CN108753680A - 一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物有性繁殖技术领域，公开了一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，其将采集的郁香忍冬花粉分散在培养液中，置于培养箱中培养3h左右，培养温度设定为9～18℃；所述培养液的组分包括质量分数为15%～45%的蔗糖和浓度为100～300mg/L的硼酸溶液。优选地，以质量分数30%的蔗糖+100 mg/L硼酸溶液作为离体花粉培养液，置于温度为12℃的培养箱中培养3h，郁香忍冬新鲜花粉的萌发率可达96.28%。本发明适用于郁香忍冬离体花粉活力测定，操作简便易行，可重复性高，数据准确可靠，能够为郁香忍冬花粉的离体保存、品种改良提供依据。

Description

一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，涉及一种植物花粉的培养萌发方法，具体涉及一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法。

背景技术

郁香忍冬（Lonicera fragrantissima Lindl. et Paxt.），又名香忍冬，羊奶子，香吉利子，是忍冬科忍冬属的一种半常绿灌木，冬末春初先花后叶，花香浓郁，是北方早春季节重要的芳香类花木，观赏价值较高，郁香忍冬鲜叶中绿原酸含量较高，有重要的药用价值，其果实性状奇特，色泽艳丽，果味甜爽，营养丰富，具有较高的开发应用价值。郁香忍冬性状优良，是忍冬属植物杂交育种优秀的亲本材料，但由于其开花较早（花期2月中旬-3月初），与该属其他近缘种花期（4月-6月）不遇，限制了育种工作的开展。

花粉作为植物的雄配子体，在有性生殖中发挥着重要作用，在杂交育种工作中，为解决亲本花期不一致和远距离杂交的问题，需要保存有生活力的花粉，采集和贮存的花粉，使用之前必须进行生活力的鉴定，以估价花粉是否有授精能力。目前，对于郁香忍冬的研究主要集中于种质资源调查（郭现清.河南省郁香忍冬种质资源调查与开发利用研究[D].南京:南京林业大学,2006）、花蕾化学成分（刘华清等.郁香忍冬花蕾化学成分研究[J].中药材,2014,37(08):1383-1385）、扦插繁殖（赵迎春.三种花灌木的扦插繁殖技术研究[D].南京:南京农业大学,2010）等，对于花粉活力检测的方法还未见报道。

专利CN 201611121492.5记载了一种金银忍冬花粉超低温保存方法，将新鲜金银忍冬花粉从发育良好的母树上在开花当天13:30左右采集后装入1.8ml的冻存管中，即在采后初始含水量为13％～14％左右时将装有花粉的冻存管投入﹣196℃液氮罐中保存，随后采用自来水化冻5min的方式进行化冻。但本专利并没有涉及金银忍冬花粉的萌发培养技术。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法。本发明的技术方案弥补了郁香忍冬离体花粉萌发培养领域的技术空白，为其花粉活力的检测及新品种选育提供参考依据。同时，采用本发明所述郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，可稳定、有效地检测郁香忍冬花粉活力，为杂交育种工作的开展提供了依据。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，其将采集的郁香忍冬花粉分散在培养液中，置于培养箱中培养3h左右，培养温度设定为9～18℃；所述培养液的组分包括质量分数为15%～45%的蔗糖和浓度为100～300mg/L的硼酸溶液。

作为所述方法的进一步优化，所述郁香忍冬花粉的采集时间为上午9:00～10:00，选择当日散粉的郁香忍冬花朵。

作为所述方法的进一步优化，所述蔗糖的质量分数为30%～45%。

作为所述方法的进一步优化，所述蔗糖的质量分数为30%～35%。

作为所述方法的进一步优化，所述蔗糖的质量分数为30%，硼酸浓度为100mg/L。

作为所述方法的进一步优化，所述培养温度设定为12℃。

在上述参数优化的基础上，所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，其包括以下步骤：

1）花粉的收集和处理

于上午9:00～10:00选择当日散粉的郁香忍冬花朵采集花粉，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉；采集的新鲜花粉直接使用或贮存；

2）配制培养液

所述培养液的组分包括质量分数为15%～45%的蔗糖及浓度为100～300mg/L的硼酸溶液；

3）在载玻片上滴加培养液，将花粉分散在培养液中，载玻片放入培养皿中，置于培养箱中培养3h左右，培养温度设定为9～18℃；

4）观察花粉萌发情况

用显微镜观察载玻片上花粉的萌发情况，随机选取3个视野，每个视野不少于50粒花粉，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数；

