CN104878089A

CN104878089A - 一种采用流式细胞术快速鉴定冬瓜倍性的方法

Info

Publication number: CN104878089A
Application number: CN201510214784.2A
Authority: CN
Inventors: 万正林; 邓俭英; 武鹏; 李立志; 周艳霞; 刘朝安
Original assignee: Guangxi Modern Agr-Technology Park
Current assignee: Guangxi Modern Agr-Technology Park
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明提供一种采用流式细胞术快速鉴定冬瓜倍性的方法，包括以下几个步骤：步骤A:采集幼嫩叶片，将其冲洗灭菌后加入预冷、稀释后的改良裂解液，用预先灭好菌的锋利刀片将冬瓜叶片切碎；步骤B:将切碎后的冬瓜叶片用预先用裂解液浸泡过的尼龙滤网过滤到离心管中，再将滤液放入离心机，室温下离心，倒掉上清液，加入预冷的裂解液，混匀，再加入染液混匀，避光染色，得到样品；步骤C:采用流式细胞仪的稳定性，用荧光微球校准各荧光通道，确保各荧光通道采集的荧光信号变异系数小于2%；选择已知倍性的二倍体冬瓜为对照样品；待测样本上机检测，收集4000-5000个细胞核，得出样本流式散点图与荧光峰图。本发明从制备样品至结果分析完成一个样品只需要40min即可。

Description

一种采用流式细胞术快速鉴定冬瓜倍性的方法

技术领域

本发明涉及冬瓜倍性鉴定的方法。

背景技术

一般而言，进行植物倍性鉴定的方法分为两大类：第一类是直接鉴定法，即染色体计数法。这是确定倍性最基本和最精确的方法，但是这种方法需要装备良好的试验条件和富有经验的技术人员，而且操作过程繁琐，工作量大，需要消耗大量的时间来进行。第二类是间接鉴定法，其包括田间植株形态指标鉴定、气孔大小及保卫细胞叶绿体数目观察、花粉粒大小判别法等。这些方法比较简单，但是不精确，如果植株存在嵌合体时，无法准确判断其倍性。流式细胞术是一种简单、快捷的对植株分裂期的核DNA含量进行检测分析，通过计算细胞核DNA含量来分析植株的倍性，具有快速、简便、准确的特点，准备好的细胞核样品在数分钟内即可完成测定和分析, 所以特别适合于样品较多的倍性检测分析。流式细胞术是目前植物倍性鉴定最简便和准确的方法。目前在冬瓜倍性检测方面还未见有用流式细胞术进行鉴定的先例。

发明内容

因此，本发明提供一种快速、简便、准确的鉴定冬瓜倍性的方法，解决染色体计数过程中耗时过多、间接鉴定方法中的不精确性因素的问题。

一种采用流式细胞术快速鉴定冬瓜倍性的方法，包括以下几个步骤：

步骤A：采集幼嫩叶片，将其冲洗灭菌后加入预冷的改良裂解液，用预先灭好菌的锋利刀片将冬瓜叶片切碎；

步骤B：将切碎后的冬瓜叶片用预先用改良裂解液浸泡过的尼龙滤网过滤到离心管中，再将滤液放入离心机，室温下离心，倒掉上清液，加入预冷的改良裂解液，混匀，再加入染液混匀，避光染色，得到样品；

步骤C：采用流式细胞仪的稳定性，用荧光微球校准各荧光通道，确保各荧光通道采集的荧光信号变异系数小于2%；选择已知倍性的二倍体冬瓜为对照样品；待测样本上机检测，收集4000-5000个细胞核，得出样本流式散点图与荧光峰图。

优选的，改良裂解液配制：以500-1000m L为定容，按浓度40-45mmol/L MgCl₂，25-30 mmol/L柠檬酸钠，15-20 mmol/L MOPS，体积浓度为0.1-0.15%的TritonX-100，pH=7.5，配制成所需裂解液，于-20℃保存，解冻后4℃下保存。

优选的，所述改良裂解液用DEPC水或去离子水溶解。

优选的，所述染液的配制方法：用无菌水溶解DAPI，配制成浓度1 mg/ml的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，可在-20 ℃下长期保存。

优选的，所述染液的稀释方法为：用1xPBS稀释到浓度为10ug/mL，并用滤网过滤，滤液在4℃下保存待用。

优选的，所述滤网采用0.22um，滤液的保存温度为4℃。

优选的，所述尼龙滤网采用300目。

优选的，所述二倍体对照样设置在所述流式细胞仪的100通道。

优选的，离心的速度为1000-1500rpm，离心时间为3-5min。

测试的具体步骤如下：

a.检查流式细胞仪的稳定性，打开仪器，预热30min。

b.仪器启动后，用荧光微球校准各荧光通道，确保各荧光通道采集的荧光信号变异系数（CV值）小于2%。

c.待测样本上机检测，收集4000-5000个细胞核，得出样本流式散点图与荧光峰图。数据分析为机器自带软件。选择已知倍性的二倍体冬瓜为对照样品，将二倍体对照设置在100通道。选用的流式细胞仪机器型号为Cell. Lab. Quanta.SC.（美国贝克曼公司）

本发明的有益效果是：此方法是用于冬瓜倍性的快速检测，选用的改良裂解液是Galbraith’s，染色液为DAPI（10ug/ml）；本发明样品制备简单，上样检测快速，结果准确。从制备样品至结果分析完成一个样品只需要40min即可完成。

