CN105259097A - 一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法。本发明所提供的用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，用改良MgCl2·Tris细胞核分离缓冲液获得细胞悬液，用DAPI染料快速染色，并通过流式细胞仪的弧光灯激发DAPI，检测不同蓝莓样品的荧光累积情况，并与同类型已知倍性的蓝莓品种的荧光峰值进行比较，可简便、快速、批量鉴定蓝莓倍性。
Description
技术领域
本发明涉及用流式细胞术鉴定植物倍性的方法，特别涉及一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法。
背景技术
蓝莓(Blueberry)，又名蓝浆果，多泛指杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)可食用的有色浆果，其果实深蓝，口感细腻，果香怡人。研究表明，蓝莓具有抗氧化、抗衰老、抗癌、预防心血管疾病、保护视力等功效，是美国农业部鉴定的40多种果蔬中抗氧化能力最强的一种，被国际粮农组织列入五大健康食品之一。自1906年Coville博士选育出第一个蓝莓优良品种后，世界蓝莓产业随新品种的不断推出和推广而迅猛发展。目前，全球已有30多个国家开展了蓝莓的大面积种植。我国也于80年代初开始了蓝莓引种工作，目前市场流通的蓝莓品种已超240种，且国内蓝莓种植面积直线上升。广阔的蓝莓种苗需求及高额的利润回报诱发了国内蓝莓种苗市场的过速膨胀，混乱的市场秩序直接导致了蓝莓种苗品种混乱、品质参差不齐。而蓝莓品种倍性差异较大，北高丛蓝莓、南高丛蓝莓和半高丛蓝以4倍体居多，矮丛蓝莓多是2倍体，而兔眼蓝莓是6倍体。复杂的倍性关系，混乱的种苗市场，在影响农户收入的同时，也对我国自主优质蓝莓品种的选育工作造成了极大不便，因此有必要开发一种快速测定蓝莓倍性的方法，为蓝莓育种中适合的亲本的选择提供依据。
流式细胞术(flowcytometry，FCM)就是利用流式细胞仪对处于流液中各种荧光标记的微粒进行多参数快速定性、定量分析，具有高效率、高精确度、高灵敏度、无破坏性等优点。在植物学研究中，流式细胞术被广泛的用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性分析，FCM已成功的用于苹果、草莓、猕猴桃、荔枝等植物的倍性鉴定研究中。选择合适的细胞核分离缓冲液，制备优质的细胞核悬液是FCM测定植物倍性的关键。但不同植物的组织结构和化学成分都差异较大，这使得细胞核分离缓冲液的效果也不尽相同，目前还没有一种普遍适用的细胞核分离缓冲液，蓝莓品种倍性的FCM鉴定更是鲜有报道。此外，现行FCM方法中，使用最多的荧光染料是碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，该染料能够嵌入双链DNA及RNA的碱基对中与之结合，所以在染色前必需使用RNaseA处理细胞，排除双链RNA对实验的干扰，这极大的增加了实验复杂度，也导致了实验结果中碎片峰的增加。
发明内容
为了弥补以上领域的不足，本发明提供一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法。
本发明所提供的用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，包括如下步骤：
(1)配制包含如下组分的细胞核分离缓冲液：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为0.5％-2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇；
(2)向每克蓝莓叶片样品中加入4-10ml所述步骤(1)配制的细胞核分离缓冲液；
(3)将所述步骤(2)中的蓝莓叶片切碎后，过滤，收集滤液；
(4)将所述步骤(3)的滤液离心，弃上清，加入所述步骤(1)配制的细胞核分离缓冲液重悬沉淀物；
(5)加入4,6-联脒-2-苯基吲哚，染色；
(6)用流式细胞仪进行检测。
所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。
优选地，所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。
所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液的pH值为7.5。
所述方法还包括在所述步骤(4)重悬沉淀物之后进行静置裂解的步骤。
所述步骤(2)中所述加入细胞核分离缓冲液为冰浴的细胞核分离缓冲液。
所述步骤(3)中所述切碎是在冰上进行；所述过滤是用300目尼龙膜过滤。
所述步骤(4)中所述离心是用5000rpm转速于4℃离心1-5min。
所述步骤(5)中所述4,6-联脒-2-苯基吲哚的浓度为1mg/ml，加入量为5μl；所述染色为冰上避光染色15min。
所述步骤(6)中所述流式细胞仪需具备355nm激发波长。
本发明提出了一种使用DAPI染色鉴定蓝莓倍性的流式细胞术检测方法，即采用流式细胞仪的弧光灯激发DAPI，检测不同蓝莓样品中的荧光累积情况，并与同类型已知倍性的蓝莓品种的荧光峰值进行比较，简便、快速、批量鉴定蓝莓倍性的检测方法。
