CN113699095B - 一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基及其用于测定花粉活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基及其用于测定花粉活力的方法，属于植物花粉离体培养技术领域。本发明公开了一种落羽杉属植物花粉离体萌发的液体培养基，培养基以蒸馏水为溶剂，其成分含有0.012％的硼酸，培养基的组分简单、制作时无需调节pH值。本发明还公开了采用该培养基测定落羽杉属植物花粉活力的方法，使用MTT染色液染色后进行观察统计，该测定方法操作简单快捷、测定结果稳定可靠，其检测结果相比于传统的离体萌发法更加便于观测和统计，可有效应用于落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉等所有落羽杉属植物花粉活力的测定。
Description
技术领域
本发明属于植物花粉离体培养技术领域，更具体地说，涉及一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基及其用于测定花粉活力的方法。
背景技术
花粉是雄配子体，是植物遗传信息的载体，其生活力对授粉受精、胚胎发育、种子产量和质量都有重要影响，直接影响到作物、蔬菜、果树、林木等的育种效率。植物花粉的活力与寿命因物种及环境条件的不同而有所差异，其生活力的检测方法主要有染色法、田间授粉法和花粉离体萌发法。不同的检测方法各有优缺点，染色法简便快捷，但准确性较差，花粉活力通常被高估。田间授粉法是最准确的方法，但是易受外界环境影响且费时费力。花粉离体萌发法是模拟花粉在植物体内的萌发过程，能够观测花粉的萌发率和花粉管长度，其检测结果与花粉体内萌发率最为接近，更能反应花粉的发育状况和真实活力，被认为是效果最好花粉活力测定方法。适宜的离体培养条件是花粉萌发的关键，不同植物种类所需的培养基中的营养物质及矿物质元素有所不同，比如，玉米花粉离体萌发的最佳培养基包含15%的蔗糖、0.01%的硼酸、0.03%的硝酸钙和0.6%的琼脂，大豆花粉培养基包含15%的蔗糖、0.01%的硼酸和0.03%的硝酸钙，凤梨花粉培养基包含20%的蔗糖、0.001%的硼酸和0.5%的琼脂，葡萄花粉培养基中仅含20%蔗糖，美洲栗木花粉培养基包含5.13%的蔗糖、0.001%的硼酸、0.003%的硝酸钙、0.002%的硫酸镁、0.001%的硝酸钾、2.74%的甘露醇和0.4%的琼脂，油杉花粉培养基包含24%的蔗糖、0.021%的硼酸和0.007%的氯化钙。因此，采用离体萌发法时需要对该物种花粉离体萌发的最佳培养基组分及其浓度进行研究和筛选。
目前，关于落羽杉属植物花粉离体培养的培养基和培养方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基。本发明所要解决的另一技术问题在于提供利用前述培养基进行培养和测定落羽杉属植物花粉活力的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，是浓度为0.006%～0.03%的硼酸水溶液。
进一步地，所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，是浓度为0.01%～0.018%的硼酸水溶液。
进一步地，所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，是浓度为0.012%的硼酸水溶液。
一种利用所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，包括：采集落羽杉属植物的花粉，将花粉与所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基搅配成花粉溶液，在一定条件下培养一段时间后，取一部分花粉溶液使用MTT染色液进行染色后置于载波片上，于显微镜下观察并统计视野内花粉的萌发率或花粉管萌发长度。
进一步地，所述的落羽杉属植物具体为：落羽杉、墨西哥落羽杉或池杉。
进一步地，所述采集落羽杉属植物的花粉具体为：当落羽杉属植物的雄球花成熟时，从树冠中上部剪取发育正常、无病虫害雄球花序，置于室温10～15℃、空气湿度为60%～70%的环境中进行水培，待花粉散落时，收集花粉，放入干燥器内，于4℃冰箱内贮藏备用。
进一步地，所述的一定条件具体为：温度为30℃、湿度为60%～70%的遮光环境。
进一步地，所述的一定时间具体为：12~96h。
进一步地，所述的使用MTT染色液进行染色具体为：是用pH7.2的磷酸缓冲液将MTT配置成0.4%的溶液，MTT染色方法是取600μL培养48小时的花粉溶液置于2mL离心管中，1:1加入600μL 0.4%MTT染色液，充分混匀后，30℃恒温培养箱静置30min。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明利用蔗糖和硼酸2因素4水平正交实验和硼酸13水平单因素实验获得了落羽杉花粉离体萌发条件及培养方法，筛选出了落羽杉花粉离体萌发最适培养基。利用该培养基和培养方法结合MTT染色法建立了落羽杉属植物花粉活力离体萌发检测法，利用该方法对落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉等落羽杉属植物的花粉活力进行了检测，结果表明，该方法操作简单快捷、测定结果稳定可靠，MTT染色后花粉及花粉管均呈蓝色，与培养基的灰白色形成鲜明对比，该方法相比于传统的不染色的离体培养方法，更便于花粉萌发率和花粉管长度的观测和统计，同时有利于对花粉萌发过程中花粉管内物质发育过程的观察，该方法可有效应用于落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉等所有落羽杉属植物花粉活力的测定。
