CN114793535A - 一种检测紫苏种子发芽率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测紫苏种子发芽率的方法，涉及紫苏种子鉴别技术领域。本发明利用GC‑IMS对孵育后的待测紫苏种子进行挥发性有机物的分析检测，将所得挥发性有机物信号峰体积代入到偏最小二乘回归模型(挥发性有机物的信号峰体积数据与紫苏种子发芽率的线性关系曲线)中即可计算得到紫苏种子的发芽率与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率。本发明提供的检测方法，结合了气相色谱高分离度和离子迁移谱高灵敏度的优势，能够实现紫苏种子发芽率的快速、无损、准确检测，检测效率高。而且，本发明提供的检测方法操作简单，检测成本低。
Description
技术领域
本发明涉及种子鉴别技术领域，具体涉及一种检测紫苏种子发芽率的方法。
背景技术
紫苏(Perilla frutescens)，唇形科、紫苏属，一年生草本药用植物。药食兼用，以全草入药，具解表散寒，行气宽中的功效。种子宽倒卵形或圆形，表面棕灰色、黄棕色或暗褐色，种子中粗脂肪含量高达34～45％，富含不饱和脂肪酸，比例达93～95％。紫苏种子发芽率是紫苏种子检验中的重要指标，发芽率的高低与农业生产和紫苏种子经营有着密切的关系，紫苏种子含油量高，不耐贮藏，隔年播种发芽率低，仅为30～40％，因此筛选出高发芽率的紫苏种子对紫苏生产具有重要的意义。目前，测定紫苏种子发芽率的主要方法有直接测定法和间接测定法。直接测定法根据国家标准或相关规程规定的条件，在人工气候箱中进行试验，过程大多需要1～2周时间，检测结果准确，重复性好。然而，直接测定法试验工作量大，检测周期长，无法满足当今种业快速发展的要求。间接测定法主要有染色法、电导率法、吸胀状态法以及酶学方法，间接法测量比直接法测量耗时短，然而，间接检测法会对紫苏种子造成破坏，检测过的紫苏种子发芽能力丧失，或贮藏性能明显降低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测紫苏种子发芽率的方法，本发明提供的方法能够实现紫苏种子发芽率的快速无损检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测紫苏种子发芽率的方法，包括以下步骤：
将待测紫苏种子进行孵育，得到孵育种子；
利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
根据预定的PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率；所述PLSR模型为挥发性有机物的信号峰体积数据与紫苏种子发芽率的线性关系曲线。
优选的，将所述PLSR模型替换为VIP-PLSR模型，所述VIP-PLSR模型的计算式如下：
其中，Y为发芽率(％)；b0为常数；bi为回归系数；Xi为挥发性有机物信号峰体积；i为不小于1的整数。
优选的，所述PLSR模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)将不同发芽率的紫苏种子样本进行发芽，得到样本发芽率；
(2)将所述紫苏种子样本进行孵育得到孵育紫苏种子；
利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育紫苏种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
(3)以所述挥发性有机物信号峰体积作为自变量，以所述样本发芽率作为因变量，进行数据标准化预处理，以交叉验证均方根误差随因子数的变化确定最佳因子数，得到PLSR模型；所述最佳因子数为交叉验证均方根误差最小时对应的因子数；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
优选的，所述气相色谱-离子迁移谱的检测条件包括：
色谱柱：MXT-5气相色谱柱；
柱温：60℃；
载气流量程序：0～2min，2mL/min；2～10min，由2mL/min均速增加至10mL/min；10～20min，由10mL/min均速增加至100mL/min；20～25min，100mL/min；
漂移气流量：150mL/min；
IMS温度：60℃；
进样体积：500μL；
进样针温度：85℃。
优选的，所述孵育的温度为25～45℃，时间为10～30min，转速为400～600rpm。
优选的，所述孵育在顶空瓶中进行；所述待测紫苏种子或紫苏种子样本的质量与顶空瓶的容积之比为1～5g：20mL。
优选的，所述挥发性有机物包括醇类化合物、酮类化合物、醛类化合物、酸类化合物和酯类化合物。
