CN103959955B - 一种单粒玉米种子活力快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单粒玉米种子活力快速检测方法，包括以下步骤：利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取玉米胚乳核DNA；利用酶联免疫法（ELISA）检测玉米胚乳核DNA中8-OHdG的含量；通过建立种子老化模型和检测玉米胚乳核DNA中8-OHdG氧化水平实现对玉米胚乳核DNA氧化损伤的检测，快速检测单粒玉米种子活力。本发明提供的方法，分析速度快，简单且准确的实现单粒玉米种子的活力检测。
Description
技术领域
本发明涉及种子活力检测技术，特别是涉及一种单粒玉米种子活力快速检测方法。
背景技术
种子活力是种子质量的重要指标。高活力种子具有明显的生长优势和生产潜力，是单粒播种的关键。近年来，我国玉米生产逐渐向机械化单粒精量播种的方向发展。因此，有必要建立快速、简便且准确的单粒玉米种子的活力检测方法。
现有测定玉米种子活力的方法主要包括：（1）发芽实验，真实客观，但耗时长，且会消耗种子库存量；（2）2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）、红墨水染色法，简单快速，但破坏种子结构，准确性和灵敏度也差；（3）Q2技术，通过测定呼吸参数快速、准确的测定种子活力，不破坏种子的完整性，但需要昂贵的专门仪器。
玉米种子由胚和胚乳两大部分组成，其基因型分别为2n和3n，但它们的DNA组成相同。玉米种子成熟后，活力会发生不可逆转的劣变。核DNA在种子劣变过程中最容易遭受氧化损伤，尤其是DNA中的鸟嘌呤，其氧化产物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤最常用的生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有种子活力检测方法耗时长、种子用量大、准确性差的缺陷，提供一种快速、准确的单粒玉米种子活力检测的方法。通过检测玉米胚乳中核DNA氧化损伤程度分析单粒种子的活力，以适应玉米精播生产的需要。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析。
所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）；所述玉米胚乳核DNA氧化损伤检测利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳核DNA中8-OHdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通过建立种子老化模型实现。
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13~0.17g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.9~1.1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.9~1.1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.9~1.1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.9~1.1ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于48~52μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各48~52μL，向各标准液和样品溶液中分别加第一抗体溶液48~52μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230~270μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14~0.16g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.95~1.05ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.95~1.05ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.95~1.05ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于49~51μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各49~51μL，分别加第一抗体溶液49~51μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液240~260μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液98~102μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板洗涤3次，分别加入发光剂溶液98~102μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液98~102μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将样品溶液OD值代入此方程中，求得其反对数再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15g；
（2）将（1）中所得胚乳和1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇1ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于50μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各50μL，分别加第一抗体溶液50μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液250μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液100μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板洗涤3次，分别加入发光剂溶液100μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液100μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将样品溶液OD值代入此方程中，求得其反对数值乘以稀释倍数即为样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
所述CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成。
与现有技术相比，本发明解决了现有技术中种子活力检测方法耗时长、种子用量大、准确性差等问题，提供了一种简单、快速、准确的单粒玉米种子活力检测的方法。
附图说明
图1为切去部分胚乳的玉米种子发芽情况。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13~0.17g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.9~1.1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.9~1.1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.9~1.1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.9~1.1ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于48~52μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各48~52μL，分别加第一抗体溶液48~52μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230~270μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品实际浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例2
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14~0.16g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.95~1.05ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.95~1.05ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.95~1.05ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于49~51μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各49~51μL，分别加第一抗体溶液49~51μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液240~260μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液98~102μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板洗涤3次，分别加入发光剂溶液98~102μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液98~102μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品实际浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例3
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.9ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.9ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5600g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.9ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5600g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时;
（11）将（10）所得物以5600g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.9ml，轻轻上下颠倒3min;
