CN111699782B - 一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻种子领域,公开了一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法。该方法包括步骤:提取水稻种子中的半乳糖,定量测定水稻种子中的半乳糖绝对含量;制备一批不同老化劣变程度的种子,分别测定半乳糖绝对含量,并测定种子发芽率,计算制定半乳糖含量与种子发芽率之间的回归方程;对需要判别的种子中的半乳糖含量进行提取和测定,根据回归方程计算(预测)需要判别的种子中的发芽率,结合我国《粮食作物种子第1部分禾谷类》中的规定,对需要判别是否合格的种子进行判别。本发明利用半乳糖含量作为衡量活力的指标,使种子活力的判别更加简单快速并具有可比性,提高了判别效率,节省了种子。
Description
技术领域
本发明属于水稻种子领域,特别涉及一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法。
背景技术
水稻种子是遗传物质的载体,是决定水稻能否正常发育、生产的先决因素,也是种质资源长期保存的重要材料。随着播种方式的变化和极端天气的频繁发生,农业生产对种子播种质量的要求逐年提高。在田间自然条件下,特别是逆境不利条件下,保持苗齐苗壮直接决定了水稻的生产潜力和效益。
由于种子特别是杂交稻种子生产的不可预测性,常需要对种子进行短期贮藏。由于种子在贮藏过程中存在老化劣变现象,导致发芽率下降,对水稻的生产潜力和效益负面影响相当大的。目前,判别种子是否合格的主要依据是《粮食作物种子第1部分禾谷类》中对于种子发芽率的规定,其中种子合格的依据为杂交稻发芽率大于80%、常规稻发芽率大于85%。而水稻种子发芽率的测定方法主要按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)进行,一般需要7天以上才能得到发芽率结果。随着种子贸易市场的发展,对种子是否合格的判断时间过长成为种子快速交易中的一个难点。在实际生产应用中有一种最常见的情况是,种子在销售运输的过程中遇到高温高湿条件,导致种子快速劣变,在很短的时间内发芽率急剧下降而丧失商品性能,因此,快速而有效地判定种子的是否合格非常重要。
种子在成熟过程中,体内的蛋白质、淀粉等物质逐渐积累,种子的发芽率也逐渐提高,至生理成熟期达到高峰。收获后的种子随着存贮时间增加,种子发芽率会逐渐减弱,贮藏在种子体内的物质转化为相关的代谢物,某些代谢物质的积累数量与种子发芽率呈现一定的相关性。因此,通过定向测量种子中的目标代谢产物的含量可以反过来预测水稻种子的发芽率,从而对种子是否合格进行判别。
实际上,用种子代谢物含量来间接判别种子活力从而判别种子发芽率的高低已有少量专利进行了公开。如一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法(申请公布号CN106680307 A)公开了用大豆种子提取物中代谢物绝对含量判别种子活力高低,代谢物可以是大豆中精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、二甲基尿酸盐中的一种或多种,但一是核磁共振设备昂贵成本高,二是水稻种子的代谢产物和大豆明显不同,两者之间没有比拟性。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足和缺点,本发明的目的在于提供一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法;本发明人在研究过程中发现,水稻种子中的代谢物-半乳糖(Galactose)含量与水稻种子发芽率密切相关,利用半乳糖含量与发芽率回归方程可快速判别种子是否合格。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,包括以下步骤:
(1)提取水稻种子中的半乳糖;
(2)采用步骤(1)的方法提取水稻种子中的半乳糖,利用半乳糖标准品曲线测定水稻种子中的半乳糖绝对含量;
(3)水稻种子中的半乳糖绝对含量与种子发芽率回归方程的制定:
利用人工老化和/或自然老化的方法获得一批不同老化劣变程度的水稻种子,分别测定种子发芽率,并且按照步骤(2)的方法分别测定半乳糖绝对含量;以发芽率为纵坐标,半乳糖的绝对含量为横坐标,制定半乳糖绝对含量与种子发芽率之间的回归方程;
(4)对需要判别的水稻种子采用步骤(1)的方法提取其中的半乳糖以及采用步骤(2)所述的方法测定半乳糖的绝对含量;
(5)对需要判别的水稻种子的发芽率进行预测并对种子是否合格进行判别:根据步骤(3)所得的回归方程以及步骤(4)所得的半乳糖的绝对含量,计算出需要判别的种子中的发芽率;根据所得发芽率,结合我国《粮食作物种子第1部分禾谷类》中的规定(正常杂交稻种子发芽率需不低于80%、常规稻发芽率不低于85%,见背景技术),对需要判别的水稻种子是否合格进行判别。
步骤(3)所述测定种子发芽率的具体方法是按照GB/T 3543“水稻种子发芽率测定方法”的规定进行测定。
步骤(3)所述半乳糖绝对含量与种子发芽率之间的回归方程是:y=-0.1881x+89.056,其中,y为发芽率,x为半乳糖的绝对含量,其单位为μg/g。
步骤(1)所述提取水稻种子中的半乳糖具体按照以下步骤:取水稻种子,或水稻种子中单独的胚或者胚乳,置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后,准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中,每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液,再加10μL核糖醇作为内标;提取时,离心管上下震荡1min,涡旋5min,再以11000rpm和4℃离心10min,将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中,置于真空浓缩干燥仪中干燥;在干燥后的半乳糖样品中,加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2h;再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺,混匀,在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取半乳糖衍生化样品(即半乳糖)转移到装有250μL内插管的进样瓶中,进样瓶置于自动进样盘内,进行GC-MS分析。
