CN111766314A - 一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法 - Google Patents
一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于水稻种子领域，公开了一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力种子的方法。该方法包括步骤：提取水稻种子中的半乳糖，定量测定水稻种子中的半乳糖含量；采用上述方法测定水稻新种子中的半乳糖含量作为该水稻种子的基准活力指标；采用上述方法测定需要判别种子活力的水稻种子中的半乳糖含量；计算出需要判别种子活力的水稻种子中的半乳糖含量和水稻种子的基准活力指标的比值K；计算出自然老化2年后的水稻种子的半乳糖含量和水稻种子的基准活力指标的比值，记为K1；根据K值是否大于等于K1，判别储藏后水稻种子是否属于低活力陈种子，当K值≥K1值时，判定储藏后水稻种子属于陈种子。
Description
技术领域
本发明属于水稻种子领域，特别涉及一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法。
背景技术
水稻种子是遗传物质的载体，是决定水稻能否正常发育、生产的先决因素，也是种质资源长期保存的重要材料。随着播种方式的变化和极端天气的频繁发生，农业生产对种子播种质量的要求逐年提高。在田间自然条件下，特别是逆境不利条件下，保持苗齐苗壮直接决定了水稻的生产潜力和效益。
由于种子特别是杂交稻种子生产的不可预测性，常需要对种子进行短期贮藏。由于种子在贮藏过程中存在老化劣变现象，导致活力下降，对水稻的生产潜力和效益负面影响相当大的。在实际生产应用中有一种最常见的情况是，种子在销售运输的过程中遇到高温高湿条件，导致种子快速劣变，在很短的时间内活力急剧下降而丧失商品性能，因此，快速而有效地判定种子的活力非常重要。
种子活力(seed vigor)是在广泛的田间条件下，决定种子迅速整齐出苗以及幼苗正常生长的潜力，是种子质量的重要指标。种子活力是在种子发育过程中形成的，至生理成熟期达到高峰。随后在种子储藏、运输等阶段，成熟的种子会不可避免地经历活力下降的不可逆的变化过程，即种子劣变或老化。种子老化程度越高，活力水平越低。种子活力是种子发芽和出苗率、幼苗生长的潜力、植株抗逆能力和生产潜力的总和，是决定种子在发芽和出苗期间的活性强度和种子特征的综合表现。
种子活力测定方法较多，分为直接测定法和间接测定法两类。直接测定法是模拟田间不良环境，观察测定种子表达的直观特性，如种子的发芽率、种子的出苗能力，整齐度等，直接法准确但耗时费工。一般在研究过程中，由于时间太长难以通过直接测定法去比较种子的活力高低。间接法是通过测定某些与种子活力有关的生理生化指标间接反映种子活力。目前，国际种子检验协会推荐了两种活力测定方法，即电导率法和人工加速老化法。但电导率测定只能在特定的品种中使用，如适应于测定豌豆种子，但在具有半透层的牧草种子活力评价中存在争议；人工加速老化试验被列入种子活力ISTA规程，但人工老化本来耗时已久，加上发芽实验，耗时近3周，而且用种量大。后来一些其它的种子活力测定方法应用而生，如平均发芽时间、胚根突出法、近红外和高光谱技术、无损检测技术等，但耗时或准确度仍存在改进的空间。
贮藏物质的积累是种子活力形成的基础。伴随着种子成熟，体内的蛋白质、淀粉等物质逐渐积累，种子的发芽率及活力也逐渐提高，至生理成熟期达到高峰。收获后的种子随着存贮时间增加，种子活力会逐渐减弱，贮藏在种子体内的物质转化为相关的代谢物，某些代谢物质的积累数量与种子物质呈现一定的相关性。因此，通过定向测量种子中的目标代谢产物的含量可以反过来判别水稻种子活力的高低。
实际上，用种子代谢物含量来判别种子活力已有少量专利进行了公开。专利“用种子代谢物含量鉴定粳籼稻品种的方法”(申请公布号CN 103512973 A)公开了以水稻种子中天冬酰胺和丙氨酸重量百分比含量的比值高低来鉴定粳稻和籼稻品种，但我们的研究发现氨基酸含量并不适宜作为种子老化程度的判定方式。一种基于核磁共振技术判别大豆种子活力的方法(申请公布号CN 106680307 A)公开了用大豆种子提取物中代谢物绝对含量判别种子活力高低，代谢物可以是大豆中精氨酸、色氨酸、次黄嘌呤、异丙醇、丙二醇、磷酸胆碱、二甲基尿酸盐中的一种或多种，但一是核磁共振仪器昂贵成本高，二是水稻种子的代谢产物和大豆明显不同，两者之间没有比拟性。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法；本发明人在研究过程中发现，水稻种子中的代谢物-半乳糖(Galactose)与水稻种子活力密切相关，利用半乳糖含量变化比值可以判别水稻低活力陈种子。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法，包括以下步骤：
(1)提取水稻种子中的半乳糖；
(2)定量测定水稻种子中的半乳糖含量，包括绝对含量或相对含量；
(3)利用贮藏前后种子的半乳糖含量比值判别低活力陈种子；
以贮藏前新种子的半乳糖含量作为该水稻种子的基准活力指标，记为A0；测定需要判别种子活力的贮藏后水稻种子中的半乳糖含量，记为A；测定自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量，记为A1；计算出需要判别种子活力的贮藏后水稻种子中的半乳糖含量A和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K；计算出自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量A1和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K1；根据K值是否大于等于K1，判别储藏后水稻种子是否属于低活力陈种子，当K值≥K1值时，判定储藏后水稻种子属于低活力陈种子。
