CN102262116A - 一种聚合物膜离子选择性电极的检测方法及装置 - Google Patents

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本发明涉及一种聚合物膜离子选择性电极的检测方法及装置，方法包括：检测池中置入核酸适体和聚阳离子，将聚阳离子选择性电极插入检测池产生对照信号；在检测池中加入核酸适体与标准待测物溶液作用，再加入与聚阳离子，将聚阳离子选择性电极插入检测池产生标准待测物溶液不同浓度下的标准信号；根据上述标准信号和对照信号得到标准曲线；在检测池中置入待测液，加入核酸适体与待测液作用后加入上述比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极插入检测池中，产生样品信号；根据样品信号和对照信号得到待测信号，参照标准曲线，即得待测液的浓度。本发明方法应用范围宽，具有通用性，是一种免标记、免固定化的方法，电极响应信号大，电位变化明显。

Description

一种聚合物膜离子选择性电极的检测方法及装置
技术领域
本发明涉电位型电化学检测技术，具体的说是一种基于核酸适体的聚合物膜离子选择性电极的检测方法及其装置。
背景技术
核酸适体(Aptamer)作为一种新型的分子识别元件，能够高效、特异地结合各种配体，具有易合成、易储存和稳定性好等优点；然而核酸适体本身不具有显示信号的功能。目前基于核酸适体的检测方法通常需要标记荧光、纳米材料，从而可产生检测信号，同时检测时常需要适体的固定化，不能在均相溶液中实现检测。这类检测方法一方面检测成本高、操作繁琐；另一方面标记过程也影响了核酸适体的结合能力。
离子选择性电极具有操作简便、响应快速、设备价廉等优点，特别适合现场检测以及大批样品的检测，已广泛应用于全血、血清、尿、组织、细胞内液及其稀释液中各种电解质离子的直接测定。然而已有核酸适体聚合物膜离子选择性电极检测技术采用纳米标记，其繁琐的操作过程，限制了该类方法的应用范围。
发明内容
针对现有技术中离子选择性电极存在的操作过程繁琐等不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便，响应快速的基于核酸适体的聚合物膜离子选择性电极的检测方法及其装置。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明一种聚合物膜离子选择性电极的检测方法包括以下步骤：
a.检测池中置入核酸适体10-9-1M，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极插入检测池，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生对照信号；
b.在洗净的检测池中加入核酸适体10-9-1M与分别与不同浓度的标准待测物溶液作用0.01-10小时后，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极插入检测池9，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生标准待测物溶液不同浓度下的标准信号；
c.根据上述标准信号和对照信号得到标准曲线；
d.在洗净的检测池中置入待测液，加入核酸适体10-9-1M与待测液作用0.01-10小时后，加入上述比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极4插入检测池，中，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生样品信号；根据样品信号和对照信号得到待测信号，参照标准曲线，即得待测液的浓度。
聚阳离子采用一次性加入，加入量为10-9-1M；或者采用间歇式加样，间隔时间不大于10分钟。
采用手动或通过自动进样装置加样，速度1.0-100μL/s，溶液浓度为1.0-100mg/mL，时间间隔0.1-100分钟。
将聚阳离子选择性电极在0-1小时响应时间内任意时间点的电位值作为响应信号；或者以电极电位响应最大值一半时所对应聚阳离子的浓度为信号。
所述聚合物敏感膜为：聚合物基体材料、增塑剂、阳离子交换剂和离子液体按重量份数比为20-50∶20-50∶0.1-10∶0.1-10混合，而后溶入到四氢呋喃溶液中，混均后在室温下放置12-24h，待四氢呋喃完全挥发干后即得到有弹性的聚合物敏感膜。
所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚(o-NPOE)、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；阳离子交换剂为3-十二烷基甲基氯化氨(TDMA)或离子液体；离子液体为四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵(ETH 500)。
所述聚阳离子为鱼精蛋白、聚季铵盐-6、聚烯丙基胺、树枝状化合物聚酰胺Poly(amidoamine)和聚丙撑亚胺Poly(propylenimine)或鱼精蛋白类似蛋白。
所述核酸适体包括：以重金属离子、有机染料、氨基酸、有机小分子、核酸、RNA、多糖、酶、生长因子、抗体、细菌、细胞、病毒为配体的各类核酸适体。
本发明一种聚合物膜离子选择性电极检测装置包括：
检测池，为用于盛放被测物的容器；聚阳离子选择性电极，为工作电极，内部盛有内充液，底部设有聚合物敏感膜；内参比电极，一端插入聚阳离子选择性电极内，另一端连接到外部电位测量装置；外参比电极，一端设于检测池中，另一端连接到外部电位测量装置。
