CN107155874B - 一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基 - Google Patents

一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基，属于植物细胞工程技术领域。所述方法包括以下步骤：摘取现蕾期至初花期的马铃薯四倍体栽培种花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h；花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基，在30～35℃条件下处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d；将获得的花药愈伤组织，转入分化培养基中进行分化培养60～80d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养30‑50d，获得马铃薯小苗；将马铃薯小苗转入生根培养基中培养，获得马铃薯完整植株。试验表明，分化率达到6.1～16.9％，成功获得双单倍体植株。

Description

一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培 养基
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)为茄科茄属植物，是重要的粮食和蔬菜兼用作物。目前，我国马铃薯的生产与消费均居于世界前列，其种植面积约600万公顷，总产量达1亿吨。宁夏南部山区是我国重要的马铃薯优势产区，气候特点及土壤条件十分适合马铃薯的生长和干物质的积累，生产出的马铃薯淀粉含量高、品质好。至2015年，马铃薯已成为宁夏第一大种植作物，种植面积超过24万公顷，在当地农业产业结构调整、保障粮食安全及农村经济发展中发挥着重要作用。
马铃薯种植区多分布在土壤贫瘠的南部山区和中部干旱区，水资源缺乏、干旱、冷害等非生物胁迫频发，加之生产中使用的品种单一，对马铃薯的产量及质量常常造成严重损失，极大地影响了我区马铃薯产业均衡、可持续发展。随着当前马铃薯主粮化战略的推进，在与其他三大主粮不争地的前提条件下，生产上亟需选育具有优良农艺性状、抗逆性强的马铃薯品种，进一步提高马铃薯单产水平，是满足马铃薯产业的发展和保障粮食安全的必然要求。由于马铃薯属于同源四倍体植物，遗传背景狭窄，采用常规育种手段创制马铃薯新种质的困难越来越大，迫切需要通过生物技术手段促进品种选育。花药培养技术是迄今为止创造纯和基因型最有效手段，在育种工作中，利用这项技术除可以大大缩短种质材料的纯化时间，对杂交F1、F2代的花药培养可选择出特异的性状外，还可通过花药培养方法建立DH群体，直接获得纯化品系，作为育种中间材料或亲本育种新品种。
将生物技术育种结合于常规育种中，已成为当代作物遗传育种的重要特点。应用花药培养降低作物倍性获得的单倍体植株，无论是在作物的育种，还是在遗传图谱构建、重要性状QTL定位及基因的克隆筛选等分子生物学研究都具有重要应用价值。虽然我国马铃薯花药培养尽管在上世纪80年代初就已经开展，但仍存在着基因型限制、成胚率低等需要克服的问题，限制了单倍体育种技术在育种实践中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基，所述方法受基因型的限制小，具有较高的分化率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。
优选的，所述赤霉素在MS培养基中的质量浓度为0.5mg/L。
优选的，所述6-苄氨基嘌呤在MS培养基中的质量浓度为2.0mg/L。
优选的，所述玉米素在MS培养基中的质量浓度为3.0mg/L。
本发明还提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，包括以下步骤：
1)在马铃薯现蕾期至初花期的花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h；
2)将所述步骤1)中预处理后的花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件下高温处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d，光照条件为黑暗24h，获得花药愈伤组织；
3)将所述步骤2)诱导获得的花药愈伤组织，转入所述分化培养基中进行分化培养d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养30～50d，获得马铃薯小苗；
4)将所述步骤3)中继代分化出的马铃薯小苗转入生根培养基中生根培养，获得马铃薯花药培养完整植株。
优选的，所述步骤1)中花蕾长度为4～6mm；花蕾的采集时间为上午9:00～10:00；花蕾的形态为花瓣与花萼等长。