附图说明
图1为对照组细胞核分离缓冲液制备的样品获得的FCM荧光直方图；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
图2为1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的样品经FCM获得的直方图；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
图3为以已知倍性的六倍体蓝莓品种‘灿烂’为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。其中A为荧光峰图，a为log转化后的荧光峰图。
图4为以‘蓝丰’为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果，横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目。
图5为以‘斯巴露’为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中C为荧光峰图，c为log转化后的荧光峰图。
图6为以‘黑珍珠’为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中D为荧光峰图，d为log转化后的荧光峰图。
图7为以美国蔓越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中E为荧光峰图，e为log转化后的荧光峰图。
图8为以长白山野生蔓越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中F为荧光峰图，f为log转化后的荧光峰图。
图9为以长白山野生笃斯越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中G为荧光峰图，g为log转化后的荧光峰图。
图10为以大兴安岭野生笃斯越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中H为荧光峰图，h为log转化后的荧光峰图。
图11为以大兴安岭野生红豆越桔为材料，使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液测定的FCM实验结果；横坐标为FL6通道检测到的荧光强度，纵坐标为检测到的细胞数目；其中I为荧光峰图，i为log转化后的荧光峰图。
具体实施方式
仪器及试剂：MoFloTMXDP流式细胞仪(BeckmanCoulter)，Flow-check荧光球(BeckmanCoulterTM)，DAPI染料(RocheDiagnostics)，其余未特别标明的试剂都购自Sigma-Aldrich公司。
实验材料：蓝莓叶片多呈不同程度的革质化，且富含原花青素、有机酸等多酚类物质，故本研究选择具有典型特征的蓝莓品种叶片及我国储量极大的蓝莓野生种为材料，列表1如下：
表1本发明所使用的蓝莓材料
以上实验材料中的‘灿烂’、‘斯巴露’、‘蓝丰’、‘黑珍珠’和美国蔓越桔均购自大连大学现代农业研究中心蓝莓研究所；蔓越桔(长白山区野生种)、笃斯越桔(大兴安岭区野生种)、笃斯越桔(长白山区野生种)和红豆越桔(大兴安岭区野生种)均由大连大学现代农业研究中心蓝莓研究所提供，记载过这些材料的非专利文献是：顾姻,贺善安,於虹,王传永,吴文龙(2001)蓝浆果与蔓越桔(第1版).北京：中国农业出版社.pp.25-33,142-187。
实施例1、用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法
1、配制细胞核分离缓冲液：
称取1211.4mgTris、40.65mgMgCl2·6H2O、231.3mgDTT，用少量蒸馏水分别溶解后，混合，向混合液中加入5mg-5gPVP-40、175.97μlβ-巯基乙醇、125μl-1mlTritonX-100，混匀，用HCl调节pH至7.5，并定容终体积至50ml，配好后冰浴，备用。
本实施例所配制的细胞核分离缓冲液如表2所示：
表2本实施例所配制的细胞核分离缓冲液
备注：所有的试剂现配现用，配好后置于4℃冰箱预冷后备用。聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)、二硫苏糖醇(DTT)。
2、制备用于流式细胞仪检测的细胞核样品
(1)称量0.2-0.5g新鲜的蓝莓叶片置于平皿中(平皿置于冰上)，加2ml冰浴的细胞核分离缓冲液；
(2)用锋利的双面刀快速地用力剁切叶片(尽量使叶片浸置于缓冲液中)，将叶片切碎至末状；
(3)将切碎后的组织及细胞核分离缓冲液一同转移到300目的尼龙膜上，收集滤液到1.5ml离心管中；
(4)再加1ml细胞核分离缓冲液至平皿中剩下的残留叶片碎片中，冲洗碎片，并将冲洗后的细胞核分离缓冲液也用300目尼龙膜过滤到1.5ml离心管中；
(5)将所有的滤液用5000rpm转速，4℃离心1-5min；
(6)弃上清，用1ml冰浴的细胞核分离缓冲液重悬沉淀物(沉淀物有时是白色的)；