步骤(1)所述提取水稻种子中的半乳糖具体按照以下步骤：取水稻种子，或单独的水稻种胚或者胚乳，置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后，准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中，每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液，再加10μL核糖醇作为内标；提取时，离心管上下震荡1min，涡旋5min，再以11000rpm和4℃离心10min，将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中，置于真空浓缩干燥仪中干燥；在干燥后的半乳糖样品中，加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2h；再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)，混匀，在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取半乳糖衍生化样品转移到装有250μL内插管的进样瓶中，进样瓶置于自动进样盘内，进行后续步骤的GC-MS分析。
步骤(2)所述相对含量的定量测定的方法为：将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析、对GC-MS原始数据进行预处理、获得不同样品中半乳糖的峰面积信息、将峰面积定量信息做归一化处理，得到代谢物半乳糖最终的相对含量。
所述GC-MS分析的具体条件如下：进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：85℃保持5min，以8℃/min速率升至205℃保持5min，以8℃/min速率升至300℃保持5min；进样量1μL；质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，电子倍增器电压1400V，质量扫描范围为60-1000amu，溶剂延迟为5.00min；
所述对GC-MS数据进行处理是采用AglientChemstion软件对GC-MS原始数据进行预处理，获得不同样品中半乳糖的峰面积信息、以同位素内标的峰面积为基准将半乳糖峰面积做归一化处理，得到代谢物半乳糖最终的相对含量。
步骤(2)所述绝对含量的定量测定的方法为：将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析，利用半乳糖标准品制作的标准曲线，计算种子中半乳糖的绝对含量(单位mg/g)。
所述GC-MS分析的具体条件如下：气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪(型号为GCMS-7890A-5975C)；采用DB-35UI MS毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)；进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：90℃保持4min，以8℃/min速率升至205℃保持2min，以15℃/min速率升至310℃保持5min；进样量1μL。质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度300℃，质量扫描范围为85-700amu，采用SIM模式进行MS分析，溶剂延迟为5.00min；
所述标准曲线按照以下制作方法：精密称取半乳糖标准品1mg，置入1.5ml样品瓶中，加甲醇水溶解，摇匀，制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液；首先将0.1mg/ml(100ppm)的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液；然后分别取50μl系列浓度标准品溶液，置于真空浓缩干燥仪中干燥；在干燥后的标准品中，加入50μL 20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2小时；再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，混匀后在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析；采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线；
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息；根据峰面积、标准曲线和样品重量，换算半乳糖的绝对含量。
所述标准曲线的方程式为Y＝41992.64065X-34780.521683，R2＝0.9905，Y为峰面积，X为浓度。
本发明的原理是：
种子活力是在种子发育过程中形成的。贮藏物质的积累是种子活力形成的基础,代谢物的产生是贮藏后种子活力下降的重要原因。如在种子发育后期，LEA蛋白、寡聚糖和ABA等物质与种子活力的形成有关。之后在种子储藏阶段种子活力下降过程中，种子内的贮藏物质含量总体会减少,贮藏蛋白等发生降解，导致种子发生老化劣变，发芽延迟或发芽率降低，种子活力显著降低。我们研究发现，在种子活力降低过程中，种子中半乳糖含量在一定时间范围内不断积累，半乳糖含量的积累与种子活力呈现一定的相关性。因此，通过定向测量种子中的目标代谢产物半乳糖的含量可以判别种子的活力。
本发明相对现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明克服了基于发芽率判别种子活力的耗时耗力的弊端、解决了利用其它代谢物方法仪器昂贵成本高的缺陷，利用半乳糖含量作为衡量活力的指标，使种子活力的判别更加简单快速并具可比性，提高了判别效率，节省了种子。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例使用的原料和方法具体如下：
1、实验过程中所有水稻种子由广东省金稻种业有限公司提供。
2、种子自然贮藏老化方法：将收获的水稻种子分别用网袋装好放于室内自然条件下进行贮藏。
3、种子活力的测定方法：通过人工老化处理种子，测定种子中的发芽率是目前实验研究中比较种子活力高低的一种常用研究方法。具体实验方法如下：老化处理前准备三个密封的干燥器，其中一个加入过饱和MgCl2溶液并置于20℃，其余两个各加入过饱和的KCl容易并分别置于15℃和40℃。将收获的水稻种子分别用网袋装好放于15℃、相对湿度(R.H)85％中预处理3d后,分别转移到已经平衡好的干燥器中43℃、85％R.H处理8d，然后分别置于25℃、32％R.H干燥3d，密封贮藏于-20℃。
