CN105052724A - 一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物育种领域，具体公开了一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其为对二倍体马铃薯花蕾进行人工自交授粉，优选为对S-RNase基因表达量较低的花蕾进行人工自交授粉。本发明通过选择适当授粉时期进行自交来克服二倍体马铃薯自交不亲和，简单易行，在克服自交不亲和的同时，无需导入外源野生基因组，所获得的自交种子可以直接应用于遗传研究和育种过程。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种领域，特别是涉及一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法及其应用。
背景技术
马铃薯育种进程缓慢主要是由马铃薯四倍体遗传特性决定的。四倍体马铃薯的基因组高度杂合，隐性基因表现频率低，使得很多有害的等位基因被隐藏在四倍体中，而有利等位基因很难重组到一个四倍体品种中,这是造成马铃薯杂交育种周期长的一个重要原因。与四倍体相比，二倍体马铃薯的基因组相对简单，可以通过不断自交将有害基因剔除掉，从而获得优良自交系用于杂交种生产。二倍体马铃薯杂交育种能够实现目标性状的定向改良，加快马铃薯的育种进程，还有利于知识产权保护。随着马铃薯研究的不断发展和马铃薯全基因组测序的完成，近几年二倍体杂交育种成为了国际马铃薯研究的热点。然而，建立二倍体马铃薯杂交优势育种平台，首先需要培育一批纯合的高代自交系，才能保证杂交种的一致性。但二倍体马铃薯多为自交不亲和，因此首先需要克服自交不亲和的问题。
自交不亲和是指能产生具有正常功能且同期成熟雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时不能完成受精的现象。马铃薯的自交不亲和属于配子体型自交不亲和，是由一个高多态性的S位点控制的。S位点含有花柱特异表达的S-RNase基因。S-RNase蛋白具有核酸酶活性，在花粉管伸长阶段，高浓度的S-RNase蛋白从柱头进入到花粉管中，特异性降解自身花粉管的rRNA，抑制花粉管的进一步伸长，达到排斥自身花粉的目的。目前克服马铃薯自交不亲和的方法主要是利用野生种中发现的抑制自交不亲和基因Sli(Slocusinhibitor)。Sli基因首先由日本研究人员Hosaka等在野生马铃薯Solanumchacoense中发现，并将该基因与其它二倍体材料进行杂交，实现了二倍体的自交。荷兰育种人员也通过杂交的方法将Sli基因导入到二倍体马铃薯中，用于杂交马铃薯育种。但是Sli基因来自野生马铃薯S.chacoense，该野生种与栽培种马铃薯的差异太大，向栽培种中导入Sli基因的同时会导入50％的野生基因组。这些野生基因组导致植株地上部分生长过旺，地下结薯较少且薯块小等不益性状，需要与栽培种进行多代回交之后才能淘汰野生基因组，大大延长了育种周期。
发明内容
为了大量创制马铃薯自交系，从加快马铃薯育种进程，本发明的目的是提供一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法。
申请人经大量实验观察发现，控制自交不亲和的S-RNase基因在马铃薯的蕾期表达量比较低，在该时期进行自交授粉，S-RNase不能够抑制自身花粉管的伸长，自身花粉管在柱头中延伸直至胚珠，将两个精细胞运到胚珠，完成双受精过程，获得自交的种子。因此通过蕾期自交可以克服二倍体马铃薯的自交不亲和问题。该方法简单易行，在克服自交不亲和的同时，无需导入外源野生基因组，所获得的自交种子可以直接应用于遗传研究和育种过程。
本发明中距离开花前0天(开花当天)、开花前1天、开花前2天、开花前3天、开花前4天及以上分别计做蕾龄为0、-1、-2、-3、-4。
本发明提供一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其为对二倍体马铃薯花蕾进行人工自交授粉。
其中，所述二倍体马铃薯为育性正常、自交不亲和的二倍体马铃薯。
其中，所述花蕾优选为S-RNase基因表达量较低的花蕾。
其中，所述S-RNase基因表达量较低的花蕾，通过如下方式测定：选取不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾，检测S-RNase基因的表达量得出表达量较低的蕾龄，则该蕾龄的花蕾即为S-RNase基因表达量较低的花蕾。
其中，所述S-RNase基因表达量较低的花蕾，优选为开花前2天的花蕾和/或开花前3天的花蕾。
其中，所述检测S-RNase基因的表达量，具体方法为：
i)采用qRT-PCR方法检测S-RNase基因的mRNA表达量；
和/或ii)采用westernblotting方法检测S-RNase基因的蛋白表达量。
其中，所述人工自交授粉，包括如下步骤：
a)去掉花蕾的花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊；
b)采集同棵植株上已开放花的花粉；
c)将步骤b)中的花粉授于步骤1)中雌蕊的柱头上，授粉后套袋。
本发明提供的一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，优选为具体步骤如下：
1)选取不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾，检测S-RNase基因的表达量得出表达量较低的蕾龄，则该蕾龄的花蕾即为S-RNase基因表达量较低的花蕾；
2)选S-RNase基因表达量较低的花蕾，去掉花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊，采集同棵植株上已开放花的花粉授于雌蕊的柱头上，授粉后套袋。
本发明还提供所述提高二倍体马铃薯自交结实率的方法在马铃薯育种中的应用，优选为在获得二倍体马铃薯自交种子中的应用，其步骤如下：
I)对二倍体马铃薯花蕾进行人工自交授粉；
II)采集所得种子进行检测，排除异交种子，获得自交种子。
其中，所述采集所得种子，为在授粉后50-60天采收自交后所结的浆果，室温后熟1周后，采集种子。
其中，所述检测优选为通过分子标记检测。所述分子标记优选为SSR、CAPS或Indel标记。