本发明提供了一种检测紫苏种子发芽率的方法，包括以下步骤：将待测紫苏种子进行孵育，得到孵育种子；利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；根据预定的PLSR模型(偏最小二乘回归模型)与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率；所述PLSR模型为挥发性有机物的信号峰体积数据与紫苏种子发芽率的线性关系曲线。不同发芽率的紫苏种子代谢水平不同，其挥发出的有机物存在浓度上的差异，与紫苏种子发芽相关性较高的化合物有醇、醛、烯醇、烯醛、酮、呋喃等挥发性有机物。本发明提供的检测方法，采用的气相色谱-离子迁移谱(GC-IMS)结合了气相色谱高分离度和离子迁移谱高灵敏度的优势，无需对待测紫苏种子进行特殊前处理即可实现样品中的痕量挥发性有机物的检测，根据挥发性有机物信号峰体积与偏最小二乘回归(PLSR)模型即可直接计算得到紫苏种子的发芽率。本发明提供的检测方法能够实现紫苏种子发芽率的快速无损检测，检测效率高。而且，本发明提供的检测方法操作简单，检测成本低。
附图说明
图1为实施例测试紫苏发芽率的流程图；
图2为紫苏种子的挥发性有机物指纹图谱；
图3为RMSECV随因子数的变化情况；
图4为训练集和测试集的发芽率预测值和实测值之间的关系图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测紫苏种子发芽率的方法，包括以下步骤：
将待测紫苏种子进行孵育，得到孵育种子；
利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
根据预定的PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率；所述PLSR模型为挥发性有机物信号峰体积与紫苏种子发芽率的线性关系曲线。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将待测紫苏种子进行孵育，得到孵育种子。
在本发明中，所述孵育的温度优选为25～45℃，更优选为30～40℃，进一步优选为35℃，时间优选为10～30min，更优选为15～25min，进一步优选为20min，转速优选为400～600rpm，更优选为450～550rpm，进一步优选为500rpm。在本发明中，所述孵育的容器优选为顶空瓶。在本发明中，所述待测紫苏种子的质量与顶空瓶的容积之比优选为1～5g：20mL，更优选为1～4g：20mL，进一步优选为1～2g：20mL。
得到孵育种子后，本发明利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积。
在本发明中，所述气相色谱-离子迁移谱的检测条件优选包括：
色谱柱：MXT-5气相色谱柱，在本发明的具体实施例中，所述MXT-5气相色谱柱优选购买于美国RESTEK公司，柱长优选为15m，内径优选为0.53m，膜厚优选为1.0μm；
柱温：60℃；
气相色谱的载气流量程序：0～2min，2mL/min；2～10min，由2mL/min均速增加至10mL/min；10～20min，由10mL/min均速增加至100mL/min；20～25min，100mL/min；
离子迁移谱的漂移气流量：150mL/min；
载气/漂移气：N2；
IMS温度：60℃；
进样体积：500μL；
进样方式：自动顶空进样。
在本发明中，所述气相色谱-离子迁移谱检测采用的GC-IMS仪器优选为
风味分析仪(山东海能科学仪器有限公司公司)。
在本发明中，所述挥发性有机物优选包括醇类化合物、酮类化合物、醛类化合物、酸类化合物和酯类化合物；所述挥发性有机物的种类优选为79种，具体如表1所示。
表1挥发性有机物
注：表中化合物名称一列的数字1～20代表迁移谱库中未定性的物质。
在本发明中，挥发性有机物信号峰体积优选由VOCal软件对各类挥发性有机物的信号峰体积进行定量分析得到。
得到挥发性有机物信号峰体积后，本发明根据预定的PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率；所述PLSR模型为挥发性有机物信号峰体积与紫苏种子发芽率的线性关系曲线。
在本发明中，所述PLSR模型的建立方法，优选包括以下步骤：
(1)将不同发芽率的紫苏种子样本进行发芽，得到样本发芽率；
(2)将所述紫苏种子样本进行孵育，得到孵育种子；利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
(3)以所述挥发性有机物信号峰体积作为自变量，以所述样本发芽率作为因变量，进行数据标准化预处理，以交叉验证均方根误差随因子数的变化确定最佳因子数，得到PLSR模型；所述最佳因子数为交叉验证均方根误差最小时对应的因子数；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
本发明将不同发芽率的紫苏种子样本进行发芽，得到样本发芽率。
在本发明中，所述不同发芽率的发芽率数据个数优选≥5，更优选为10～15。所述不同发芽率优选包括0～100％，更优选为0～95％；在本发明的实施例中，每一个发芽率的数据进行3～6次平行试验。