附图说明

图1是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜二倍体倍性的荧光光谱图。

图2是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜二倍体与四倍体嵌合体的荧光光谱图。

图3是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜四倍体的荧光光谱图。

图4是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜三倍体的荧光光谱图。

图5是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜四倍体与八倍体嵌合体的荧光光谱图。

图6是本发明流式细胞术快速鉴定冬瓜六倍体的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

以秋水仙素剥滴诱变处理幼嫩冬瓜幼苗生长点2个月后的黑皮冬瓜幼苗为试验材料，鉴定处理后黑皮冬瓜幼苗的倍性为例：

①样品采集：采集处理后黑皮冬瓜幼苗完全展开的心叶，重量0.2g。

②样品制备：

a.改良裂解液配制：以1000m L去离子水定容，按45mmol/L MgCl₂，30 mmol/L柠檬酸钠，20 mmol/L MOPS，0.1%（v/v）TritonX-100，pH 7.5配制成改良裂解液，于-20℃保存，解冻后4℃下保存待用；

b.将样品用蒸馏水冲洗2次，用已灭菌的滤纸吸干比表面水分后放入灭菌预冷的培养皿中，加入预冷的改良裂解液（Galbraith’s）(1-2ml)，使叶片浸没在改良裂解液中，用预先灭好菌的锋利刀片将冬瓜叶片切碎。

c.2-3min后用300目的尼龙滤网（预先用改良裂解液浸泡10min）过滤到1.5ml离心管中，留滤液备用。

d.将滤液放入离心机，室温，1500rpm，离心5min，倒掉上清液，加入1ml预冷的改良裂解液，混匀，再加入0.1ml染液（DAPI，10ug/mL）混匀，避光染色0.5h后均可使用。

③上样检测：

a.检查流式细胞仪的稳定性，打开仪器，预热30min。

c.待测样本上机检测，收集4000-5000个细胞核，得出样本流式散点图与荧光峰图。数据分析为机器自带软件。选择已知倍性的二倍体冬瓜为对照样品，将二倍体对照设置在100通道。

④结果分析：

如图1-6所示，以普通的二倍体冬瓜为对照，二倍体对照荧光峰的荧光强度处在100附近，待测冬瓜植株峰值处于100附近的视为二倍体，而处于150附近则为三倍体，处于200附近则为四倍体，处于300附近则为六倍体；在100与200处同时存在荧光峰值则为二倍体与四倍体的嵌合体，在200与400处同时存在荧光峰值则为四倍体与八倍体的嵌合体。

三种方法的比较：

以田间形态学鉴定、染色体计数法及流式细胞术三种方法进行比较，鉴定冬瓜倍性，结果如下：

1、形态学鉴定

指通过植株的叶片大小，花器官大小，花粉粒形态、大小及畸形率，果实性状、大小，叶表皮气孔大小，叶肉细胞中叶绿体数目等方面进行鉴定。此方法具有简单易行，不需要繁杂的室内试验即可记性。但其只能初步进行判定植株是否已经产生变异，但具体的植株倍性不能明确的知道，此方法只能进行初步筛选，用于初步剔除未变异的植株，为后续的染色体计数或流式细胞术准确的倍性鉴定进行前期的准备工作。

2、染色体计数

是目前最为准确、且最直观的鉴定植株倍性的方法。但需要良好的试验条件和富有经验的技术人员，而且操作过程繁琐，工作量大，需要消耗大量的时间来进行。如果鉴定植株是嵌合体，染色体压片时，就可能因为压片操作的问题，而不能准确的判断其倍性水平。

3、流式细胞术

是通过细胞核DNA水平来计算染色体倍性，是从分子水平上进行鉴定，是目前较为准确的鉴定方法，而且操作简单、快捷。能准确鉴定植株的倍性，包含嵌合体也能准确的判断，但需要一个已知倍性的内参。

三种方法比较鉴定结果如表1所示：

鉴定方法	鉴定株数（株）	变异株数（株）	备注
				形态学鉴定	30	18	简单易行，肉眼可判，但只能进行初步筛选
染色体计数法	30	5	过程繁杂，从一个前处理到准确结果至少要2天以上。
				流式细胞术	30	5	一个样从前处理到准确结果只需要40min

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种采用流式细胞术快速鉴定冬瓜倍性的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A: 采集幼嫩叶片，将其冲洗灭菌后加入预冷的改良裂解液，用预先灭好菌的锋利刀片将冬瓜叶片切碎；

步骤B:将切碎后的冬瓜叶片用预先用改良裂解液浸泡过的尼龙滤网过滤到离心管中，再将滤液放入离心机，室温下离心，倒掉上清液，加入改良裂解液，混匀，再加入稀释后的染液混匀，避光染色，得到样品；

步骤C: 采用流式细胞仪的稳定性，用荧光微球校准各荧光通道，确保各荧光通道采集的荧光信号变异系数小于2%；选择已知倍性的二倍体冬瓜为对照样品；待测样本上机检测，收集4000-5000个细胞核，得出样本流式散点图与荧光峰图。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改良裂解液配制：以500-1000mL定容，按浓度40-45mmol/L MgCl₂，25-30 mmol/L柠檬酸钠，15-20 mmol/L MOPS，体积浓度为0.1-0.15%的TritonX-100，pH=7.5，配制成所需裂解液，于-20℃保存，解冻后4℃下保存。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述改良裂解液用DEPC水或去离子水溶解。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中，所述染液的配制方法为：用无菌水溶解DAPI，配制成浓度1 mg/ml的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，在-20 ℃下长期保存。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中，所述染液的稀释方法为：用1xPBS将染液稀释到浓度为10ug/mL，并用滤网过滤，保存待用。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述滤网采用0.22um，滤液的保存温度为4℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中，所述尼龙滤网采用300目。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中，离心的速度为1000-1500rpm，离心时间为3-5min。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述二倍体对照样设置在所述流式细胞仪的100通道。