附图说明
图1为10倍镜下落羽杉花粉在仅有0.01%硼酸的培养基中的萌发图；
图2为10倍镜下落羽杉花粉在仅有10%蔗糖的培养基中的萌发图；
图3为10倍镜下落羽杉花粉在含有5%蔗糖+0.005%硼酸的培养基中的萌发图；
图4为20倍镜下0.012%硼酸条件下落羽杉花粉萌发图；
图5为10倍镜下TD-4落羽杉花粉萌发图；
图6为10倍镜下TD-5落羽杉花粉萌发图；
图7为10倍镜下TM-A2墨西哥落羽杉花粉萌发图；
图8为10倍镜下TM-A5墨西哥落羽杉花粉萌发图；
图9为10倍镜下TA-CD池杉花粉萌发图；
图10为10倍镜下为TA-ZS池杉花粉萌发图；
图11为MTT染色后10倍镜下落羽杉花粉萌发图；
图12为MTT染色后20倍镜下落羽杉花粉萌发图；
图13为MTT染色后10倍镜下墨西哥落羽杉花粉萌发图；
图14为MTT染色后20倍镜下墨西哥落羽杉花粉萌发图；
图15为MTT染色后10倍镜下池杉花粉萌发图；
图16为MTT染色后20倍镜下池杉花粉萌发图。
实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例
落羽杉属供试植株：为种植于江苏落羽杉属国家林木种质资源库(32°3′13.85″N，118°49′42.16″E)的2个落羽杉基因型（TD-4、TD-5）、2个墨西哥落羽杉基因型（TM-A2、TM-A5）和2个池杉基因型（TA-CD、TA-ZS）。
花粉采集：2020年3月待供试植株雄球花成熟时，从树冠中上部剪取发育正常、无病虫害雄球花序，置于室温10～15℃、空气湿度为60%～70%的环境中进行水培，即将雄球花枝基部插入自来水中培养，待花粉散落时，收集花粉，放入干燥器内，于4℃冰箱内贮藏备用。
1、正交实验考察花粉离体培养条件
以采集的落羽杉TD-5花粉为材料，采用液体培养法，以蒸馏水为溶剂，设置4个水平的蔗糖质量浓度（0、5%、10%、15%）和4个水平的硼酸质量浓度（0、0.005%、0.01%、0.015%），进行L16(42)正交实验。将花粉与培养液配成0.01g/mL花粉溶液，用牙签搅拌均匀，置于温度为30℃、湿度为60%～70%的遮光环境中进行培养，每处理3个重复，12、24、36、48、60、72、96h后，取100μm花粉溶液置于载玻片，盖上盖玻片后于OlympusBX 53荧光显微镜显下统计花粉萌发率，每个载玻片观察不少于5个视野，每个视野不少于50粒花粉粒，统计花萌发率和花粉管萌发长度，筛选出落羽杉花粉离体萌发的最适培养基。
落羽杉花粉在不同浓度蔗糖和硼酸组合培养基上的萌发率见表1。由表1可知，落羽杉花粉在仅含硼酸的培养基中的萌发率为27.89%～58.23%（图1，对应仅含0.01%硼酸的处理），显著高于不含硼酸或含有蔗糖的培养基（0～7.38%）（图2-3，分别对应含有10%蔗糖、不含硼酸的处理和含有5%蔗糖+0.005%硼酸的处理），仅含硼酸的培养基中不同硼酸浓度间花粉萌发率差异显著。可见，适宜浓度的硼酸对花粉的萌发起到了较大的促进作用，蔗糖对落羽杉花粉萌发起到一定的抑制作用。
表1不同浓度蔗糖与硼酸组合对落羽杉花粉萌发率的影响
2、单因素实验考察硼酸浓度对花粉离体培养影响
以蒸馏水为溶剂，将硼酸质量浓度梯度设为0.006%、0.008%、0.01%、0.012%、0.014%、0.016%、0.018%、0.02%、0.022%、0.024%、0.026%、0.028%、0.03%。将花粉与培养液配成0.01g/mL花粉溶液，用牙签搅拌均匀，置于温度为30℃、湿度为60%～70%的环境中进行培养，每处理3个重复，12、24、36、48、60、72、96h后，取100μm花粉溶液置于载玻片，盖上盖玻片后于OlympusBX 53荧光显微镜显下统计花粉萌发率，每个载玻片观察不少于5个视野，每个视野不少于50粒花粉粒，统计花萌发率和花粉管萌发长度。
1）不同浓度硼酸对落羽杉花粉萌发率的影响
由表2可知，落羽杉花粉在硼酸浓度为0.006%～0.03%之间时其萌发率呈先升高后降低的趋势；当硼酸浓度为0.006%～0.01%之间时，花粉萌发率为30.05～55.7；当硼酸浓度为0.012%时花粉萌发率最高，为66.81%，显著高于其它硼酸水平；当硼酸浓度为0.016%～0.03%之间时，花粉萌发率由55.3%下降至16.64%。不同硼酸浓度间落羽杉花粉管长度为82.04～93.65μm，当硼酸浓度为0.01%～0.16%之间时，花粉管长度相对较大，0.006%和0.028%硼酸浓度下的花粉管长度显著小于其它硼酸水平。可见，硼酸浓度的大小对于落羽杉花粉萌发率和花粉管长度均具有显著影响，落羽杉花粉萌发培养基的最佳硼酸浓度为0.012%，该浓度下花粉萌发率为66.81%，花粉管长度平均为90.52%，最长可达178.1μm（图4），当硼酸浓度过小（＜0.008%）或过大（＞0.02%）时反而对花粉的萌发和花粉管的伸长起抑制作用。