本发明对于所述发芽没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的发芽试验方法进行发芽即可，具体如标准发芽试验(直接法)或间接法，所述间接法优选包括染色法、电导率法、吸胀状态法或酶学方法；本发明对于所述发芽的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的紫苏种子发芽条件即可。在本发明的具体实施例中，优选采用标准发芽试验进行发芽，具体包括以下步骤：将15份不同发芽率的紫苏种子样本分别置于清水中在室温(25℃)条件下浸泡24h，然后分别置于发芽盒内的纸上，在25℃光照培养箱内进行发芽，第8天统计每盒发芽盒的发芽率；所述发芽率优选为3个平行试验的发芽率平均值。在本发明中，所述发芽盒内底部优选垫有海绵，所述海绵表面铺有发芽纸作为发芽床，所述海绵的厚度优选为1cm；所述发芽纸的层数优选为1层。在本发明中，每盒发芽盒内紫苏种子的粒数优选为100粒。
本发明将所述紫苏种子样本进行孵育，得到孵育种子；利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积。在本发明中，所述孵育和挥发性有机物信号峰体积的获得条件优选与前述待测紫苏种子的孵育和挥发性有机物信号峰体积的获得条件相同，在此不再赘述。
得到样本发芽率和挥发性有机物信号峰体积后，本发明以所述挥发性有机物信号峰体积作为自变量，以所述样本发芽率作为因变量，进行数据标准化预处理，以交叉验证均方根误差随因子数的变化确定最佳因子数，得到PLSR模型；所述最佳因子数为交叉验证均方根误差最小时对应的因子数。在本发明中，所述数据标准化预处理优选利用Matlab软件进行，优选为(单个变量中的各项数据-该变量的各项数据相应的均值)/该变量的标准差。
在本发明的具体实施例中，所述紫苏种子的最佳因子数为17，所述PLSR模型如式(1)所示：
其中，Y为发芽率(％)；B0为常数；Bj为回归系数；Xj为挥发性有机物信号峰体积；j为不小于1的整数，j为表1中挥发性有机物的序号。所述PLSR模型的决定系数(R2)＝0.9989，均方根误差(RMSE)＝1.0715％。
本发明优选采用KS算法对样本(所述样本发芽率和挥发性有机物信号峰体积)进行分组，分为训练集和测试集；所述训练集用于建立PLSR模型，所述测试集用于验证所述PLSR模型。在本发明中，所述训练集和测试集的样本数之比优选为1～5：1，更优选为2～4：1，进一步优选为2～3：1。在本发明中，所述验证的方法优选与将测试集的挥发性有机物信号峰体积代入所述PLSR模型中进行发芽率的预测，并通过比较预测的发芽率和测试集的样本发芽率进行对照以验证PLSR模型的准确性。
在本发明中，所述PLSR模型优选替换为VIP-PLSR模型，即将根据预定的PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率替换为根据VIP-PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率。
在本发明中，所述VIP-PLSR模型的构建方法，优选包括以下步骤：采用变量投影重要性(VIP)方法，计算所述PLSR模型中各个自变量的VIP值，将不小于1的VIP值为作为自变量，以发芽率为因变量构建VIP-PLSR模型。
在本发明中，所述VIP-PLSR模型的计算式如式(2)所示：
其中，Y为发芽率(％)；b0为常数；bi为回归系数；Xi为挥发性有机物信号峰体积；i为不小于1的整数，i为表1中挥发性有机物的序号。
在本发明中，所述VIP-PLSR模型的训练集的决定系数(R2)为0.9940，均方根误差(RMSE)为2.4518％；测试集的决定系数(R2)为0.9801，均方根误差(RMSE)为4.4471％。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
采用图1所示的流程图进行检测。
(1)确定15份紫苏种子的发芽率
收集15份不同发芽率的紫苏种子，进行标准发芽试验确定发芽率，具体步骤如下：将紫苏种子分别置于清水中在25℃条件下浸泡24h，置于发芽盒(1cm厚海绵，海绵表面铺有一层发芽纸)内的发芽纸上，每份紫苏种子均设置3个平行实验，每个发芽盒内含100粒紫苏种子，置于25℃光照培养箱内进行发芽，第8天统计每盒的发芽率情况，计算每份紫苏种子的3个发芽率的平均值作为该份紫苏种子的发芽率，得到15个不同发芽率的样本发芽数据，分别为84.7％、72.3％、69.3％、69.3％、93.3％、64.7％、8.7％、6.7％、41.0％、66.3％、0％、60.0％、0％、64.3％、32.7％，依次记为1～15号紫苏种子。
(2)挥发性有机物检测
每份紫苏种子称取1g置于20mL顶空瓶内，在35℃、500rpm条件下孵育20min，采用
风味分析仪对紫苏种子中的挥发性有机物进行GC-IMS分析检测，使用
风味分析仪配套的软件VOCal对各类挥发性有机物的信号峰体积进行定量分析，共获得79种挥发性有机物的信号峰体积数据。共检测15份紫苏种子，每份紫苏种子6次平行实验，共获得90个建模样本的挥发性有机物信号峰体积。
其中，GC-IMS分析检测的分析条件如表2所示，气相色谱条件如表3所示：
表2分析条件
表3气相色谱条件