4、水稻种子发芽率的测定方法按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)进行。
5、种子发芽率的计算公式：种子发芽率％＝发芽种子数/总种子数×100％。
6、水稻种子中半乳糖的提取方法按以下步骤进行：
取水稻种子，或单独的水稻种胚或者胚乳，置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后，准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中，每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液，再加10μL核糖醇作为内标；提取时，离心管上下震荡1min，涡旋5min，再以11000rpm和4℃离心10min，将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中，置于真空浓缩干燥仪中干燥；在干燥后的半乳糖样品中，加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2h；再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)，混匀，在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取半乳糖衍生化样品转移到装有250μL内插管的进样瓶中，进样瓶置于自动进样盘内，进行后续步骤的GC-MS分析；
7、水稻种子样品中半乳糖相对含量测定：
水稻种子中半乳糖的提取方法见前，接下来进行代谢指纹图谱采集的色谱-质谱分析、数据处理和计算半乳糖相对含量。其中GC-MS分析条件如下：气质联用仪为安捷伦公司GCMS-7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪；采用DB-35UI MS毛细管柱(30m x 0.25mm x0.25μm)；进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：85℃保持5min，以8℃/min速率升至205℃保持5min，以8℃/min速率升至300℃保持5min；进样量1μL；质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，电子倍增器电压1400V，质量扫描范围为60-1000amu，溶剂延迟为5.00min。
然后采用AglientChemstion软件对GC-MS原始数据进行预处理，将图像信息最终处理为可供进一步处理分析的数据信息，获得不同样品中半乳糖的峰面积信息、将峰面积定量信息做归一化处理，得到代谢物半乳糖最终的相对含量。
8、水稻种子样品中半乳糖的绝对含量的定量分析：
将按照上述方法提取得到的半乳糖进行GC-MS分析，利用半乳糖标准品制作的标准曲线，计算种子中半乳糖的绝对含量(单位μg/g)；
种子样品中半乳糖的提取同前。但GC-MS分析条件与相对定量略有不同：气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪(型号为GCMS-7890A-5975C)。采用DB-35UI MS毛细管柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)；进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：90℃保持4min，以8℃/min速率升至205℃保持2min，以15℃/min速率升至310℃保持5min；进样量1μL。质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度300℃，质量扫描范围为85-700amu，采用SIM模式进行MS分析，溶剂延迟为5.00min。
制作半乳糖标准曲线：精密称取半乳糖标准品1mg，置入1.5ml样品瓶中，加甲醇水溶解，摇匀，制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液。首先将0.1mg/ml(100ppm)的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液。然后取50ul不同浓度的标准品溶液，置于真空浓缩干燥仪中干燥。在干燥后的标准品中，加入50μL20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2小时；再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，混匀后在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析。采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线(Y＝41992.64065X-34780.521683，R2＝0.9905，Y为峰面积，X为浓度)。
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息；根据峰面积、标准曲线和样品重量，换算半乳糖的绝对含量(μg/g)，具体是先根据峰面积和标准曲线得到溶液中的半乳糖浓度，得到溶液浓度后，再计算得到样品中半乳糖的含量，用如下公式：半乳糖含量(μg/g)＝(溶液中的半乳糖浓度×提取溶液体积×稀释倍数)除以样品的重量。
9、利用老化前后半乳糖含量的变化来判定种子的活力
以老化前新种子的半乳糖含量(绝对含量或者相对含量)作为该水稻种子的基准活力指标，记为A0；测定需要判别种子活力的老化后的水稻种子中的半乳糖含量(绝对含量或者相对含量)，记为A；测定自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量，记为A1；计算出需要判别种子活力的水稻种子中的半乳糖含量A和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K；计算出自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量A1和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K1；根据K值是否大于等于K1，判别储藏后水稻种子是否属于低活力陈种子，当K值≥K1值时，判定储藏后水稻种子属于低活力陈种子。