5）计算花粉的萌发率

花粉萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100，计算3个视野的花粉萌发率，并取平均值。

作为所述方法的进一步优化，所述培养皿中铺有湿润滤纸，保持培养皿内环境湿润，以免培养液蒸发而引起浓度变化。

作为所述方法的进一步优化，所述观察花粉萌发情况是以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个视野不少于50粒花粉。

作为所述方法的进一步优化，所述郁香忍冬为其原亚种（Lonicera fragrantissima Lindl. & Paxt. subsp. fragrantissima）。

与现有技术相比，本发明的有益效果或优点主要体现在以下方面：

本发明提供了一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，郁香忍冬离体花粉分散在培养液中，置于9～18℃培养箱中培养3h左右；所述培养液的组分包括质量分数为15%～45%的蔗糖及浓度为100～300mg/L的硼酸溶液，经培养的郁香忍冬离体花粉具有较高的活力。进一步优选地，新鲜的郁香忍冬离体花粉在本发明提供的培养液组分为30%的蔗糖+100mg/L硼酸溶液中，在12℃的培养条件下，培养3h后，其萌发率可达96.28%。由此可知，采用本发明所述培养方法培养郁香忍冬离体花粉，郁香忍冬离体花粉萌发率高，适合其花粉活力的测定。

目前，常用的花粉活力测定的方法有I-IK染色测定法，过氧化物酶测定法和氯化三苯基四氮唑法（TTC法）。I-IK法染色快，并且染色清晰，但缺点是生活力弱的花粉也被染色，这容易导致检测结果偏高，误差较大。过氧化物酶法和TTC法操作复杂，并且需时长，染色不清晰，在实际育种工作中，不推荐使用这2种方法用于快速检测花粉活力。通过本发明的试验发现，采用适宜浓度的蔗糖-硼酸溶液并在合适的温度下培养离体花粉，可保证有生活力的花粉正常萌发，并且统计方法明确，因此运用此方法测定花粉活力，其结果易于观察，便于统计，可重复性高，所得数据准确可靠，能够为郁香忍冬花粉的离体保存、品种改良提供依据。

附图说明

图1是不同蔗糖浓度和培养温度对郁香忍冬离体花粉萌发率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明，对本发明并没有限制。

实施例1

以陕西省西安植物园内的郁香忍冬为例对本发明作进一步的详细说明。本实施例所述郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，所用离体花粉为郁香忍冬的新鲜花粉。

3月中旬，在西安植物园园区选择生长健壮，无病虫害的郁香忍冬植株于上午9:00～10:00摘取当日散粉的花朵，置于硫酸纸上，迅速带回实验室，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉。

（1）蔗糖浓度试验

分别配制质量分数为15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%的蔗糖溶液，备用。

用移液器在载玻片上滴1滴蔗糖溶液，用大头针轻轻粘取花粉后，迅速放入在蔗糖溶液并轻晃，使花粉散开，培养3h后，观察花粉萌发情况。统计时以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个处理进行3次重复，每重复随机选取3个视野，每个视野不少于50粒花粉，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数，计算花粉的萌发率，取平均值。

萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

（2）温度试验

分别设置9℃、12℃、15℃、18℃ 4个温度梯度，培养3h，观察郁香忍冬离体花粉萌发情况，统计萌发率。

萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

蔗糖浓度试验与温度试验的结果见图1。从图1可以看出，蔗糖溶液浓度在15%～35%的范围内，花粉萌发率随蔗糖浓度的增大而提高，蔗糖浓度为35%时，萌发率达到最高，当蔗糖浓度大于35%时，萌发率呈下降趋势，由此可见，仅以蔗糖溶液为培养液时，浓度35%适宜郁香忍冬花粉萌发。另外，图1进一步揭示出，培养温度与郁香忍冬花粉萌发率的关系，在9℃、12℃、15℃、18℃四种温度条件下培养，花粉萌发率的最高值出现在蔗糖浓度35%，培养温度12℃时，其萌发率达77.77%，随着温度升高，萌发率下降。

实施例2

以陕西省西安植物园内的郁香忍冬为例对本发明作进一步的详细说明。本实施例所述郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，所用离体花粉为郁香忍冬的新鲜花粉。

3月中旬，在西安植物园园区选择生长健壮，无病虫害的郁香忍冬植株于上午9:00～10:00摘取当日散粉的花朵，置于硫酸纸上，迅速带回实验室，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉。