图2为紫苏种子的挥发性有机物指纹图谱，图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰(同一份紫苏种子有6个重复样品)，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰，从图中看出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。由图2可知，15种紫苏种子其中7号和8号紫苏种子样品明显和其他紫苏种子样品的挥发性物质的差异最大，7号和8号紫苏种子样品中大部分挥发性物质的浓度高于其他紫苏种子样品的；1号和10紫苏种子样品的挥发性物质较接近，3号和5号紫苏种子样品的挥发性物质较接近，12号～15号紫苏种子样品的挥发性物质较接近。
(3)建立PLSR模型和验证PLSR模型
以步骤(2)中得到的90个样本的挥发性有机物信号峰体积为自变量，每个样本对应的步骤(1)中确定的发芽率为因变量(来源于同一份紫苏种子的6个样本采用相同的发芽率)，采用KS算法对样本分成训练集和测试集分组，其中训练集60个样本，测试集30个样本，以训练集的79种挥发性有机物的信号峰体积数据为自变量，发芽率为因变量，建立偏最小二乘回归(PLSR)模型，根据交叉验证均方根误差(RMSECV)随因子数的变化(如图3所示)，确定PLSR模型的最佳因子数，RMSECV最小时对应的因子数确定为最佳因子数，最佳因子数为17。将测试集的挥发性有机物的信号峰体积数据代入所述PLSR模型中预测紫苏种子的发芽率。
图4为训练集和测试集的发芽率预测值和实测值之间的关系，由图4可知，训练集的R2＝0.9989，RMSE＝1.0715％，测试集的R2＝0.9941，RMSE＝2.6729％，说明，本发明提供的方法能够实现紫苏种子发芽率的准确预测以及测试。
(4)建立VIP-PLSR模型和验证VIP-PLSR模型
在步骤(3)的PLSR模型的基础上，采用变量投影重要性(VIP)方法，计算各个自变量的VIP值，根据计算结果，共有35个VIP值不小于1的变量。以筛选得到的35个自变量建立VIP-PLSR模型。VIP-PLSR模型如式(2)所示，bi对应具体数值如表4所示，Xi对应挥发性有机物如表5所示：
表4bi对应的回归系数数值
| b<sub>0</sub> | 134.7425 | b9 | -0.01034 | b<sub>18</sub> | -0.03374 | b<sub>27</sub> | -0.02967 |
| b<sub>1</sub> | 0.014805 | b10 | 0.217854 | b<sub>19</sub> | 0.092616 | b<sub>28</sub> | 0.164816 |
| b<sub>2</sub> | -0.30253 | b11 | 0.203824 | b<sub>20</sub> | -0.01686 | b<sub>29</sub> | -0.04659 |
| b<sub>3</sub> | -0.19802 | b12 | -0.12431 | b<sub>21</sub> | 0.067598 | b<sub>30</sub> | 0.018533 |
| b<sub>4</sub> | -0.00413 | b13 | -0.11412 | b<sub>22</sub> | 0.131404 | b<sub>31</sub> | 0.008948 |
| b<sub>5</sub> | -0.18442 | b14 | -0.00441 | b<sub>23</sub> | -0.02179 | b<sub>32</sub> | 0.025662 |
| b<sub>6</sub> | -0.08548 | b15 | 0.019341 | b2<sub>4</sub> | 0.015357 | b<sub>33</sub> | 0.025212 |
| b<sub>7</sub> | -0.20695 | b16 | -0.02756 | b2<sub>5</sub> | -0.04596 | b<sub>34</sub> | -0.00402 |
| b<sub>8</sub> | -0.00603 | b17 | 0.003517 | b<sub>26</sub> | 0.141838 | b<sub>35</sub> | -0.00552 |
表5Xi对应挥发性有机物
| X<sub>1</sub> | 1 | X<sub>13</sub> | 1-戊烯-3-醇二聚体 | X<sub>25</sub> | (E)-2-戊烯醛单体 |
| X<sub>2</sub> | 2 | X<sub>14</sub> | 1-戊烯-3-醇单体 | X<sub>26</sub> | 2-正戊基呋喃 |
| X<sub>3</sub> | 4 | X<sub>15</sub> | 1-丙醇二聚体 | X<sub>27</sub> | 3-甲基丁醛单体 |
