CN101135642A - 一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，属于生物技术领域。包括单细胞悬浮液的制备，采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，流式细胞仪倍性分析，发光源为488nm氩离子空冷激光；测定DNA分子荧光强度，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。流式细胞仪倍性检测结果与在成株期进行花期形态鉴别相一致。应用此法，可在幼苗期快速鉴定出不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性，大大提高DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。

Description

一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法

一、技术领域

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，属于生物技术领域，专用于用于不结球白菜游离小孢子再生植株倍性的快速鉴定。

二、技术背景

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，原产中国，是我国南方普遍种植的最大众化蔬菜，在蔬菜的周年供应中起着举足轻重的作用。不结球白菜为典型的异花授粉作物，自交衰退严重，优良杂交组合优势明显。利用单倍体途径的小孢子培养技术，可加速育种材料纯化，缩短育种周期，加速育种进程。通过游离小孢子培养获得的再生植株群体，除育种家需要的双单倉体(DH)植株外，还包含单倍体、三倍体、四倍体及非整倍体等，育种家必须花费大量的时间来鉴别真正的单倍体植株。有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用小孢子再生植株的基础，特别是苗期倍性鉴定不仅可以大大减少育种工作量，而且可以提前进行分子标记辅助选择和遗传图谱构建工作。

不结球白菜从苗期到开花期，没有明显的形态学性状可用于区别不同的倍性水平。尽管在开花期单倍体可能产生不正常的花和败育的花粉，个别四倍体植株可能产生较大的花，但二倍体和四倍体仍然难以区别。因此，长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性，主要方法有：花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等(刘仁样，1998；王培，1989)。这些显微方法不仅费时，而且技术难度大。此外，采用花粉大小判别法需在开花期进行，占地且费时；而采用保卫细胞长度测量法，由于单倍体和二倍体以及二倍体和四倍体的保卫细胞长度重叠而不准确。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物学特性进行分析的方法，流式细胞仪集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为试验室的“CT”。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。目前，流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，但在植物方面的应用直到20世纪80年代中期才开始。由于流式细胞仪可以直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平，不受植株生长发育时期和环境条件的影响，省时、高效，还可以检测出非整倍体以及混倍体。并已被成功地用于花椰菜(CHIANG，1985；ROULUND，1990)、青花菜(WANG，1999)、抱子甘蓝(周元昌，2002)、大白菜(韩阳，2006)的花培苗倍性鉴别上，但至今还未见该方法用于不结球白菜小孢子再生植株倍性鉴定的报道。应用流式细胞仪进行不结球白菜游离小孢子培养再生植株倍性分析将提高鉴定效率，从而加快育种进程。

三、发明内容

技术问题：本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，针对上述现有技术中不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定存在的问题，将流式细胞仪应用到不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定上，建立不结球白菜游离小孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系，从而提高不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定效率，加速育种材料的选育和遗传图谱的构建。

技术方案：对试管苗进行流式细胞仪倍性分析。由于DNA含量与荧光信号强度呈正比，以普通二倍体不结球白菜‘暑绿’(2n＝20)为对照，峰值与对照相近的为二倍体，为对照1/2的为单倍体，从而确定出样品的倍性水平。出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体，混倍体又可根据各峰值与二倍体峰值的倍数关系确定其构成细胞的倍性组成。

一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，包括：

(1)单细胞悬浮液的制备：

称取100mg试管苗嫩茎或幼叶在滴有2mL提取缓冲液：15mmol.L^-1 Tris-HCl、pH 7.5，80mmol·L^-1KCl，20mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1EDTA-Na₂，15mmol·L^-1巯基乙醇和体积比0.05％的Triton X-100的培养皿中切碎，300目尼龙网过滤，1000r/min离心并漂洗细胞3次，收集沉积细胞，加入2mL染色缓冲液，缓冲液中加3000 U·mL^-1RNA酶A，10μg·mL^-1碘化丙锭，暗处低温染色30min；500目尼龙网过滤，机用标准管收集，单细胞悬浮液随即上机测定；

(2)流式细胞仪倍性分析：

采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，其激发光源为488nm氩离子空冷激光；经激发，染色的DNA分子促发荧光，检测器测定荧光强度，通过光电倍增管(PMT)将光信号转变为电信号，经过放大，A/D转换，输入计算机进行分析并得到图像信号；与测定装置相连的计算机分析软件为：EXPO32ADCsoftware，即可对荧光强度进行分析；

所用鞘液购买于贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司；测量时间设定为300s；调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，进行FLOWCHECK校正，使各通道的变异系数CV稳定在3％以下，荧光强度由仪器自动检出；通过手动选择流速快慢保持细胞分离纯度；

以普通二倍体不结球白菜2n＝20为对照，二倍体对照分离峰的荧光强度处在140附近，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。

有益效果：本发明将流式细胞仪应用于不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定，建立了不结球白菜游离小孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系。与目前技术相比，其优点是：

(1)制样简单，该方法不受植物体取材部位和细胞所处时期限制，取材部位可以是叶片、茎、根、花、果皮、种子等。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小和很嫩时，此方法仅用1cm²的样品就很容易鉴定其材料倍性；