优选的，所述步骤2)中花药的长度为2～3mm，花药的颜色为绿色。
优选的，所述步骤2)中诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，包含附加物和植物激素；
所述附加物为下列质量含量的组分：硝酸银30～50mg/L，活性炭1.5～3g/L，蔗糖6％，琼脂0.4～0.6％；
所述植物激素包括以下重量含量组分：1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸，1mg/L激动素。
优选的，所述步骤3)中分化培养和继代培养的光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为22～26℃。
优选的，所述步骤4)中生根培养基为以MS培养基为基础培养基，包含质量浓度为0.050.1mg/L的萘乙酸、质量浓度为1.5％的蔗糖和质量浓度为0.4～0.6％琼脂；所述步骤4)中培养时间为30～40d。
本发明提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂。所述培养基通过将赤霉素、6-苄氨基嘌呤和玉米素添加到MS培养基中，大大提高了马铃薯花药培养的培养效率，分化率达到6.1～16.9％，较其他常规分化培养基提高了60～120％。
本发明提供的一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，通过严格限定花药取材时期及花药低温和高温处理，经花药愈伤组织诱导培养基诱导以及分化培养基分化，获得花药培养植株。与其他马铃薯花药培养方法相比，受基因型限制更小，花药培养植株更易获得，实施例中采用所述方法对7个马铃薯四倍体栽培种(系)花药培养的研究试验表明，7个品种的花药愈伤组织诱导率达到8.0～31.7％，其中5个品种(系)可成功分化诱导出花药植株。通过倍性分析仪的鉴定，筛选获得了双单倍体植株。因此，所述方法为马铃薯倍性育种研究提供重要的理论与实践。
附图说明
图1为实施例4中马铃薯接种花药与对应的减数分裂时期；
图2为实施例4中马铃薯花药诱导出的愈伤组织；
图3为实施例4中马铃薯花药愈伤组织分化出苗；
图4为实施例4中马铃薯花药培养植株的倍性鉴定；
图5为实施例4中马铃薯栽培种及其花药培养双单倍植株形态比较。
具体实施方式
本发明提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包括以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。
本发明中，所述赤霉素在MS培养基中的质量浓度优选为0.5mg/L。本发明对赤霉素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的赤霉素的来源即可。本发明实施例中，所述赤霉素购自北京酷莱博生物技术有限公司。
本发明中，所述6-苄氨基嘌呤在MS培养基中的质量浓度优选为2mg/L。本发明对6-苄氨基嘌呤的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的6-苄氨基嘌呤的来源即可。本发明实施例中，所述6-苄氨基嘌呤购自北京酷莱博生物技术有限公司。
本发明中，所述玉米素在MS培养基中的质量浓度优选为3mg/L。本发明对玉米素的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的玉米素的来源即可。本发明实施例中，所述玉米素购自北京酷莱博生物技术有限公司。
本发明中，所述蔗糖在MS培养基中的质量浓度优选为3％。本发明对蔗糖的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的蔗糖的来源即可。本发明实施例中，所述蔗糖购自国药集团化学试剂有限公司。
本发明中，所述琼脂在MS培养基中的质量浓度优选为0.5％。本发明对琼脂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的琼脂的来源即可。本发明实施例中，所述琼脂购自北京酷莱博生物技术有限公司。
本发明中，所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。所述MS培养基的原料的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。所述MS培养基的制备方法优选参照Murashige&Skoog(1962)的方法配制。
本发明中，所述分化培养基的pH值优选为5.6～6.0，更优选为5.8。
本发明中，所述分化培养基的配制方法包括以下步骤：
A.向上述配制得到的MS培养基中添加蔗糖与琼脂，再添加赤霉素、6-苄氨基嘌呤和玉米素，最后以1mol/LHCl或1mol/LNaCl调节培养基pH值。
分化培养基的灭菌方法采用高压蒸汽灭菌、灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15～20min。