(7)将离心管插入冰上，革质化严重的材料可静置裂解1-2h(嫩叶静置15-30min即可)；
(8)向离心管中加5μl4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenyiindole，DAPI)(浓度1mg/ml)，混匀，插入冰中，避光染色15min；
(9)混匀后，准备上机检测。
3、流式细胞仪分析
经DAPI染色的样品通过流式细胞仪，用355nm激光激发，由FL6通道检测出荧光强度。使用随机软件Summit5.2获取数据，每个样品测定大于10000个细胞核(颗粒)。绘制显示直方图(其横坐标为DNA相对含量，反映荧光曲线的面积，纵坐标为细胞核出现频率，即相对细胞核数)，并计算变异系数CV。
4、结果
(1)以美国蔓越桔新鲜嫩叶作为实验材料，比较不同的细胞核分离缓冲液的效果，结果如图1和图2所示。图1为对照组细胞核分离缓冲液制备的样品获得的FCM荧光直方图，图2为上述1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的样品经FCM获得的直方图。
从图1可见，使用对照组细胞核分离缓冲液制备的样品在直方图中产生了微小的的二倍体“峰”，但在峰的左侧出现了大量背景碎片，推测这可能是机械破碎叶片时对细胞损伤太大，且蓝莓革质化比较严重，又含有大量的多酚类物质，这会使样品中含有较多的细胞碎片，且易使细胞黏连，致使峰变矮小、变宽。通常认为CV值小于8％才是可信的结果，而现在使用对照组方法获得的CV值已达14.62％，远不能满足要求。
从图2可见，使用本发明1号、2号和3号细胞核分离缓冲液制备的细胞核悬液，在直方图中可产生明显的二倍体状态和四倍体状态的“峰”，峰宽变窄，主峰变高。虽然主峰左侧仍然存在较多的背景碎片，但是相对于对照组的直方图(图1)来说，干扰峰带已明显减少，CV值也得到了一定程度的改善，基本满足需求。其中使用1号细胞核分离缓冲液制备的样品获得的CV值较小，且碎片干扰也最小，细胞悬液浓度高，分析效果最好。实验结果说明多种类的多酚抑制剂及高浓度的PVP能够有效的减少细胞粘连，减少机械破碎时造成的细胞损伤，能够更好的分离细胞核。同时，检测结果表明，使用FCM测定蓝莓倍性时DAPI可以取代PI用来染色。通常DAPI染色5-15min就可以染色完全，且不需要再使用酶去除RNA干扰，这极大的简化了FCM测定流程。另外，本发明比较了离心对细胞核提取的影响，发现5000rpm的离心不会导致细胞破裂，有利于降低碎片杂峰强度。值得注意的是，实验中发现染色后材料在4℃冰箱放置一晚后，再次上机检测，检测结果显示虽然其碎片峰稍增，但主峰依然明显。这表明上述提取缓冲液及DAPI染色法具有较好的稳定性，使得大批量、长时间跨度测定样本成为可能。
4号、5号、6号和7号细胞核分离缓冲液制备的样品检测结果与1号、2号和3号无显著差异。
(2)使用表2中所示的1号细胞核分离缓冲液，以表1中所示的各蓝莓品种叶片作为实验材料，测定多种蓝莓材料的倍性，结果如图3-图11所示。
图3中A为对照兔眼蓝莓‘灿烂’的荧光峰图，图3中a为其log转换后的荧光峰图。作为对照材料的兔眼蓝莓‘灿烂’，采自温室‘灿烂’新生嫩叶，该品种是确定的6倍体，可用做对照。兔眼蓝莓‘灿烂’经FCM测定的荧光强度均值为728.63，CV值为3.88％。蓝莓是进化相对保守的物种，其基因组大小随染色体的增加而增加，因此可以认为倍性相同的蓝莓品种，其基因组大小相近。故可以以‘灿烂’为对照，通过FCM推测其它蓝莓品种的倍性。
图4中为实验材料‘蓝丰’(北高丛蓝莓)的荧光峰图。‘蓝丰’叶片大小中等，无明显革质化。由于‘蓝丰’经FCM测定的荧光强度均值为420.58，CV值为6.17％(CV小于8％)，故推测‘蓝丰’是4倍体，这与文献中通过核型分析得到的结果一致。且在育种中北高丛蓝莓是异源四倍体杂种，这也从一定程度上支持了本研究结果。
图5中C为实验材料‘斯巴露’(南高丛蓝莓)的荧光峰图，图5中c为其log转换后的荧光峰图。‘斯巴露’叶片大小中等，革质化较弱。‘斯巴露’经FCM测定的荧光强度均值为418.84，CV值为6.97％，推测为四倍体。分析依据同上。在育种中南高丛蓝莓是由新泽西高丛蓝莓产生的同源四倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
图6中D为实验材料‘黑珍珠’(半高丛蓝莓)的荧光峰图，图6中d为其log转换后的荧光峰图。‘黑珍珠’叶片革质化严重，相对老化比较严重。‘黑珍珠’经FCM测定的荧光强度均值为438.33，CV值为7.73％，推测为四倍体。分析依据同上。据文献报道，最初培育半高丛蓝莓时选用的亲本为4倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
图7中E为实验材料美国蔓越桔的荧光峰图，图7中e为其log转换后的荧光峰图。美国蔓越桔叶片较小，革质化较轻。美国蔓越桔经FCM测定的荧光强度均值为308.56，CV值为6.08％，推测为二倍体。分析依据同上。文献中美国蔓越桔也称大果蔓越桔，据记载为2倍体，这也从一定程度上支持了本研究结果。