（13）将（12）中所得物以5600g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于48μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测。8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各48μL，分别加第一抗体溶液48μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96μL，封盖后在常温下反应15min。反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液96μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；各浓度标准液对应的OD值分别为1.511，1.328，1.186，0.903，0.557，0.281；老化0d，2d，4d，6d玉米胚乳样品对应的OD值为：1.347，0.8598，0.6296，0.1292；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程y=–0.5069x+1.4237，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数5000即为各样品实际浓度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳样品对应的实际8-OHdG浓度为：0.758ng/g，5.562ng/g，7.833ng/g，12.671ng/g；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例4
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.95ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.95ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5800g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.95ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5800g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时;
（11）将（10）所得物以5800g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.95ml，轻轻上下颠倒3min;
（13）将（12）中所得物以5800g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于49μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测。8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各49μL，分别加第一抗体溶液49μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液240μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液98μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液98μL，封盖后在常温下反应15min。反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液98μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；各浓度标准液对应的OD值分别为1.511，1.328，1.186，0.903，0.557，0.281；老化0d，2d，4d，6d玉米胚乳样品对应的OD值为：1.3601，1.1003，0.7611，0.3099；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程y=–0.5069x+1.4237，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数5000即为各样品实际浓度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳样品对应的实际8-OHdG浓度为：0.627ng/g，3.191ng/g，6.536ng/g，10.986ng/g；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例5
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15g；
（2）将（1）中所得胚乳和1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时;
（11）将（10）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇1ml，轻轻上下颠倒3min;
（13）将（12）中所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于50μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测。8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各50μL，分别加第一抗体溶液50μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液250μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液100μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液100μL，封盖后在常温下反应15min。反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液100μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；各浓度标准液对应的OD值分别为1.511，1.328，1.186，0.903，0.557，0.281；老化0d，2d，4d，6d玉米胚乳样品对应的OD值为：1.3729，1.0651，0.6631，0.2349；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程y=–0.5069x+1.4237，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数5000即为各样品实际浓度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳样品对应的实际8-OHdG浓度为：0.501ng/g，3.537ng/g，7.502ng/g，11.726ng/g；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例6
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.16g；
（2）将（1）中所得胚乳和1.05ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入1.05ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入1.05ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时;
（11）将（10）所得物以6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇1.05ml，轻轻上下颠倒3min;
（13）将（12）中所得物以6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于51μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测。8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各51μL，分别加第一抗体溶液51μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液260μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液102μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液102μL，封盖后在常温下反应15min。反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液102μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；各浓度标准液对应的OD值分别为1.511，1.328，1.186，0.903，0.557，0.281；老化0d，2d，4d，6d玉米胚乳样品对应的OD值为：1.3998，0.8693，0.7082，0.1968；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程y=–0.5069x+1.4237，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数5000即为各样品实际浓度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳样品对应的实际8-OHdG浓度为：0.236ng/g，5.469ng/g，7.058ng/g，12.102ng/g；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
实施例7
一种单粒玉米种子活力快速检测方法，它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.17g；
（2）将（1）中所得胚乳和1.10ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/LTris-HCl，pH8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入1.10ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入1.10ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时;
（11）将（10）所得物以6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇1.10ml，轻轻上下颠倒3min;
（13）将（12）中所得物以6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于52μL10mmol/LTris-HCl(pH8.0)中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量。