(2)测试速度快，仅用几分钟就可以分析上万个细胞，测定出单个细胞核内DNA含量，并且DNA含量变异可在分布图上直观地看出；

(3)灵敏度、分辨率及准确性较高，数据的可重复性好，特别适合于样品较多的倍性检测分析。

四、附图说明

图1为以普通二倍体不结球白菜为对照叶片的DNA含量直方图。

图2为不结球白菜游离小孢子培养再生植株单倍体叶片的DNA含量直方图。

图3为不结球白菜游离小孢子培养再生植株双单倍体叶片的DNA含量直方图。

图4为不结球白菜游离小孢子培养再生植株双单倍体与四倍体的嵌合体叶片的DNA含量

直方图。

图5为不结球白菜游离小孢子培养再生植株四倍体叶片的DNA含量直方图。

五、具体实施方式

本发明所提供的一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，包括：

1.材料与方法：对不结球白菜优良杂种‘暑绿’进行游离小孢子培养(耿建峰，2007)，获得小孢子再生植株156株，所用材料‘暑绿’，该品种市场出售；在南京农业大学园艺学院细胞遗传工作站采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，对试管苗进行流式细胞仪倍性分析。应用的分析软件为EXPO32ADCsoftware。

小孢子再生植株抽薹开花后对所有再生苗进行成株形态鉴定。单倍体植株枝条纤细，分枝多，花蕾、花瓣和花药小，无花粉，甚至无花药，套袋自交后基本不结籽，与二倍体和其它倍性有明显的区别。

2.单细胞悬浮液的制备：

称取100mg试管苗嫩茎或幼叶在滴有2mL提取缓冲液(15mmol·L^-1 Tris-HCl、pH 7.5，80mmol·L^-1KCl，20mmol·L^-1NaCl，20mmol·L^-1EDTA-Na₂，15mmol·L^-1巯基乙醇和0.05％(V/V)Triton X-100)的培养皿中切碎，300目尼龙网过滤，离心(1000r/min)并漂洗细胞3次，收集沉积细胞，加入2mL染色缓冲液[缓冲液中加3000U·mL^-1RNA酶A，10μg·mL^-1PI(碘化丙锭)]，暗处低温染色30min。500目尼龙网过滤，机用标准管收集，随即上机测定。

3.流式细胞仪倍性分析

测量时间设定为300s。测定前调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，仪器处于最佳状态，进行FLOWCHECK校正，使各通道的变异系数(CV)稳定在3％以下，荧光强度由仪器自动检出。通过控制流速保持细胞分离纯度。以普通二倍体不结球白菜‘暑绿’(2n＝20)为对照，峰值与对照相近的为二倍体，为对照1/2的为单倍体，从而确定出样品的倍性水平。

4.结果与分析：流式细胞仪倍性鉴定结果表明，二倍体对照分离峰的荧光强度处在140附近，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体，混倍体又可根据各峰值与二倍体峰值的倍数关系确定其构成细胞的倍性组成。不结球白菜‘暑绿’的156株小孢子再生植株中，有15株为单倍体(图2)，135株为双单倍体(图3)，5株为四倍体(图5)，1株为混倍体(图4)。单倍体与在花期进行的花器形态鉴别相吻合，但混倍体、四倍体与正常二倍体植株应用形态特征难以区分，而利用流式细胞仪可在几分钟内快速鉴定之。这样可以在幼苗期对单倍体进行加倍处理，获得更多的双单倍体，或者丢弃单倍体，以免继代保存，浪费人力和药品。特殊倍性的植株还可应用于细胞遗传学方面的研究。

本发明针对对大量的小孢子再生植株，建立了适宜不结球白菜游离小孢子培养再生植株的流式细胞仪倍性分析体系；大大提高了DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。

Claims (1)

1.一种不结球白菜游离小孢子再生植株的倍性鉴定方法，包括：

(1)单细胞悬浮液的制备：

称取100mg试管苗嫩茎或幼叶在滴有2mL提取缓冲液：15mmol·L^-1 Tris-HCl、pH 7.5，80mmol·L^-1 KCl，20mmol·L^-1 NaCl，20mmol·L^-1 EDTA-Na₂，15mmol·L^-1巯基乙醇和体积比0.05％的Triton X-100的培养皿中切碎，300目尼龙网过滤，1000r/min离心并漂洗细胞3次，收集沉积细胞，加入2mL染色缓冲液，缓冲液中加3000U·mL^-1RNA酶A，10μg·mL^-1碘化丙锭，暗处低温染色30min；500目尼龙网过滤，机用标准管收集，单细胞悬浮液随即上机测定；

(2)流式细胞仪倍性分析：

采用美国BeckMAN COULTER公司生产的Epics XL型号的流式细胞仪，其激发光源为488nm氩离子空冷激光；经激发，染色的DNA分子促发荧光，检测器测定荧光强度，通过光电倍增管将光信号转变为电信号，经过放大，A/D转换，输入计算机进行分析并得到图像信号；与测定装置相连的计算机分析软件为：EXPO32ADC software，即可对荧光强度进行分析；

所用鞘液购买于贝克曼库尔特实验系统有限公司；测量时间设定为300s；测量前，调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，进行FLOWCHECK校正，使各通道的变异系数CV稳定在3％以下，荧光强度由仪器自动检出；通过手动选择流速快慢保持细胞分离纯度；

以普通二倍体不结球白菜2n＝20为对照，二倍体对照分离峰的荧光强度处在140附近，待测植株峰值处在140附近的视为二倍体，而处在70和280附近的分别视为单倍体和四倍体。

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