实施例1：
选择B3Y3618、QY3618、QY 998、B3Y998、IIY998等杂交稻组合为实验材料，对其收获后的种子进行自然老化处理，老化时间均为2年。
之后取一定数量的上述水稻种子，按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)对其进行发芽率测定；同时，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值，记为K1(表1)，其中种子代谢物半乳糖的含量是指整粒种子中半乳糖的平均含量，即种子中胚和胚乳混合物的含量。
由表1可以看出，供试的所有杂交稻种子自然老化2年后，发芽率均下降，不同组合发芽率下降程度并不完全相同，但本实验中的种子发芽率均低于80％。根据我国《粮食作物种子第1部分禾谷类》中的规定，杂交种发芽率低于80％时的种子为不合格种子。种子发芽率也是表征种子活力的一个重要指标，发芽率不合格的种子自然是活力低的种子。
由表1还可以看出，随着自然老化种子发芽率的降低，贮藏后所有种子中的半乳糖含量均是提高的，即所有种子贮藏前后半乳糖比值K均大于1。可以说明本发明利用半乳糖含量比值作为低活力陈种子鉴别指标的论断是正确的。
表1自然老化2年种子半乳糖比值K1的变化以及种子发芽率
| 品种/组合 | 初始发芽率(％) | 老化后的发芽率(％) | K值 |
| B3Y3618 | 95.70 | 52.15 | 9.68 |
| QY3618 | 96.50 | 50.16 | 4.54 |
| QY998 | 96.42 | 67.43 | 5.2030 |
| B3Y998 | 95.43 | 67.00 | 9.68 |
| IIY998 | 96.58 | 44.82 | 7.77 |
备注：K1代表自然贮藏2年时的种子半乳糖相对含量与0天时半乳糖相对含量的比值。
随机选择自然贮藏一定时间后的B3Y3618杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为11.02，该值大于表1中相对应的K1值9.68，判定为属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为47.22％，可以确认其属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的QY3618杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为5.73，该值大于表1中相对应的K1值4.54，判定为属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为47.35％，可以确认其属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的QY 998杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为3.87，该值小于表1中相对应的K1值5.2030，判定为不属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为85.23％，可以确认其不属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的B3Y998杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为7.56，该值小于表1中相对应的K1值9.68，判定为不属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”
(GB/T 3543)测定其发芽率为87.53％，可以确认其不属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的IIY998杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为5.76，该值小于表1中相对应的K1值7.77，判定为不属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”
(GB/T 3543)测定其发芽率为89.46％，可以确认其不属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
实施例2：
选择368系列杂交稻组合为实验材料，对其收获后的种子进行自然老化处理，老化时间均为2年。
之后取一定数量的上述水稻种子，按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)对其进行发芽率测定；同时，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值，记为K1(表2)。
由表2可以看出，供试的368系列杂交稻种子自然老化2年后，发芽率均下降，尽管不同组合发芽率下降程度并不完全相同，但本实验中的种子发芽率均低于80％，为不合格种子。由表2还可以看出，随着自然老化种子发芽率的降低，贮藏后所有种子中的半乳糖含量均是提高的，证实了本发明利用半乳糖含量比值K作为劣变种子鉴别指标的论断是正确的。
表2杂交稻368系列种子自然老化2年半乳糖比值K1的变化以及种子发芽率
| 品种/组合 | 初始发芽率(％) | 老化后的发芽率(％) | K值 |
| QY368 | 95.67 | 58.44 | 15.2366 |
| B3Y368 | 97.31 | 73.72 | 13.5894 |
| IIY368 | 96.13 | 53.37 | 7.8414 |
| TY368 | 95.75 | 75.76 | 6.3301 |
