养与提取

由于不同日龄、不同环境对花粉原始活力影响较大，为了保证高温处理前，得到真实可靠的花粉原始活力，本发明提出了通过对花粉进行标准化培养的方法，该方法可以最大程度降低外界环境的不稳定性对花粉生长发育的影响，同时也准确能保证花粉的取样时间，取粉更加便捷，具体方法如下：

将27份玉米材料在6月中旬种植于河南省农业科学院试验基地，按照当地玉米栽培模式进行田间正常管理。当玉米雄穗顶部刚开始散粉时，每个自交系材料抽取3个雄穗，并迅速放入在水中，然后转移至组织培养间在24℃光培养16小时，18℃暗培养8小时的条件下水培至盛花期(开花不同时期见图2，图2中，A为刚开始开花，B为进入盛花期，C为开花即将结束)。

每个自交系从3个雄穗中等量提取花粉并充分混合，每个自交系共取约250μL体积的新鲜花粉至灭菌试管中，用于后续高温处理。

三、花粉的高温处理

针对玉米生长期间，田间温度不稳定且无法控制、难以大规模定量测定不同玉米基因型之间高温胁迫下花粉的活力，本发明提出了利用PCR温控系统对花粉进行高温处理的方法。该方法能够准确地定量分析不同材料在高温胁迫下花粉的活力，同时保证花粉温度处理的准确性。具体方法如下：

在步骤二制备的250μL的新鲜花粉中，取5份体积分别为10μL的新鲜花粉置于PCR反应管中(200μL)，按照如下五组进行胁迫与正常处理：

第一组(正常对照组)：将花粉迅速转移至PCR仪(25℃)中，不进行任何处理；

第二组：将花粉迅速转移至PCR仪中，PCR仪设置为40℃高温处理30min；

第三组：将花粉迅速转移至PCR仪中，PCR仪设置为40℃高温处理50min；

第四组：将花粉迅速转移至PCR仪中，PCR仪设置为40℃高温处理70min；

第五组(死亡对照组)：将花粉迅速转移至PCR仪中，PCR仪设置为75℃高温灭活20min。

按照上述方法制备得到用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本，可将标准化样本立即进行花粉活力检测或在PCR仪25℃条件下保存直至进行花粉活力检测。

实施例2、高温胁迫下玉米花粉活力的高通量测定及综合评估

一、花粉活力测定

取实施例1制备的五组标准化样本，使用花粉活力分析仪(AmphaTMZ32，Amphasys，Swiss)测定各组花粉活力，具体步骤如下：首先将处理过的花粉颗粒转移至2mL灭菌试管中，然后添加1.5mLAmphaFluid#6缓冲液，用于悬浮全部花粉颗粒。将花粉悬液经过滤后(2μm孔径)转移至5mL圆底管。将E型测量芯片(250μm×250μm)安装至分析仪，通电后打开测量软件，设置软件参数如下：设置测量ID、测量芯片类型(E00926)及缓冲液ID(AF6)、频率(2Hz和18Hz)、停止条件(2000/count)；然后执行冲洗程序后开始测量，测量结束后手动停止测量；依据死亡对照组设定门控，并计算花粉存活比例，即为花粉活力值。每个处理进行三次重复。利用不同时间的高温胁迫所得到的数据，导入BLUP模型对不同玉米花粉活力进行综合评估。

二、数据统计及分析

通过Excel记录及整理数据，利用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、箱式图绘制，利用ICmapping软件进行花粉活力的综合评估。

三、结果

1、27份玉米自交系花粉原始活力的测定

由图3可知，27份玉米自交系间的原始花粉活力(正常对照组)存在不同差异，其中，PHK05的花粉活力高达94.3％，而790的花粉活力仅有6.9％(表1)。依据本发明实际的测定数据，对27份玉米自交系的花粉活力进行定量比较可知，PHK05,PHK29,4N506,浚X35，OQ101，207，L127，洛611，沈135，IBC2等十份玉米自交系的原始花粉活力较高(>80％)，而LH145，CS405，ML606，790等4份玉米自交系的花粉活力普遍不足30％(图3和表1)。这表明，利用本发明的花粉活力测定系统可以在短时间内对多份玉米自交系花粉原始活力进行定量分析，实现不同玉米自交系间花活粉活力的定量比较。