| X<sub>4</sub> | 9 | X<sub>16</sub> | 2-(2-丁氧基乙氧基)乙醇二聚体 | X<sub>28</sub> | 戊酸乙酯二聚体 |
| X<sub>5</sub> | 11 | X<sub>17</sub> | 2-(2-丁氧基乙氧基)乙醇单体 | X<sub>29</sub> | 戊酸乙酯单体 |
| X<sub>6</sub> | 14 | X<sub>18</sub> | 2-乙基呋喃 | X<sub>30</sub> | 己醛单体 |
| X<sub>7</sub> | 17 | X<sub>19</sub> | (E)-2-庚烯醛 | X<sub>31</sub> | 异戊醇单体 |
| X<sub>8</sub> | 18 | X<sub>20</sub> | 2-己烯醛二聚体 | X<sub>32</sub> | 正己醇二聚体 |
| X<sub>9</sub> | 20 | X<sub>21</sub> | 2-己烯醛单体 | X<sub>33</sub> | 正己醇单体 |
| X<sub>10</sub> | 1-辛烯-3-酮 | X<sub>22</sub> | (E)-2-辛烯醛 | X<sub>34</sub> | 4-异丙基苯甲醇二聚体 |
| X<sub>11</sub> | 1-戊醇二聚体 | X<sub>23</sub> | 2-戊酮二聚体 | X<sub>35</sub> | 4-异丙基苯甲醇单体 |
| X<sub>12</sub> | 1-戊醇单体 | X<sub>24</sub> | (E)-2-戊烯醛二聚体 |
由表4～5可知，VIP-PLSR模型训练集的决定系数(R2)为0.9940，均方根误差(RMSE)为2.4518％，测试集的决定系数(R2)为0.9801，均方根误差(RMSE)为4.4471％，相较于PLSR模型，VIP-PLSR模型的预测效果略有下降，但仍有应用价值，且自变量个数从79个减少到35个，提高了模型运行效率，减少了需要检测的挥发性有机物数量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种检测紫苏种子发芽率的方法，包括以下步骤：
将待测紫苏种子进行孵育，得到孵育种子；
利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子中总的挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
根据预定的PLSR模型与所述挥发性有机物信号峰体积得到待测紫苏种子的发芽率；所述PLSR模型为挥发性有机物的信号峰体积数据与紫苏种子发芽率的线性关系曲线。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述PLSR模型替换为VIP-PLSR模型，所述VIP-PLSR模型的计算式如下：
其中，Y为发芽率(％)；b0为常数；bi为回归系数；Xi为单种挥发性有机物信号峰体积；i为不小于1的整数。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PLSR模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)将不同发芽率的紫苏种子样本进行发芽，得到样本发芽率；
(2)将所述紫苏种子样本进行孵育，得到孵育种子；
利用气相色谱-离子迁移谱对所述孵育种子的总的挥发性有机物进行分析检测，得到挥发性有机物信号峰体积；
(3)以所述挥发性有机物信号峰体积作为自变量，以所述样本发芽率作为因变量，进行数据标准化预处理，以交叉验证均方根误差随因子数的变化确定最佳因子数，得到PLSR模型；所述最佳因子数为交叉验证均方根误差最小时对应的因子数；
所述步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-离子迁移谱的检测条件包括：
色谱柱：MXT-5气相色谱柱；
柱温：60℃；
载气流量程序：0～2min，2mL/min；2～10min，由2mL/min均速增加至10mL/min；10～20min，由10mL/min均速增加至100mL/min；20～25min，100mL/min；
漂移气流量：150mL/min；
IMS温度：60℃；
进样体积：500μL；
进样针温度：85℃。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为25～45℃，时间为10～30min，转速为400～600rpm。
6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述孵育在顶空瓶中进行；所述待测紫苏种子或紫苏种子样本的质量与顶空瓶的容积之比为1～5g：20mL。
7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述挥发性有机物包括醇类化合物、酮类化合物、醛类化合物、酸类化合物和酯类化合物。
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