图8中F为实验材料野生蔓越桔(采自长白山)的荧光峰图，图8中f为其log转换后的荧光峰图。野生蔓越桔(采自长白山)叶片较小，革质化较弱。野生蔓越桔(采自长白山)经FCM测定的荧光强度均值为656.17，CV值为4.03％，推测为六倍体。分析依据同上。野生蔓越桔有2、4、6倍体的天然分布，学者在丹麦、芬兰都发现了6倍体蔓越桔，郝瑞等在我国长白山也发现了6倍体蔓越桔的分布，这也从一定程度上支持了本研究结果。
图9中G为实验材料野生笃斯越桔(采自长白山)的荧光峰图，图9中g为其log转换后的荧光峰图。野生笃斯越桔(采自长白山)的叶片较大，较为老化，已呈革质化。笃斯越桔(采自长白山)经FCM测定的荧光强度均值为513.89，CV值为5.13％，推测为四倍体。分析依据同上。文献记载长白山有笃斯越桔2、4倍体的天然分布区，但通常长白山区海拔小于1700m处分布的笃斯越桔都是4倍体种，高海拔区多是2倍体种。本实验材料采自低海拔区的漫江，所以应为4倍体。
图10中H为实验材料野生笃斯越桔(采自大兴安岭)的荧光峰图，图10中h为其log转换后的荧光峰图。该野生笃斯越桔(采自大兴安岭)叶片材料来源于已老化的试管苗。野生笃斯越桔(采自大兴安岭)经FCM测定的荧光强度均值为537.06，CV值为6.19％，推测为四倍体。分析依据同上。大兴安岭有2、4、6倍体笃斯越桔的天然分布，研究认为4倍体笃斯越桔为原种，其它两类为变种。本研究材料FCM测定的荧光均值与长白山区4倍体笃斯越桔相近，故推测也是4倍体。
图11中I为实验材料野生红豆越桔(采自大兴安岭)的荧光峰图，图11中i为其log转换后的荧光峰图。该野生红豆越桔(采自大兴安岭)叶片材料来源于温室新生嫩叶，稍革质。野生红豆越桔(采自大兴安岭)经FCM测定的荧光强度均值为417.76，CV值为7.35％，推测为四倍体。分析依据同上。红豆越桔也有2、4倍体的天然分布，其中4倍体种为原种，2倍体种为变种；且2倍体种为小果越桔，其植株矮小(2-10cm)，小叶；本次研究使用的红豆越桔材料从形态学上也更符合4倍体原种的特征。
结果表明基于本发明方法测定的蓝莓倍性与其它研究手段获得的结果一致，具有极高的可靠性。同时，由于本发明方法是基于流式细胞仪的测定方法，所以具有高效性，可快速的进行大批量的验证工作。且本方法以DAPI替代PI作为染色剂，所以该方法无需进行RNA酶处理，大大简化了实验流程，也减少了实验操作对细胞的破坏，使得实验结果中碎片减少，可获得较低的CV值。此外，DAPI比PI的稳定性更好，染色后的样品在低温过夜后再次检测，依然可以获得较好的结果，这也使得批量测定成为可能。值得注意的是，本研究使用的材料都是相对比较老化、革质化严重、多酚类物质含量较高的叶片材料，常规细胞学方法基本无法用于此类材料的倍性分析，所以，本方法的建立对于此类棘手材料的倍性分析具有重要意义。
Claims (10)
1.一种用流式细胞术鉴定蓝莓倍性的方法，包括如下步骤：
(1)配制包含如下组分的细胞核分离缓冲液：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为0.5％-2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇；
(2)向每克蓝莓叶片样品中加入4-10ml所述步骤(1)配制的细胞核分离缓冲液；
(3)将所述步骤(2)中的蓝莓叶片切碎后，过滤，收集滤液；
(4)将所述步骤(3)的滤液离心，弃上清，加入所述步骤(1)配制的细胞核分离缓冲液重悬沉淀物；
(5)加入4,6-联脒-2-苯基吲哚，染色；
(6)用流式细胞仪进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5mg-5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液包含如下组分：200mMTris、4mMMgCl2·6H2O、体积百分比为2％的TritonX-100；50mMβ-巯基乙醇；5g/50ml聚乙烯吡咯烷酮；30mM二硫苏糖醇。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述细胞核分离缓冲液的pH值为7.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括在所述步骤(4)重悬沉淀物之后进行静置裂解的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述加入细胞核分离缓冲液为冰浴的细胞核分离缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中所述切碎是在冰上进行；所述过滤是用300目尼龙膜过滤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述离心是用5000rpm转速于4℃离心1-5min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述4,6-联脒-2-苯基吲哚的浓度为1mg/ml，加入量为5μl；所述染色为冰上避光染色15min。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述流式细胞仪需具备355nm激发波长。
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