表140℃胁迫条件下不同处理时间玉米自交系的花粉活力

2、不同时间的高温处理对27份玉米自交系花粉活力的影响

利用PCR温控系统，对27份玉米自交系花粉进行40℃条件下的30min、50min及70min的高温胁迫。由图3和图4可知，随着高温处理时间的延长，27份玉米自交系花粉活力有不同程度的下降，至50min及70min的高温处理时，不同玉米自交系间的花粉活力的差异进一步增加，这表明不同玉米自交系花粉对高温胁迫的敏感性差异较大,其中，PHK29，浚X35，沈135，洛611，2016X1404等5份份玉米自交系在高温处理70min后，其活力仅分别下降16.0％、11.0％、13.5％、11.5％、10.5％，表现出较高的抗高温性；相比之下，PHK05、OQ101、L127等3份自交系的花粉活力则分别下降91.6％、87.3％、85.4％(表1和图3)。

表240℃处理下不同处理时间玉米自交系花粉活力与单穗重的相关性

对27份玉米自交系的单穗重与各花粉的原始活力、40℃-30min、40℃-50min、40℃-70min的花粉活力进行相关性分析可知，花粉的原始活力、不同时间段的高温处理下的花粉活力均与单穗重均呈显著相关，其中，40℃-50min与40℃-70min条件下的花粉活力与单穗重的相关系数较高(表2)。这表明本发明的PCR温控系统能够有效模拟田间高温对花粉活力的影响，花粉活力对田间的产量具有显著的影响。

上述结果表明，本发明能够有效模拟不同高温条件对玉米花粉活力的影响，筛选得到花粉耐高温性有差异的玉米自交系。

Claims

1.一种用于高温胁迫下玉米花粉活力测定的标准化样本制备方法，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测玉米雄穗是在玉米抽雄后开始散粉时收集。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述高温处理在可实现温度控制的装置中进行；

和/或，

所述高温处理为40℃处理30-70min。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述可实现温度控制的装置为PCR仪。

5.一种高温胁迫下玉米花粉活力的测定方法，包括如下步骤：

(B1)按照权利要求1-4任一所述方法制备待测玉米标准化样本；

(B2)对步骤(B1)制备得到的标准化样本进行花粉活力测定。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述步骤(B2)中，采用花粉活力测定仪测定花粉活力；

进一步地，所述花粉活力测定仪为AmphaTM Z32。

7.下述任一应用；

(C1)权利要求1至4任一所述的方法在高温胁迫下玉米花粉活力测定中的应用；

(C2)权利要求1至6任一所述的方法在高通量测定高温胁迫下玉米花粉活力中的应用；

(C3)权利要求1至6任一所述的方法在检测或辅助检测玉米高温耐性中的应用；

(C4)权利要求1至6任一所述的方法在耐高温玉米新种质的鉴定与创制中的应用。

8.检测或辅助检测玉米高温耐性的方法，包括如下步骤：

(D1)检测待测玉米花粉原始活力；

(D2)按照权利要求5或6所述方法检测待测玉米高温胁迫下花粉活力；

(D3)计算(D1)和(D2)的差值，差值越小的玉米高温耐性越高；

9.耐高温玉米新种质的鉴定与创制方法，包括如下步骤：按照权利要求8所述方法检测玉米高温耐性，筛选高温耐性高的玉米作为创制耐高温玉米新种质的基础材料。

10.一种用于花粉活力测定的标准化培养方法：收集待测玉米雄穗，在特定条件下水培至盛花期，取花粉；所述特定条件为每24小时中，24℃光培养16小时/18℃暗培养8小时。