CN112608358A - 一种促进花粉萌发的化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进花粉萌发的化合物及其应用，所述化合物具有式I所示的结构，其中，X为‑C(O)‑或‑(R₉)C(R₁₀)‑；R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地选自H、烷基、烷氧基、烷氨基、卤代烷基、羟烷基、氨基、羟基、卤素、酯基。式I化合物能够有效地促进植物花粉萌发，有助于提高植物的授粉效率。同时，包含式I化合物的花粉萌发促进剂具有可逆性和浓度可调性，容易从模式植物拓展到经济作物，为农业生产提供科学理论依据并且具备潜在的实用价值，有望在科研基础上开发出促进作物授粉效率的新型试剂。

Description

一种促进花粉萌发的化合物及其应用

技术领域

本发明涉及植物培育技术领域，具体涉及一种化合物在促进花粉萌发中的用途及促进花粉萌发的方法。

背景技术

花粉萌发产生花粉管是植物有性生殖的关键过程之一。先前研究发现成熟的花粉粒需经粘附、水合，形成花粉管，并导向胚珠，经过花粉管爆炸释放精子，来完成植物受精过程(Williams,J.H.,Reese,J.B.(2019).Current Topics in Developmental Biology131,299-336)。成熟花粉参与受精过程受到多个基因的分步骤调控，例如NPG1、ROPs、RALFs等参与花粉萌发及后续步骤(Ge,Z.,et al.(2017).Arabidopsis pollen tube integrityand sperm release are regulated by RALF-mediated signaling.Science 358,1596-1600)；并有多种生化小分子参与其中，例如类黄酮(McCormick,S.(2004).Control ofmale gametophyte development.Plant Cell 16,S142-S153)。

植物自交不亲和性是植物花粉与雌蕊相互识别，防止其近亲繁殖的重要机制，是被子植物进化迅速的原因之一(Wu,J.,et al.(2013).Molecular Determinants andMechanisms of Gametophytic Self-Incompatibility in Fruit Trees ofRosaceae.Critical Reviews in Plant Sciences 32,53-68)。蔷薇科果树如梨、苹果、李子等表现出自交不亲和性(张绍铃等，蔷薇科果树自交不亲和性分子机制研究进展[J].南京农业大学学报,2012,35(05):53-63)。梨起源于我国，是我国第三大果树。截止2020年国际粮农组织(FAO,www.fao.org)的统计结果，中国梨的栽培面积达1406.4万亩、产量1619.6万吨，具有重要的经济和社会价值。同时我国梨栽培面积及产量均占国际总量的70％以上，稳居世界第一，具有举足轻重的作用。梨是典型的自交不亲和性树种，栽培上必须要配置授粉树或人工授粉，才能够获得相应的产量。因此，授粉对于梨树生产和育种来说都是非常必要的环节，而花粉的质量直接影响了授粉的效果和质量。通常，用于梨授粉的品种花粉新鲜采集后活力高，尽早用于授粉效果最佳。但是在生产和育种上由于花期不遇的问题，经常需要提前采集并贮藏花粉待用，有些花粉甚至需要保存到下一年使用以满足品种的授粉需求。而花粉在贮藏过程中很容易失去活性，萌发率显著下降，从而影响授粉效果。因此，寻找一种提高贮藏花粉萌发率的方法对于梨产业发展具有重要的意义。

传统的通过敲除或敲低基因表达量的遗传学方法已经发现了很多在花粉发育中起重要调控作用的基因和信号通路，但传统的遗传学方法在寻找有冗余或者突变致死的基因中存在明显的短板。化学遗传学可以有效克服传统遗传学不可避免的基因冗余和致死性效应，因为化合物可以同时靶标一组具有相同结构域的同源蛋白并且可以通过精确调控施加浓度避免致死性效应。同时，化合物施加也具有可逆性和时间、浓度可调性，因而能够实现对植物表型的精细调控。

然而，目前适用于促进花粉萌发的化合物仍有待研究。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了一种化合物在促进花粉萌发中的用途，所述化合物具有式I所示的结构：

其中，X为

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地选自H、烷基、烷氧基、烷氨基、卤代烷基、羟烷基、氨基、羟基、卤素、酯基。

上述烷基优选为C_1～6烷基，更优选为C_1～4烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基。

上述烷氧基是指具有-OR结构的取代基，其中R为烷基，优选为C_1～6烷基，更优选为C_1～4烷基；所述烷氧基例如甲氧基、乙氧基、丙氧基。

上述烷氨基是指氨基上的一个或两个H被烷基取代的、即具有-N(R')-R结构的取代基，R和R'均为烷基，或者一个为氢、另一个为烷基，其中所述烷基优选为C_1～6烷基，更优选为C_1～4烷基。