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测。8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各52μL，分别加第一抗体溶液52μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液270μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液104μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液104μL，封盖后在常温下反应15min。反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液104μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；各浓度标准液对应的OD值分别为1.511，1.328，1.186，0.903，0.557，0.281；老化0d，2d，4d，6d玉米胚乳样品对应的OD值为：1.3863，0.9364，0.5983，0.2740；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程y=–0.5069x+1.4237，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数5000即为各样品实际浓度，老化0d，2d，4d，6d的玉米胚乳样品对应的实际8-OHdG浓度为：0.369ng/g，4.807ng/g，8.142ng/g，11.341ng/g；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力；
(1)种子老化模型的建立。
种子于45℃、100%湿度条件下分别处理0d，2d，4d，6d，其发芽率分别为96.7%、83.3%、36.7%、0%，种子活力随老化天数增加而剧烈下降；
(2)胚乳DNA8-OHdG氧化水平。
根据测定结果，8-OHdG含量在当年玉米种子中低于1.00ng/g；老化2天的种子为1.00-6.00ng/g；老化4天的种子为6.00-9.00ng/g；老化6天种子基本死亡，8-OHdG含量大于10.00ng/g。此范围适用于大多数玉米品种活力的检测分析。整个实验过程8h即可完成。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (4)
1.一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：玉米胚乳核DNA的提取，玉米胚乳核DNA氧化损伤检测，玉米胚乳核DNA活力分析；所述玉米胚乳核DNA的提取利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）；所述玉米胚乳核DNA氧化损伤检测利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳核DNA中8-OHdG的含量；所述玉米胚乳核DNA活力分析通过建立种子老化模型实现；
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.13~0.17g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.9~1.1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.9~1.1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.9~1.1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.9~1.1ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5600~6400g离心力离心5min，离心后收集沉淀，室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于48~52μL10mmol/LpH8.0的Tris-HCl中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各48~52μL，向各标准液和样品溶液中分别加第一抗体溶液48~52μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液230~270μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液96~104μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液96~104μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液96~104μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将各样品检测OD值代入此方程中，求得其反对数值再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
2.如权利要求1所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.14~0.16g；
（2）将（1）中所得胚乳和0.95~1.05ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入0.95~1.05ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入0.95~1.05ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇0.95~1.05ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以5800~6200g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于49~51μL10mmol/LpH8.0的Tris-HCl中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各49~51μL，分别加第一抗体溶液49~51μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液240~260μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液98~102μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液98~102μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液98~102μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将样品溶液OD值代入此方程中，求得其反对数再乘以稀释倍数即为各样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
3.如权利要求2所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：它由以下步骤组成：
a、利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取单粒玉米胚乳核DNA；
（1）室温下，老化0d，2d，4d，6d的单粒玉米种子于蒸馏水中吸涨2h，以垂直于胚的方向斜后方切取胚乳0.15g；
（2）将（1）中所得胚乳和1ml预热的65℃的CTAB溶液加入研钵中快速研磨至胚乳呈匀浆状，将其倾入离心管中；
（3）将（2）中所得的匀浆状的胚乳在65℃温度下保育20min，期间轻轻上下颠倒2次；
（4）保育结束后，将（3）中所得的胚乳室温放置5min；
（5）向（4）中所得的胚乳中加入1ml苯酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（6）将（5）所得胚乳以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（7）向（6）中所得上清液中加入1ml氯仿/异戊醇体积比为24:1的溶液，轻轻上下颠倒至混匀；
（8）将（7）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集上清液；
（9）向（8）中所得上清液中加入上清液体积的0.6倍的异丙醇，轻轻上下颠倒一次；
（10）将（9）所得物在4oC温度下保育1小时；
（11）将（10）所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀；
（12）向（11）中所得沉淀加入70%乙醇1ml，轻轻上下颠倒3min；
（13）将（12）中所得物以6000g离心力离心5min，离心后收集沉淀、室温干燥，得到玉米胚乳核DNA；
（14）将（13）所得玉米胚乳核DNA溶于50μL10mmol/LpH8.0的Tris-HCl中；
b、利用酶联免疫法（ELISA）检测胚乳DNA中8-OHdG的含量；
胚乳DNA可利用紫外分光光度法定量，DNA氧化损伤利用8-OHdG特异抗体、通过ELISA检测；8-OHdG检测试剂盒可以商业购买；
（1）在96孔板的各孔加浓度分别为2.5pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，40pg/ml，80pg/ml的8-OHdG标准液和样品溶液各50μL，分别加第一抗体溶液50μL，摇晃酶标板使其充分混合，封盖后在37℃的环境中温浴1h；
（2）反应结束后，倒掉反应液，分别加入洗净液250μL，左右摇晃，使其充分洗净，然后倒掉洗净液，重复操作3次；
（3）向所述酶标板各孔板中加第二抗体溶液100μL，封盖后在37℃环境中温浴lh；
（4）将所述酶标板各孔板用洗净液洗涤3次，分别加入发光剂溶液100μL，封盖后在常温下反应15min；反应中用锡箔纸包住酶标板以避光，左右摇晃，使其充分混合；
（5）向所述酶标板各孔板中加反应终止液100μL，使反应停止，在酶标仪上用450nm波长测定吸光度，得到各标准液和样品溶液的相应OD值；
（6）用已知标准液浓度及其相应的OD值做半对数曲线，得出回归方程，将样品溶液OD值代入此方程中，求得其反对数值乘以稀释倍数即为样品中8-OHdG浓度；
c、通过与老化种子测定结果的比较，评价单粒种子的活力。
4.如权利要求1或2或3所述的一种单粒玉米种子活力快速检测方法，其特征在于：所述CTAB溶液由3%CTAB，0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，20mmol/LDTT组成。
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Non-Patent Citations (5)
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| 人工老化对玉米种子蛋白质组的影响;王继红 等;《河南农业大学学报》;20090630;第43卷(第3期);第232-234页 * |
| 污染胁迫下的分子生物标志物和分子诊断技术;何康信，周启星;《2012全国农业重金属污染检测与防治与学术研讨会会刊》;20121231;第21-28页 * |
| 玉米种子人工老化过程中胚蛋白质组的变化研究;林信海;《福建农林大学硕士学位论文》;20110415;第1-8页 * |
| 玉米种子活力的生理学和蛋白质组学研究;陈绍宁;《河南农业大学硕士学位论文》;20120315;第1-6页 * |
| 适用于分子标记辅助育种的玉米单粒胚乳DNA快速提取方法;郭景伦;《农业与技术》;20051031;第25卷(第5期);第113-114页 * |
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