分别配置质量分数为30%的蔗糖+浓度为100、200、300 mg/L的硼酸溶液和质量分数35%的蔗糖+浓度为100、200、300 mg/L的硼酸溶液，以不加硼酸的蔗糖溶液为对照，优化适宜郁香忍冬花粉萌发的培养液配比。

用移液器在载玻片上滴1滴培养液，用大头针轻轻粘取花粉后，迅速放入在培养液并轻晃，使花粉散开，置于培养箱中12℃培养3h后，观察花粉萌发情况。统计时以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个处理进行3次重复，每重复随机选取3个视野，每个视野不少于50粒花粉，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数，计算花粉的萌发率，取平均值。试验结果见表1。

萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

表1 硼酸浓度对花粉萌发率的影响

表1结果显示，30%蔗糖溶液中加入100 mg/L硼酸，花粉萌发率显著提高，达96.28%，数据分析显示，其萌发率与对照差异极显著。随着硼酸浓度的增大，萌发率呈下降趋势。在35%蔗糖加入硼酸，硼酸浓度对花粉萌发率的影响变化趋势相同。

实施例3

3月15日，在西安植物园园区选择生长健壮，无病虫害的郁香忍冬植株于上午9:00—10:00摘取当日散粉的花朵，置于硫酸纸上，迅速带回实验室，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉，室内自然阴干48h后，分别置于-20℃、室温和5℃贮存。

分别在3月22日、3月28日、4月7日、4月17日和4月26日配制质量分数为30%的蔗糖+100 mg/L硼酸的培养溶液。

用移液器在载玻片上滴1滴培养溶液，用大头针轻轻粘取花粉后，迅速放入在培养溶液并轻晃，使花粉散开，置于培养箱中12℃培养3h后，观察花粉萌发情况。统计时以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个处理进行3次重复，每重复随机选取3个视野，每个视野不少于50粒花粉，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数，计算花粉的萌发率，取平均值。试验结果见表2。

萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数X100。

表2 不同贮藏温度对阴干花粉萌发率的影响

表2结果显示，本实施例所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法，适用于郁香忍冬阴干花粉活力的测定。

本发明通过对不同培养液组分、不同培养温度的探讨，发明了一种快速、准确测定郁香忍冬离体花粉活力的方法，可适用于离体花粉不同状态的（新鲜花粉、贮藏后等）活力检测，对其杂交育种工作的开展提供了一定的参考依据。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (10)

1.一种郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，将采集的郁香忍冬花粉分散在培养液中，置于培养箱中培养3h左右，培养温度设定为9～18℃；所述培养液的组分为质量分数15%～45%的蔗糖及浓度为100～300mg/L的硼酸溶液。

2.根据权利要求1所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述郁香忍冬花粉的采集时间为上午9:00～10:00，选择当日散粉的郁香忍冬花朵。

3.根据权利要求1所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述蔗糖溶液的质量分数为30%～45%。

4.根据权利要求3所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述蔗糖溶液的质量分数为30%～35%。

5.根据权利要求1所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述培养液中蔗糖质量分数为30%，硼酸浓度为100mg/L。

6.根据权利要求1所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述培养温度设定为12℃。

7.根据权利要求1所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，包括如下步骤：

1）花粉的收集和处理

于上午9:00～10:00选择当日散粉的郁香忍冬花朵，采集花粉，用毛刷轻刷已散粉的花粉囊，收集花粉；采集的新鲜花粉直接使用或贮存；

2）配制培养液

所述培养液的组分为质量分数为15%～45%的蔗糖及浓度为100～300mg/L的硼酸溶液；

3）在载玻片上滴加培养液，将花粉分散在培养液中，载玻片放入培养皿中，置于培养箱中培养3h左右，培养温度设定为9～18℃；

4）观察花粉萌发情况

用显微镜观察载玻片上花粉的萌发情况，随机选取3个视野，每个视野不少于50粒花粉，统计萌发的花粉数和视野内花粉粒总数；

5）计算花粉的萌发率

花粉萌发率（%）=萌发的花粉数/视野内花粉粒总数*100，计算3个视野的花粉萌发率，并取平均值。

8.根据权利要求7所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述培养皿中铺有湿润滤纸，保持培养皿内环境湿润，以免培养液蒸发而引起浓度变化。

9.根据权利要求7所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述观察花粉萌发情况是以花粉管长度超过花粉粒直径为萌发标准，每个视野不少于50粒花粉。

10.根据权利要求1或2或7所述的郁香忍冬离体花粉萌发的培养方法， 其特征在于，所述郁香忍冬为其原亚种（Lonicera fragrantissima Lindl. & Paxt. subsp.fragrantissima）。