步骤(2)所述测定水稻种子中的半乳糖绝对含量具体按照以下步骤:将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析,利用半乳糖标准品制作的标准曲线,计算种子中半乳糖的绝对含量(单位μg/g);
所述GC-MS分析的具体条件如下:气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪(型号为GCMS-7890A-5975C);采用DB-35UI MS毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm);进样口温度为270℃;载气为高纯氦气,纯度>99.999%,流速1mL/min;分流进样,分流比50:1;升温程序为:90℃保持4min,以8℃/min速率升至205℃保持2min,以15℃/min速率升至310℃保持5min;进样量1μL。质谱的离子源EI,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,电子能量70eV,传输线温度300℃,质量扫描范围为85-700amu,采用SIM模式进行MS分析,溶剂延迟为5.00min;
所述标准曲线按照以下制作方法:精密称取半乳糖标准品1mg,置入1.5ml样品瓶中,加甲醇水溶解,摇匀,制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液。首先将0.1mg/ml(100ppm)的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液。然后取50ul不同浓度的标准品溶液,置于真空浓缩干燥仪中干燥。在干燥后的标准品中,加入50μL 20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2小时;再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺,混匀后在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析;采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,分别绘制标准曲线;
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;根据峰面积、标准曲线和样品重量,换算半乳糖的绝对含量。
所述标准曲线的方程式为:Y=41992.64065X-34780.521683,R2=0.9905,Y为峰面积,X为浓度。
本发明的原理是:
种子储藏老化劣变过程中,种子内的贮藏物质如贮藏蛋白等发生降解,某些代谢产物不断积累,导致发芽延迟或发芽率降低。我们研究发现,在种子储藏过程中,种子中半乳糖含量在一定时间范围内不断积累,半乳糖含量的积累与种子发芽率下降呈现一定的相关性。因此,通过定向测量种子中的目标代谢产物半乳糖的含量可以推算(预测)出种子的发芽率,根据种子的发芽率和国家标准,可以快速判别种子是否合格。
本发明相对现有技术,具有如下的优点及有益效果:
本发明克服了基于发芽率判别种子活力的耗时耗力的弊端、解决了利用其它代谢物方法设备昂贵成本高的缺陷,利用种子内含量较高的物质半乳糖含量作为衡量活力的指标,可使种子活力的判别更加简单快速并具有可比性,同时提高了判别效率,节省了种子。
附图说明
图1是种子发芽率与半乳糖含量的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例使用的原料和方法具体如下:
1、实验过程中所有水稻种子由广东省金稻种业有限公司提供。
2、人工老化处理种子的方法:老化处理前准备三个密封的干燥器,其中一个加入过饱和MgCl2溶液并置于20℃,其余两个各加入过饱和的KCl溶液并分别置于15℃和40℃。将收获的水稻种子分别用网袋装好放于15℃、相对湿度(R.H)85%中预处理3d后,分别转移到已经平衡好的干燥器中43℃、相对湿度(R.H)85%中处理8d,然后分别置于25℃、32%R.H干燥3d,密封贮藏于-20℃。
3、自然老化种子方法:将收获的水稻种子分别用网袋装好放于自然条件下进行贮藏。
4、水稻种子发芽率的测定方法按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)进行。
5、种子发芽率的计算公式:种子发芽率%=发芽种子数/总种子数×100%。
6、水稻种子中半乳糖的提取方法按以下步骤进行:
取水稻种子,或单独的水稻种胚或者胚乳,置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后,准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中,每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液,再加10μL核糖醇作为内标;提取时,离心管上下震荡1min,涡旋5min,再以11000rpm和4℃离心10min,将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中,置于真空浓缩干燥仪中干燥;在干燥后的半乳糖样品中,加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2h;再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA),混匀,在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取半乳糖衍生化样品转移到装有250μL内插管的进样瓶中,进样瓶置于自动进样盘内,进行后续步骤的GC-MS分析;