随机选择自然贮藏一定时间后的QY368杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为12.33552，该值小于表1中相对应的K1值15.2366，判定为不属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为82.23％，可以确认其不属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的B3Y368杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为14.7255，该值大于表1中相对应的K1值13.5894，判定为属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为65.44％，可以确认其属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的IIY368杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为6.5622，该值小于表1中相对应的K1值7.8414，判定为不属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)测定其发芽率为82.87％，可以确认其不属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
随机选择自然贮藏一定时间后的TY368杂交稻组合，按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值K为9.6631，该值大于表1中相对应的K1值6.3301，判定为属于低活力陈种子，而同时按“水稻种子发芽率测定方法”
(GB/T 3543)测定其发芽率为67.25％，可以确认其属于低活力陈种子，证明本发明方法是正确的。
实施例3：
取自然老化处理时间均为2年的广8优165、广8B和广恢308，分别按上述半乳糖的提取和相对含量的定量测定方法进行种子代谢物半乳糖的提取和定量测定，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值，记为K1：广8优165的K1值为5.278767909，广8B的K1值为8.232156655，广恢308的K1值为10.244556355。
在水稻种子自然贮藏库中，随机选择自然贮藏一定时间后的广8优165、广8B和广恢308等3个品种组合的旧种子和上述3种同样的新种子(未进行贮藏)为材料，之后取一定数量的上述水稻种子开展实验。
第一步：测定种子中半乳糖绝对含量并计算K值(表3)。按上述半乳糖的提取和定量方法测定种子代谢物半乳糖的绝对含量，计算出贮藏前后水稻种子中半乳糖比值。具体数据见表3。
第二步：根据K值对种子活力进行判别。由于表3中3个品种的K值分别大于其对应的K1值，我们判别上述3个组合种子属于低活力陈种子。
第三步：按“水稻种子发芽率测定方法”(GB/T 3543)对其进行发芽率测定，具体测试数据见表4。表4发芽率结果表明上述随机选择的自然贮藏后的3个组合均属于老化程度很高的陈旧种子，发芽率均低于30％，种子基本不存在活力，实际上其贮藏时间都在2年以上。
本实施例说明，按照本发明所述，可以利用半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈旧种子。
表3供试实验材料中半乳糖含量的比值K
表4验证实验中的发芽率
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于半乳糖含量变化比值判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取水稻种子中的半乳糖；
(2)定量测定水稻种子中的半乳糖含量，包括绝对含量或相对含量；
(3)利用贮藏前后种子的半乳糖含量比值判别低活力陈种子；
以贮藏前新种子的半乳糖含量作为该水稻种子的基准活力指标，记为A0；测定需要判别种子活力的贮藏后水稻种子中的半乳糖含量，记为A；测定自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量，记为A1；计算出需要判别种子活力的贮藏后水稻种子中的半乳糖含量A和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K；计算出自然老化2年后的水稻种子中的半乳糖含量A1和水稻种子的基准活力指标A0的比值，记为K1；根据K值是否大于等于K1，判别储藏后水稻种子是否属于低活力陈种子，当K值≥K1值时，判定储藏后水稻种子属于低活力陈种子。
2.根据权利要求1所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：步骤(1)所述提取水稻种子中的半乳糖具体按照以下步骤：取水稻种子，或单独的水稻种胚或者胚乳，置于液氮预冷的组织研磨仪中研磨成粉末后，准确称取50mg粉末置于2ml Eppendorf离心管中，每个管中加入800μL甲醇∶氯仿∶水体积比为5:2:2的提取液，再加10μL核糖醇作为内标；提取时，离心管上下震荡1min，涡旋5min，再以11000rpm和4℃离心10min，将200μL上清液转移到新的1.5mL离心管中，置于真空浓缩干燥仪中干燥；在干燥后的半乳糖样品中，加入50μL新配的浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐-吡啶溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2h；再往里加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，混匀，在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取半乳糖衍生化样品转移到装有250μL内插管的进样瓶中，进样瓶置于自动进样盘内，进行后续步骤的GC-MS分析。
3.根据权利要求1所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：步骤(2)所述相对含量的定量测定的方法为：将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析、对GC-MS原始数据进行预处理、获得不同样品中半乳糖的峰面积信息、将峰面积定量信息做归一化处理，得到代谢物半乳糖最终的相对含量。