本发明还提供了一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，包括以下步骤：
1)摘取现蕾期至初花期的花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h；
2)将所述步骤1)中预处理后的花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件下高温处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d，获得花药愈伤组织；
3)将所述步骤2)诱导获得的花药愈伤组织，转入上述方案得到的分化培养基中进行分化培养60～80d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养30～50d，获得马铃薯小苗；
4)将所述步骤3)中继代分化出的马铃薯小苗转入生根培养基中生根培养，获得马铃薯花药培养完整植株。
本发明将摘取现蕾期至初花期的花蕾放入4～6℃环境中预处理48～72h。
本发明中，所述花蕾长度优选为4～6mm，更优选为5mm。花蕾的采集时间优选为上午9:00～10:00，有利于保持花药活力。花蕾的形态优选为花瓣与花萼等长。
本发明中，所述花蕾优选放入5℃环境中。预处理的时间优选为55～65h，更优选为60h。本发明中，所述花蕾低温处理的目的是促进雄核发育以提高花粉植株诱导频率。
得到预处理后的花蕾后，本发明将所述花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件下高温处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d，光照条件为黑暗24h，获得花药愈伤组织。
本发明中，所述灭菌的方法优选为先将花蕾置于75％酒精溶液中表面灭菌30s，无菌水冲洗1次，随后置于0.1％升汞溶液中表面消毒8min，无菌水冲洗3～4次，每次2～3min。
本发明中，所述挑取花药的方法优选将灭菌后的花蕾放置在无菌试纸上，用镊子夹住花蕾的基部，接种针划开花蕾表面挑取花药随即接种于诱导培养基中。
本发明中，所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的接种方法即可。所述接种量优选为盛有培养基的50ml三角瓶中每瓶接种花药10～15枚。
本发明中，所述花药的长度优选为2～3mm，花药的颜色优选为绿色。
本发明中，所述诱导培养基优选以MS培养基为基础培养基，包含附加物和植物激素；
所述附加物优选包括下列质量含量的组分：硝酸银30mg/L，活性炭3g/L，蔗糖6％和琼脂0.6％；
所述植物激素优选包括以下重量含量组分：1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸和1mg/L激动素。
所述诱导培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的配制方法即可。
本发明中，所述高温处理的温度优选为34℃。所述高温处理的时间优选为48～72h。所述诱导培养的温度优选为25℃。所述诱导培养的时间优选为45h。所述高温处理和诱导培养优选进行黑暗条件下培养。
得到的花药愈伤组织后，本发明将所述花药愈伤组织转入所述分化培养基中进行分化培养60～80d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养基中进行继代培养28～35d，得到马铃薯小苗。
本发明中，所述分化培养的时间优选为70h。所述继代培养的时间优选为32h。
本发明中，所述分化培养和继代培养的光照条件优选为光照16h/黑暗8h。培养温度为22～26℃，更优选为25℃。
本发明中，花药诱导出的愈伤组织形成于花药裂缝处，外形致密，颜色多为白色或淡黄色，生长缓慢。
得到继代分化出的马铃薯小苗，本发明将所述继代分化出的马铃薯小苗转入生根培养基中生根培养，得到马铃薯双单倍体植株。
本发明中，所述生根培养基优选以MS培养基为基础培养基，包含质量浓度为0.05～0.1mg/L的萘乙酸、质量浓度为1.5％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％琼脂；更优选为包含质量浓度为0.08mg/L的萘乙酸和质量浓度为0.5％琼脂。
本发明中，所述生根培养时间优选为30～40d，更优选为35d。
本发明中，所述生根培养的光照条件优选为光照16h/黑暗8h。培养温度为22～26℃，更优选为25℃。
本发明中，所述方法还优选包括马铃薯双单倍体材料的鉴定。所述鉴定方法如下：以马铃薯四倍体栽培品种和花药培养植株的叶片为材料，分别提取细胞核悬液并染色，利用染色体倍性分析仪对测试样品进行检测。以马铃薯四倍体栽培种细胞核DNA峰值的位置为对照，根据已知倍性的峰值位置，所有测试样品细胞核DNA含量是以对照为标准的相对值，即可判断未知样品的倍性。本实验利用这一技术对马铃薯花药培养植株倍性水平进行了鉴定，从中获得了马铃薯双单倍体材料。