7、水稻种子样品中半乳糖的绝对含量的定量分析:
将按照上述方法提取得到的半乳糖进行GC-MS分析,利用半乳糖标准品制作的标准曲线,计算种子中半乳糖的绝对含量(单位μg/g);
所述GC-MS分析的具体条件如下:种子样品中半乳糖的提取同前。但GC-MS分析条件与相对定量略有不同:气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪(型号为GCMS-7890A-5975C)。采用DB-35UI MS毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm);进样口温度为270℃;载气为高纯氦气,纯度>99.999%,流速1mL/min;分流进样,分流比50:1;升温程序为:90℃保持4min,以8℃/min速率升至205℃保持2min,以15℃/min速率升至310℃保持5min;进样量1μL。质谱的离子源EI,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,电子能量70eV,传输线温度300℃,质量扫描范围为85-700amu,采用SIM模式进行MS分析,溶剂延迟为5.00min。采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息。根据标准曲线和样品重量,换算半乳糖的绝对含量。计算水稻种子,或水稻种子中单独的胚或者胚乳中代谢物半乳糖组分的绝对含量(μg/g)。
制作半乳糖标准曲线:精密称取半乳糖标准品1mg,置入1.5ml样品瓶中,加甲醇水溶解,摇匀,制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液。首先将0.1mg/ml(100ppm)的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液。然后取50ul不同浓度的标准品溶液,置于真空浓缩干燥仪中干燥。在干燥后的标准品中,加入50μL20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2小时;再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺,混匀后在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析;采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,分别绘制标准曲线(Y=41992.64065X-34780.521683,R2=0.9905,Y为峰面积,X为浓度)。
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;根据峰面积、标准曲线和样品重量,换算半乳糖的绝对含量(μg/g),具体是先根据峰面积和标准曲线得到溶液中的半乳糖浓度,得到溶液浓度后,再计算得到样品中半乳糖的含量,用如下公式:半乳糖含量(μg/g)=(溶液中的半乳糖浓度×提取溶液体积×稀释倍数)除以样品的重量。
实施例1:
取一定数量的南秀占种子,通过自然贮藏的方式,获得不同老化程度即发芽率不同的种子,分别测定种子中半乳糖的绝对含量和相应的发芽率(具体数据见表1)。结果表明:种子中半乳糖的绝对含量总体上有随着老化时间增加而提高的趋势;发芽率变化趋势与半乳糖相反,随着贮藏时间的延长发芽率呈现下降的趋势。
表1不同老化程度的南秀占种子发芽率与半乳糖含量
不同老化程度的不同品种 | 发芽率(%) | 半乳糖含量(μg/g) |
南秀占3 | 81.33333 | 50.8096 |
南秀占2 | 81.66667 | 45.9910 |
南秀占1 | 94 | 23.80915 |
实施例2:再取一定数量的广8优165、广8B、南优软占多个品种(组合)种子,通过自然贮藏不同时间后,分别测定种子中半乳糖的绝对含量和相应的发芽率(具体数据见表2)。
表2不同老化程度的种子发芽率与半乳糖含量的关系
以发芽率为y,半乳糖的绝对含量为x,建立x与y的回归方程(如图1所述)。综合计算广8优165、广8B、南优软占和南秀占的结果表明,回归方程为:y=-0.1881x+89.056,其决定系数为R2=0.9423。其中,y为发芽率(%),x为半乳糖的绝对含量(μg/g)。
实施例3
在种子贮藏库中,随机选取不同品种以及不同老化程度的种子进行半乳糖绝对含量的测定,根据实施例2得到的半乳糖绝对含量和发芽率之间的回归方程,计算(预测)种子发芽率;根据预测的发芽率,预判种子是否合格;然后按照“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543),对种子发芽率进行实测并实判种子是否合格,最后对种子是否合格预判结果和实判结果进行比较。具体结果和结论见表3。
表3不同老化程度的种子是否合格的判断
由本实施例可以说明,利用半乳糖与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法是正确的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)提取水稻种子中的半乳糖;
(2)采用步骤(1)的方法提取水稻种子中的半乳糖,利用半乳糖标准品曲线测定水稻种子中的半乳糖绝对含量;
(3)水稻种子中的半乳糖绝对含量与种子发芽率回归方程的制定:
利用人工老化和/或自然老化的方法获得一批不同老化劣变程度的水稻种子,分别测定种子发芽率,并且按照步骤(2)的方法分别测定半乳糖绝对含量;以发芽率为纵坐标,半乳糖的绝对含量为横坐标,制定半乳糖绝对含量与种子发芽率之间的回归方程;
(4)对需要判别的水稻种子采用步骤(1)的方法提取其中的半乳糖以及采用步骤(2)所述的方法测定半乳糖的绝对含量;
(5)对需要判别的水稻种子的发芽率进行预测并对种子是否合格进行判别:根据步骤(3)所得的回归方程以及步骤(4)所得的半乳糖的绝对含量,计算出需要判别的种子中的发芽率;根据所得发芽率,结合我国《粮食作物种子第1部分禾谷类》中的规定,对需要判别的水稻种子是否合格进行判别。
2.根据权利要求1所述的一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于:步骤(3)所述测定种子发芽率的具体方法是按照GB/T 3543“水稻种子发芽率测定方法”的规定进行测定。
3.根据权利要求1所述的一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于:步骤(3)所述半乳糖绝对含量与种子发芽率之间的回归方程是:y=-0.1881x+89.056,其中,y 为发芽率,x为半乳糖的绝对含量,其单位为μg/g。
4.根据权利要求1所述的一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于:步骤(1)所述提取水稻种子中的半乳糖具体按照以下步骤:取水稻种子,或水稻种子中单独的胚或者胚乳,置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后,准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中,每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液,再加10μL核糖醇作为内标;提取时,离心管上下震荡1min,涡旋5min,再以11000rpm和4℃离心10min,将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中,置于真空浓缩干燥仪中干燥;在干燥后的半乳糖样品中,加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2h;再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺,混匀,在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取半乳糖衍生化样品转移到装有250μL内插管的进样瓶中,进样瓶置于自动进样盘内,进行GC-MS分析。
5.根据权利要求1所述的一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于:步骤(2)所述测定水稻种子中的半乳糖绝对含量具体按照以下步骤:将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析,利用半乳糖标准品制作的标准曲线,计算种子中半乳糖的绝对含量,单位为μg/g;
所述GC-MS分析的具体条件如下:气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪;采用DB-35UI MS毛细管柱,尺寸为30m x 0.25mm x0.25μm;进样口温度为270℃;载气为高纯氦气,纯度>99.999%,流速1mL/min;分流进样,分流比50:1;升温程序为:90℃保持4min,以8℃/min速率升至205℃保持2min,以15℃/min速率升至310℃保持5min;进样量1μL;质谱的离子源EI,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,电子能量70eV,传输线温度300℃,质量扫描范围为85-700amu,采用SIM模式进行MS分析,溶剂延迟为5.00min;
所述标准曲线按照以下制作方法:精密称取半乳糖标准品1mg,置入1.5ml样品瓶中,加甲醇水溶解,摇匀,制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液;首先将0.1mg/ml的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液;然后取50ul不同浓度的标准品溶液,置于真空浓缩干燥仪中干燥;在干燥后的标准品中,加入50μL20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液,充分混匀,在37℃,200rpm下反应2小时;再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺,混匀后在37℃,200rpm下摇30min;反应结束后,立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析;采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,分别绘制标准曲线;
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取,获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息;根据峰面积、标准曲线和样品重量,换算半乳糖的绝对含量。
6.根据权利要求5所述的一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法,其特征在于:所述标准曲线的方程式为:Y=41992.64065X-34780.521683,R2=0.9905,Y为峰面积,X为浓度。
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