本发明提高二倍体马铃薯自交结实率的方法是一种通过选择适当授粉时期进行自交来克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法。该方法简单易行，在克服自交不亲和的同时，无需导入外源野生基因组，所获得的自交种子可以直接应用于遗传研究和育种过程。
附图说明
图1为本发明不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾照片。
图2为实施例1不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾中S-RNase基因的mRNA表达量qRT-PCR检测柱状图。
图3为实施例1不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾中S-RNase基因的蛋白表达量Westernblotting检测照片。
图中，0、-1、-2、-3、-4分别为开花前0天(开花当天)、开花前1天、开花前2天、开花前3天、开花前4天及以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1)在北京种植二倍体马铃薯材料，待花期，选择距离开花不同时间的花蕾进行分级，具体参见图1，计蕾龄分别为：
0：开花当天，表现为花瓣完全开放；
－1：开花前1天，表现为花瓣刚刚开口；
－2：开花前2天，表现为花瓣超出花萼1/3处；
－3：开花前3天，表现为花瓣与花萼齐平；
－4：开花前4天及以上：花瓣被花萼包裹在里面。
2)对不同蕾龄的花蕾进行采样，提取总RNA和总蛋白。
采用qRT-PCR方法检测S-RNase基因的mRNA表达量，检测结果见图2，表明S-RNase的表达量在开花前是逐步上升的。
采用westernblotting方法检测S-RNase基因的蛋白表达量，检测结果见图3，也表明S-RNase蛋白表达量在开花前是逐步上升的，到开花期达到最高值。
3)根据S-RNase的表达量，考虑到蕾龄-4的花蕾太小，人工授粉操作较难，选择蕾龄-2和-3的花蕾进行人工自交授粉，因为这个时期S-RNase的表达量较低，且花蕾较大，操作方便。
人工自交授粉时，首先拨开花蕾，去掉花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊；然后采集同一棵植株上已开放花的花粉；最后将花粉授于去雄花蕾雌蕊的柱头上，授粉后套袋处理。
4)授粉后50-60天采收自交的浆果，室温后熟1周后，采集种子。
5)通过Indel分子标记检测马铃薯自交种子(所用引物见表1)，通过聚丙烯凝胶电泳检测发现，这些标记在自交群体中符合孟德尔遗传，没出发现与亲本不同的特异条带，证明收获的种子确实是通过自交获得的。该自交群体可以直接应用于遗传研究和育种过程。
表1所用的Indel标记引物序列
| 引物编号 | 正向引物(5’-3’) | 反向引物(5’-3’) |
| P1 | ATACCCACATGACCACATTT | GCCATGGTTTTTAGTGTTTC |
| P2 | CCAACAACAAGCATAAGACA | GCTGTACAGGTCTTTGGTTTA |
| P3 | CTCGGCTCAAGTAAAAACAT | TTGTAGTGGCTGTTCCTTTT |
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行参数范围内的修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，其为对二倍体马铃薯花蕾进行人工自交授粉。
2.根据权利要求1所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，所述花蕾为S-RNase基因表达量较低的花蕾。
3.根据权利要求2所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，所述S-RNase基因表达量较低的花蕾，通过如下方式测定：选取不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾，检测S-RNase基因的表达量得出表达量较低的蕾龄，则该蕾龄的花蕾即为S-RNase基因表达量较低的花蕾。
4.根据权利要求3所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，所述检测S-RNase基因的表达量，具体方法为：
i)采用qRT-PCR方法检测S-RNase基因的mRNA表达量；
和/或ii)采用westernblotting方法检测S-RNase基因的蛋白表达量。
5.根据权利要求2所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，所述S-RNase基因表达量较低的花蕾，优选为开花前2天的花蕾和/或开花前3天的花蕾。
6.根据权利要求1所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，所述人工自交授粉，包括如下步骤：
a)去掉花蕾的花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊；
b)采集同棵植株上已开放花的花粉；
c)将步骤b)中的花粉授于步骤1)中雌蕊的柱头上，授粉后套袋。
7.根据权利要求1所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)选取不同蕾龄的二倍体马铃薯花蕾，检测S-RNase基因的表达量得出表达量较低的蕾龄，则该蕾龄的花蕾即为S-RNase基因表达量较低的花蕾；
2)选S-RNase基因表达量较低的花蕾，去掉花萼、花瓣和雄蕊，只留雌蕊，采集同棵植株上已开放花的花粉授于雌蕊的柱头上，授粉后套袋。
8.权利要求1-7任一项所述的提高二倍体马铃薯自交结实率的方法在马铃薯育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其步骤如下：
I)对二倍体马铃薯花蕾进行人工自交授粉；
II)采集所得种子进行检测，排除异交种子，获得自交种子。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述采集所得种子，为在授粉后50-60天采收自交后所结的浆果，室温后熟1周后，采集种子。
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