下面结合实施例对本发明提供的一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3.0％，称量琼脂使其质量浓度为0.5％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.4mg/L，添加6-苄氨基嘌呤到MS培养基中使其质量浓度为3.0mg/L，将玉米素添加到MS培养基中，使其质量浓度为2.5mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
实施例2
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3.0％，称量琼脂使其质量浓度为0.6％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.6mg/L，添加6-苄氨基嘌呤到MS培养基中使其质量浓度为1.5mg/L，将玉米素添加到MS培养基中，使其质量浓度为3.5mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
实施例3
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3％，称量琼脂使其质量浓度为0.5％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.5mg/L，添加6-苄氨基嘌呤到MS培养基中使其质量浓度为2mg/L，将玉米素添加到MS培养基中，使其质量浓度为3.0mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
对比例1
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3％，称量琼脂使其质量浓度为0.6％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.2mg/L，添加6-苄氨基嘌呤到MS培养基中使其质量浓度为1mg/L，将3-吲哚丁酸添加到MS培养基中，使其质量浓度为0.5mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
对比例2
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3％，称量琼脂使其质量浓度为0.6％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.2mg/L，将3-吲哚乙酸添加到MS培养基中，使其质量浓度为0.5mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
对比例3
所述MS培养基包括以质量浓度组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。将上述组分混合后得到MS培养基，添加蔗糖使其质量浓度达到为3％，称量琼脂使其质量浓度为0.6％，充分搅拌后，将赤霉素溶于MS培养基中，使其质量浓度为0.2mg/L，添加6-苄氨基嘌呤到MS培养基中使其质量浓度为6mg/L，将玉米素添加到MS培养基中，使其质量浓度为2.0mg/L，调节pH值至5.8，灭菌后得到分化培养基。
实施例4
将实施例1～3与对比例1～3制备的分化培养基用于组织培养中
(1)选择现蕾至初花期取长度为5mm的花蕾，放置4℃冰箱预处理3d。将处理好的材料在超净工作台无菌环境下，将花蕾先置于75％酒精溶液中表面灭菌30s，无菌水冲洗1次，随后转入0.1％升汞溶液中灭菌8min，再用无菌水冲洗3次，每次2min。灭菌后置于无菌滤纸上，用镊子与接种针将花药从花蕾中剥离出，接种于盛有诱导培养基的50ml三角瓶中，每瓶放10枚花药，封口膜封口。
(2)诱导培养基由MS培养基、附加物、植物激素三部分成分组成。MS培养基参照Murashige&Skoog(1962)的方法配制，附加物为硝酸银30mg/L，活性炭3g/L，蔗糖6％(W/V)，琼脂0.6％(W/V)；添加的植物激素组合为：1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1mg/L激动素(KT)。采用高压灭菌，灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15min。
(3)将接种后的花药置于35℃恒温培养箱中黑暗培养72h，随后转入24℃、黑暗条件下诱导培养45d后，挑取花药裂缝处形成白色或淡黄色愈伤组织转入分化培养基中分化培养60-80d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃；选择分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养中继代培养30d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃；分化培养基及继代培养基为实施例1～3与对比例1～3制备的分化培养基。