表2不同浓度硼酸对落羽杉花粉萌发率的影响
2）0.012%硼酸浓度下不同培养时间对落羽杉花粉萌发影响
0.012%硼酸浓度下落羽杉花粉萌发率随培养时间的变化情况见表3。由表3可知，落羽杉花粉在培养24h后开始萌发，培养48h、60h、72h和96h萌发率和花粉管长度均无显著差异。可见，落羽杉花粉萌发最适离体培养时间为48h。
表3 落羽杉花粉萌发率随培养时间的变化
3）0.012%硼酸浓度下不同落羽杉属植株花粉的萌发活力比较
0.012%硼酸浓度下落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉花粉培养48h，各自活力的检测结果见表4。由表4可见，落羽杉属不同树种间及同一树种不同基因型间的花粉萌发率存在一定的差异，其中，落羽杉花粉萌发率为38.96%～66.81%（图5-6），墨西哥落羽杉花粉萌发率为42.77%～55.68%（图7-8），池杉花粉萌发率为50.36%～63.22%（图9-10）。
表4落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉花粉活力测定
4）离体培养发与MTT染色法相结合
鉴于花粉离体培养后花粉管颜色为透明状，与培养基颜色相近，不易鉴别和观察，因此对上述落羽杉属植物花粉离体培养法进行改良。具体方法是，利用上述浓度为0.012%的硼酸溶液为培养基，将落羽杉属植物花粉培养48h后取600μL置于2mL离心管中，1:1加入600μL0.4%的MTT染色液（用pH7.2的磷酸缓冲液配制），充分混匀后于30℃恒温培养箱静置30min；取100μm MTT染色后的花粉溶液置于载玻片上，盖上盖玻片后于显微镜显下统计花粉萌发率。利用该方法对落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉花粉活力进行观察，图11-12、图13-14、图15-16分别为落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉的检测结果。由上图可见，MTT染色后花粉及花粉管均呈蓝色，与培养基的灰白色形成鲜明对比，该方法相比于传统的不染色的离体培养方法，更便于花粉萌发率和花粉管长度的观测和统计，同时有利于对花粉萌发过程中花粉管内物质发育过程的观察。综上可见，本发明开发的花粉离体萌发法可有效应用于落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉等落羽杉属植物花粉活力的测定。
Claims (8)
1.一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，其特征在于，是浓度为0.008%～0.02%的硼酸水溶液；其落羽杉属植物为落羽杉。
2.根据权利要求1所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，其特征在于，是浓度为0.01%～0.018%的硼酸水溶液。
3.一种落羽杉属植物花粉离体萌发培养基，其特征在于，是浓度为0.012%的硼酸水溶液，其落羽杉属植物为落羽杉、墨西哥落羽杉和池杉。
4.一种利用权利要求1-3任一所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，其特征在于，包括：采集落羽杉属植物的花粉，将花粉与所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基搅配成花粉溶液，在一定条件下培养一段时间后，取一部分花粉溶液使用MTT染色液进行染色后置于载波片上，于显微镜下观察并统计视野内花粉的萌发率或花粉管萌发长度。
5.根据权利要求4所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，其特征在于，所述采集落羽杉属植物的花粉具体为：当落羽杉属植物的雄球花成熟时，从树冠中上部剪取发育正常、无病虫害雄球花序，置于室温10～15℃、空气湿度为60%～70%的环境中进行水培，待花粉散落时，收集花粉，放入干燥器内，于4℃冰箱内贮藏备用。
6.根据权利要求4所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，其特征在于，所述的一定条件具体为：温度为30℃、湿度为60%～70%的遮光环境。
7.根据权利要求4所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，其特征在于，所述的一定时间具体为：12~96h。
8.根据权利要求4所述的落羽杉属植物花粉离体萌发培养基培养测定花粉活力的方法，其特征在于，所述的使用MTT染色液进行染色具体为：是用pH7.2的磷酸缓冲液将MTT配置成0.4%的溶液，MTT染色方法是取600μL培养48小时的花粉溶液置于2mL离心管中，1:1加入600μL 0.4%MTT染色液，充分混匀后，30℃恒温培养箱静置30min。
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