上述羟烷基是指具有-R-OH结构的取代基，R为亚烷基，优选为C_1～6亚烷基，更优选为C_1～4亚烷基。

上述卤代烷基是指给一个或多个卤素取代的烷基，优选为C_1～6卤代烷基，更优选为C_1～4卤代烷基。

上述卤素指氟、氯、溴或碘。

上述酯基优选为具有-O-C(O)-R结构的取代基，其中R为氢或烷基，所述烷基优选为C_1～6烷基，更优选为C_1～4烷基。

下面式Ia至式Id给出了式I化合物的几个具体结构：

本发明研究发现，式I化合物能够有效地促进花粉萌发，有助于植物提高坐果率，有望在科研基础上开发出促进作物花粉萌发提高坐果率的新型试剂。

根据本发明的实施例，所述花粉来源于双子叶植物，包括蔷薇科植物梨和十字花科植物拟南芥。

在本发明的另一方面，提供了一种花粉萌发促进剂，所述花粉萌发促进剂包含所述式I化合物。

需要说明的是，本发明所提供的花粉萌发促进剂既可以只含有式I化合物，待使用时，与其他外源附加剂(例如溶剂水)混合后施加于花粉上；该花粉萌发促进剂中也可以同时含有式I化合物和附加剂，两者可以混合物的形式提供，也可以独立包装的形式提供，待使用时再进行混合，具体可以根据实际情况灵活选择，本发明不作严格限定。

根据本发明的实施例，所述花粉萌发促进剂进一步含有附加剂，所述花粉萌发促进剂中所述式I化合物的浓度为1μM～10μM。发明人发现，在此条件下能够有效地促进花粉萌发。具体地，附加剂包括二甲基亚砜(DMSO)。由此，以便于溶解式I化合物。

在本发明的又一方面，提出了一种促进花粉萌发的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使花粉与前面所述花粉萌发促进剂接触。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地促进花粉萌发，有助于植物坐果率。同时，因为该花粉萌发促进剂施加具有可逆性和浓度可调性，容易从模式植物拓展到经济作物，为农业生产提供科学理论依据并且具备潜在的实用价值，有望在科研基础上开发出促进作物花粉萌发从而提高坐果率的新型试剂。

根据本发明的实施例，在所述花粉处于萌发初始阶段，使所述花粉萌发促进剂接触。在花粉处于萌发初始阶段时，向花粉施加花粉萌发促进剂，可以有效地促进花粉萌发。

附图说明

图1为本发明促进花粉萌发的化合物结构式。

图2显示了本发明实施例1中不同浓度梯度的PGP1对拟南芥新鲜花粉萌发的影响，其中(a)为在不同浓度PGP1作用下，花粉萌发3hr后的显微照片；(b)为Image J软件统计的花粉萌发率；

图3显示了根据本发明实施例2中不同浓度梯度的PGP1对梨贮藏花粉萌发的影响，其中(a)为在不同浓度PGP1作用下，梨树早熟品种苏翠1号花粉萌发4hr后的显微照片；(b)为在不同浓度PGP1作用下，梨树中熟品种凉丰花粉萌发4hr后的显微照片；(c)为在不同浓度PGP1作用下，梨树中晚熟品种早酥红花粉萌发4hr后的显微照片；(d)为Image J软件统计的花粉萌发率。

具体实施方式

下面将结合附图，通过实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

式Ia～Id化合物均具有相近的功能，下面以式Ia所示化合物(命名为PGP1(PollenGermination Promoting One))为例，对其功能进行描述。

实施例1

为了探索PGP1调控植物花粉萌发的生物学机制，本发明首先以模式植物拟南芥为实验材料，测试了不同浓度PGP1对花粉萌发的促进作用，具体步骤如下：

(1)配制花粉萌发培养基，并分装到1.5mL的EP管中，每管1mL(配方：0.01％硼酸，5mM CaCl₂，5mM KCl，1mM MgSO₄，18％蔗糖)。在1mL液体培养基中加入0.012～0.014g的低熔点琼脂糖；将EP管放在热水中，等液体澄清为止(为融解充分，可中途换一次热水)；吸取60～80μL液体，均匀地分布在玻底皿中(若需要添加PGP1，则在培养基冷却到合适温度时，加入所需浓度的PGP1溶液，混合均匀后再加到玻底皿中)；室温放置4～8min，等培养基凝固后，可用封口膜封住待用。

(2)选取十字打开的花朵，将其粘在带有双面胶的载玻片上；用镊子依次取出一根花药，将花粉粒均匀地涂抹在固体培养基上(花粉粒的萌发带有群体效应，所以花粉粒数目尽量要多，并且均匀分布)。