(4)待继代分化出的小苗长至2-3片小叶时，转入生根培养基中生根培养30d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃。当花药培养植株叶片长至7～8片，根长为4～5cm时，经倍性鉴定后即可炼苗及移栽。
分化率＝分化出绿芽的愈伤组织数/花药诱导出的愈伤组织数×100％；出苗率＝绿苗数/花药诱导出的愈伤组织数×100％；所得数据采用Excel软件进行方差分析，P＜0.05水平上分析各处理的差异显著性，结果如表1。
表1不同激素配比对马铃薯花药愈伤组织分化及出苗的影响
将诱导出的愈伤组织置于含有不同植物激素的分化培养基中，60-80d后统计结果表明，仅在实施例1～3激素组合处理中，5个品种愈伤组织均可分化出绿芽，其中，实施例3最高，5个品种分化率达到6.1～16.9％，继代培养30d后，5个品种的出苗率达到21.7～43.9％。
实施例5
将马铃薯品种青薯168、黑美人、中薯19、庄薯3号、陇薯6号、宁薯14和宁薯15共7个品种进行双单倍体群体构建。
(1)选择现蕾至初花期取长度为4-6mm的花蕾，放置4℃冰箱预处理5d。将处理好的材料在超净工作台无菌环境下，将花蕾先置于75％酒精溶液中表面灭菌30s，随后转入0.1％升汞溶液中灭菌8min，再用无菌水冲洗3次，每次2min。灭菌后置于无菌滤纸上，用镊子与接种针将花药从花蕾中剥离出，接种于盛有诱导培养基的50ml三角瓶中，每瓶放15枚花药，封口膜封口。
(2)诱导培养基由MS培养基、附加物、植物激素三部分成分组成。MS培养基参照Murashige&Skoog(1962)的方法配制，附加物为硝酸银30mg/L，活性炭3g/L，蔗糖6％(W/V)，琼脂0.6％(W/V)；添加的植物激素组合为：1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1mg/L激动素(KT)。采用高压灭菌，灭菌压力为1.2kg/cm2，温度为121℃，灭菌时间为15min。
(3)将接种后的花药置于35℃恒温培养箱中黑暗培养72h，随后转入24℃、黑暗条件下诱导培养45d后，挑取花药裂缝处形成白色或淡黄色愈伤组织转入分化培养基中分化培养60-80d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃；选择分化出绿色芽点的愈伤组织转入分化培养中继代培养30d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃；分化培养基及继代培养基为实施例1～3与对比例1～3制备的分化培养基。
(4)待继代分化出的小苗长至2片小叶时，转入生根培养基中生根培养30d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃。当花药培养植株叶片长至7～8片，根长为4～5cm时，经倍性鉴定后即可炼苗及移栽。
花药培养植株的倍性鉴定
倍性鉴定是作物遗传育种中必不可少的步骤，以往的倍性鉴定主要采用染色体计数法。尽管染色体计数鉴定倍性可靠性高，但操作复杂，不易掌握，鉴定速度慢，且当染色体数目太多时也可能造成误差。利用染色体倍性分析仪(流式细胞仪)通过比较并分析细胞核DNA含量来鉴定倍性，不仅样品易取得、用量少，且样品处理方法更为快速简单，检测结果更加准确等，目前已成为花药培养植株早期鉴定的主要技术之一。
细胞核悬液制备及染色：剪取花药培养植株叶片1.0cm2，在滴有0.4mL提取液缓冲液的培养皿中研碎，加入1.6mL染色缓冲液，染色3～5min；500目尼龙网过滤，滤液用标准试管收集，随即上机测定。
流式细胞测定：所用机型为Partec公司生产的Cube6型号流式细胞仪(染色体倍性分析仪)，光源为波长365nm紫外线光源，经激发，染色的DNA分子促发荧光，测定装置测定其荧光强度，与此等装置项链的计算机分析软件即可对荧光强度进行分析。以未进行花药培养的马铃薯四倍体栽培种为对照，所有测试样品细胞核DNA含量是以对照为标准的相对值。每个样品重复两次，每次检查时至少含10000个细胞核。从细胞核峰值的相对位置即可判断所测样品的倍性。根据已知四倍体的峰值位置，即可判断未知样品的倍性，本实验利用这一技术对马铃薯花药培养植株倍性水平进行了鉴定，获得马铃薯双单倍体材料。
2013-2015年，对宁夏地区种植的7个马铃薯品种按照本方法进行了花药培养，7个品种均诱导出愈伤组织，愈伤组织诱导率达到8.0～31.7％；其中5个品种(系)的可成功分化诱导出花药植株，分化率达到6.1～16.9％。通过倍性分析仪的鉴定，筛选获得了双单倍体植株。因此，本方法的进一步应用将为马铃薯倍性育种研究提供重要的理论与实践。
实施例6