4.根据权利要求3所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：所述GC-MS分析的具体条件如下：进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：85℃保持5min，以8℃/min速率升至205℃保持5min，以8℃/min速率升至300℃保持5min；进样量1μL；质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度280℃，电子倍增器电压1400V，质量扫描范围为60-1000amu，溶剂延迟为5.00min；
所述对GC-MS数据进行处理是采用AglientChemstion软件对GC-MS原始数据进行预处理，获得不同样品中半乳糖的峰面积信息、以同位素内标的峰面积为基准将半乳糖峰面积做归一化处理，得到代谢物半乳糖最终的相对含量。
5.根据权利要求1所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：步骤(2)所述绝对含量的定量测定的方法为：将步骤(1)提取得到的半乳糖进行GC-MS分析，利用半乳糖标准品制作的标准曲线，计算种子中半乳糖的绝对含量。
6.根据权利要求5所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：所述GC-MS分析的具体条件如下：气质联用仪为安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪；采用DB-35UI MS毛细管柱，尺寸为30mx 0.25mm x 0.25μm；进样口温度为270℃；载气为高纯氦气，纯度>99.999％，流速1mL/min；分流进样，分流比50:1；升温程序为：90℃保持4min，以8℃/min速率升至205℃保持2min，以15℃/min速率升至310℃保持5min；进样量1μL。质谱的离子源EI，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，传输线温度300℃，质量扫描范围为85-700amu，采用SIM模式进行MS分析，溶剂延迟为5.00min；
所述标准曲线按照以下制作方法：精密称取半乳糖标准品1mg，置入1.5ml样品瓶中，加甲醇水溶解，摇匀，制成每1ml中含半乳糖0.1mg的标准溶液；首先将0.1mg/ml的标准品溶液稀释制成40ppm、20ppm、10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.2ppm的系列浓度标准品溶液；然后分别取50μl系列浓度标准品溶液，置于真空浓缩干燥仪中干燥；在干燥后的标准品中，加入50μL20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐溶液，充分混匀，在37℃，200rpm下反应2小时；再加入70μL N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺，混匀后在37℃，200rpm下摇30min；反应结束后，立即吸取衍生化样品转移到进样瓶进行GC-MS分析；采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息；以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，分别绘制标准曲线；
所述计算种子中半乳糖的绝对含量具体是将GC-MS分析采集的质谱数据通过MassHunter软件进行峰提取，获得半乳糖在不同样品中的峰面积信息；根据峰面积、标准曲线和样品重量，换算半乳糖的绝对含量。
7.根据权利要求6所述的一种基于半乳糖含量变化判别水稻低活力陈种子的方法，其特征在于：所述标准曲线的方程式为Y＝41992.64065X-34780.521683，R2＝0.9905，Y为峰面积，X为浓度。
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|---|---|---|---|---|
| WO2021249423A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 | 一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法 |
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|---|
| SHIJUAN YAN等: "Aspergillus flavus grown in peptone as the carbon source exhibits spore density- and peptone concentration-dependent aflatoxin biosynthesis", 《BMC MICROBIOLOGY》 * |
| SHIJUAN YAN等: "Comparative metabolomic analysis of seed metabolites associated with seed storability in rice (Oryza sativa L.) during natural aging", 《PLANT PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY》 * |
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| WO2021249423A1 (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-16 | 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 | 一种利用半乳糖含量与发芽率的回归方程快速判别水稻种子是否合格的方法 |
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