(3)用封口膜封住培养皿口，将培养皿放置在22℃温箱中培养(注：合适的湿度也是萌发率的保证，若天气干燥，可以用保湿盒进行保湿)。

(4)大约萌发3hr后，将培养皿置于显微镜下观察，拍照(注：为了方便统计，需添加标尺)。

(5)使用Image J软件，统计花粉的萌发率。每一处理至少统计2000粒花粉，实验重复三次，促进的效果一致。

实验结果如图2、表1所示，PGP1在1μM时对拟南芥花粉管的萌发开始有促进作用，在10μM浓度时这种促进作用尤为明显，而当浓度高于100μM时，花粉管的萌发开始出现抑制。

表1 PGP1对拟南芥花粉萌发率的影响

实施例2

在该实施例中，分别以早熟、中熟、晚熟品种梨树的贮藏花粉为实验材料，测试了不同浓度PGP1对贮藏花粉萌发的促进作用，具体步骤如下：

(1)花粉采集后，外包一层硫酸纸，存放于储物盒中，并在储物盒内放入硅胶，于-20℃冰箱长期低温、干燥保存。

(2)经1年贮藏后，从-20℃冰箱取出保存花粉的储物盒，先置于4℃冰箱放置6-10hr，再于25℃室温条件下放置2-4hr。

(3)配置液体培养基A(100mL)：称量10g蔗糖，0.03g硝酸钙，0.01g硼酸，0.5856gMES，10g PEG于100mL烧杯中，用双蒸水(RO水)溶解，量筒放在磁力搅拌器上，量筒中放入小磁力转子，打开磁力搅拌器搅拌3-5min后使试剂充分溶解。最后，用Tirs缓冲液将液体培养基pH调至6.2--6.3。

(4)PGP1分子量为302.4，用千分天平称量试样0.0324g于1.5mL离心管中，3000rpm离心3min，吸取1mL DMSO溶液于1.5mL离心管中溶解试样，使用涡旋仪涡旋30s，使试样在DMSO溶液充分溶解，最终配成母液A，当前试样溶液浓度为0.1M。

(5)在10mL离心管中加入9.9mL DMSO溶液，再加入0.1mL母液A，最终配成母液B，当前试样溶液浓度为1mM。

(6)在2mL离心管中加入2μL母液B，再加入198μL液体培养基A，配置成液体培养基B，当前试样溶液浓度为10μM。

(7)用牙签沾取花粉(1-2下)，将沾取的花粉加入含液体培养基B的2mL离心管中，使用涡旋仪涡旋30sec，使花粉与培养液充分混匀。

(8)将2mL离心管放置于25℃、100-120rpm的摇床上，避光培养4hr。

(9)取出2mL离心管，吸取20μL于载玻片上，涂匀。

(10)显微镜观察：4倍镜视野下观察花粉萌发率、花粉管长度，并使用ISCapture成像软件拍照(每个载玻片拍4个视野图)。

(11)使用软件ipwin32对所拍照片进行处理，Measure--Manual Tag观察萌发率(对视野内所有花粉均进行统计)。

(12)用软件SPSS对结果进行差异显著性分析。

实验结果如图3、表2所示，PGP1对梨树花粉的萌发有促进作用，在10μM浓度时这种促进作用尤为明显，而当浓度高于100μM时，花粉管的萌发开始出现抑制。

表2 PGP1对梨花粉萌发率的影响

综上所述，PGP1在1-10μM浓度时，对不同科属的植物的花粉萌发都有促进作用，不论新鲜花粉还是贮藏花粉。

Claims (10)

1.式I化合物在促进花粉萌发中的用途：

其中，X为

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地选自H、烷基、烷氧基、烷氨基、卤代烷基、羟烷基、氨基、羟基、卤素、酯基。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述烷氨基是指氨基上的一个或两个H被烷基取代的、具有-N(R')-R结构的取代基，其中R和R'均为烷基，或者一个为氢、另一个为烷基。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述羟烷基是指具有-R-OH结构的取代基，其中R为亚烷基。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述酯基是指具有-O-C(O)-R结构的取代基，其中R为氢或烷基。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述烷基为C_1～6烷基，所述卤素为氟、氯、溴或碘。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述式I化合物选自下列化合物之一：

7.一种花粉萌发促进剂，所述花粉萌发促进剂包含权利要求1～6中任一所述的式I化合物。

8.如权利要求7所述的花粉萌发促进剂，其特征在于，所述花粉萌发促进剂还包括附加剂，所述附加剂为式I化合物的溶剂，所述花粉萌发促进剂中所述式I化合物的浓度为1μM～10μM。

9.一种促进花粉萌发的方法，将花粉与权利要求7所述的花粉萌发促进剂接触。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述花粉来源于蔷薇科植物梨或十字花科植物拟南芥。

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