将实施例3的方案中诱导培养基替换为如表2中10组不同植物激素与附加物组合形成的诱导培养基，采用实施例3的方法诱导，得到的愈伤组织统计结果如表2。
表2不同植物激素组合形成的诱导培养基
注：愈伤组织诱导率(％)＝形成愈伤组织的花药数/接种花药数×100％
表3不同激素组合对马铃薯花药愈伤组织诱导的影响
将7个马铃薯品种的花药接种于10种激素组合处理的培养基中进行愈伤组织诱导培养，30d左右可以观察到花药裂缝处形成白色或淡黄色愈伤组织出现，40-50d后统计愈伤组织诱导率。由表3可知，不同激素组合处理对马铃薯花药愈伤组织诱导差异显著，以激素组合6处理下的诱导率相对较高。7个品种愈伤组织诱导率达到8.0～31.76％。其中宁薯15号最高，达31.76％。
实施例7
将实施例3的方案中诱导培养基替换为如表4中10组不同附加物与植物激素组合形成的诱导培养基，采用实施例3的方法诱导青薯168品种，得到的愈伤组织统计结果如表5。
表4马铃薯花药培养附加物组合
表5附加物组合对青薯168花药愈伤组织诱导的影响
以青薯168品种为试验材料，对添加6号激素组合的诱导培养基中添加9种附加物组合处理，30d后统计结果表明，不同组合附加物处理对马铃薯花药愈伤组织具有显著差异，其中V、Ⅵ处理下诱导率最高，分别达到25.0％和21.25％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的分化培养基，以MS培养基为基础培养基，包含以下组分：质量浓度为0.4～0.6mg/L赤霉素、质量浓度为1.5～3mg/L的6-苄氨基嘌呤、质量浓度为2.5～3.5mg/L玉米素、质量浓度为3.0％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％的琼脂；所述MS培养基包括以下组分：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。
2.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述赤霉素在MS培养基中的质量浓度为0.5mg/L。
3.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述6-苄氨基嘌呤在MS培养基中的质量浓度为2.0mg/L。
4.根据权利要求1所述的分化培养基，其特征在于，所述玉米素在MS培养基中的质量浓度为3.0mg/L。
5.一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法，包括以下步骤：
1)摘取现蕾期至初花期的花蕾放入4～8℃环境中预处理48～72h；
2)将所述步骤1)中预处理后的花蕾进行灭菌后，挑取花蕾中的花药接种于诱导培养基中，在30～35℃条件下高温处理48～72h，再在22～26℃条件下诱导培养40～50d，获得花药愈伤组织；
其诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，包含附加物和植物激素；附加物为下列质量含量的组分：硝酸银30～50mg/L，活性炭1.5～3g/L，蔗糖6％， 琼脂0.6％；植物激素包括以下重量含量组分：1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.5mg/L萘乙酸，1mg/L激动素；
3)将所述步骤2)诱导获得的花药愈伤组织，转入所述权利要求1～4任意一项所述的分化培养基中进行分化培养60～80d，挑取分化出绿色芽点的愈伤组织转入所述分化培养基中进行继代培养30～50d，获得马铃薯小苗；
4)将所述步骤3)中继代分化出的马铃薯小苗转入生根培养基中生根培养，获得马铃薯花药培养完整植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中花蕾长度为4～6mm；花蕾的采集时间为上午9:00～10:00；花蕾的形态为花瓣与花萼等长；所述步骤1)中花药的长度为2～3mm，花药的颜色为绿色。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中花药接种后高温处理及诱导培养的光照条件为黑暗24h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中分化培养和继代培养的光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为22～26℃。
9.根据权利要求5～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中生根培养基为以MS培养基为基础培养基，包含质量浓度为0.05～0.1mg/L的萘乙酸、质量浓度为1.5％的蔗糖和质量浓度为0.4％～0.6％琼脂；所述步骤4)中培养时间为30～40d。
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