所述聚阳离子选择性电极还可与旋转圆盘电极的旋转电极头相连，信号输出端连接到外部电位测量装置；所述检测池还可置于超声仪的超声池中；还具有流动注射仪或自动进样装置，其出口对应检测池；所述外部电位测量装置为电化学工作站或离子计。
本发明具有以下有益效果及优点：
1.本发明检测装置中的电极采用聚合物膜离子选择性电极，制作简单、灵敏度高、选择性好，能够在复杂的基质中使用，同时便携性强，便于现场实时检测。
2.本发明方法应用范围宽，具有通用性。指示信号的聚阳离子种类丰富，同时通过改变适配体种类，能够实现对重金属离子、有机染料、氨基酸、有机小分子、核酸、RNA、多糖、酶、病毒、生长因子、抗体、细菌、细胞等多种物质的检测。
3.该方法测定时适配体不需要信号标物，适配体无需事先固定在电极基底，是一种免标记、免固定化的方法，电极响应信号大，电位变化明显。
4.通过电极和旋转圆盘电极相连，或超声仪加速溶液传质，降低电极检测限。
附图说明
图1为本发明装置中聚阳离子选择性电极和内参比电极示意图；
图2为本发明装置应用示意图；
图3为本发明方法用于三磷酸腺苷测定的实时响应和标准曲线；
图4为本发明方法用于滴定法测定钾离子曲线。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，本发明聚合物膜离子选择性电极检测装置包括检测池9、聚阳离子选择性电极4、内参比电极1以及外参比电极5。其中，检测池9为用于盛放被测物的容器；聚阳离子选择性电极4为工作电极，内部盛有内充液2，底部设有聚合物敏感膜3；内参比电极1的一端插入聚阳离子选择性电极4内，另一端连接到外部电位测量装置；外参比电极5一端设于检测池9中，另一端连接到外部电位测量装置。
如图2所示，本实施例中聚阳离子选择性电极4还可与旋转圆盘电极6的旋转电极头相连，信号输出端连接到外部电位测量装置。检测池9置于超声仪7的超声池中。流动注射仪或自动进样装置8流出溶液直接导进检测池9实现滴定法测定。检测池9亦可单独使用，无需置于超声仪7的超声池中。
旋转圆盘电极6具有独立的外部电源，可以设置转速，旋转圆盘电极6和聚阳离子选择性电极接4起来以后，可以看成是一个整体，相当于一个可以旋转的聚阳离子选择性电极4，这个工作电极接到电化学工作站测量信号的输入端，但此时不是电化学工作站直接和离子选择性电极相连，而是通过旋转圆盘电极6的输出端间接和聚阳离子选择性电极4相连。聚阳离子选择性电极4亦可以直接连接到外部电位测量装置，实现检测。
所述外部电位测量装置为电化学工作站或离子计。
本发明聚合物膜离子选择性电极的检测方法包括以下步骤：
a.检测池9中置入核酸适体10-9-1M，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极4插入检测池9，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生对照信号；
b.在洗净的检测池9中加入核酸适体10-9-1M与分别与不同浓度的标准待测物溶液作用0.01-10小时后，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极4插入检测池9，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生标准待测物溶液不同浓度下的标准信号；
c.根据上述标准信号和对照信号得到标准曲线；
d.在洗净的检测池9中置入待测液，加入核酸适体10-9-1M与待测液作用0.01-10小时后，加入上述比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极4插入检测池9中，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生样品信号；根据样品信号和对照信号得到待测信号，参照标准曲线，即得待测液的浓度。
本实施例步骤a中，以聚阳离子选择性电极4作为工作电极，饱和甘汞电极作为外参比电极5，通过电化学工作站(本实施例中采用CHI660)测定电位值；3.0mL pH 7.4含有0.12M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中，检测池中置入10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体，适配体碱基序列为5’-ACCTG GGGGA GTATT GCGGA GGAAG GT-3’，加入26.7μg/mL鱼精蛋白，二者相互作用10分钟后，将聚阳离子选择性电极4插入上述混合液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，以10分钟时的电极电位值作为对照信号。所述聚阳离子选择性电极4(参见图1)内插有Ag-AgCl内参比电极1，同时将pH 7.4含有0.12M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲2注入聚阳离子选择性电极4内，并且底部黏附聚合物敏感膜3；聚阳离子选择性电极4初次使用前需在pH 7.4、含有0.12M含有氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中活化12h，即可用于分析测定。
聚阳离子选择性电极4的制备为：取360mg 1％3-十二烷基氯化氨(TDMA)，1％四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵(ETH 500)，49％聚氯乙烯，49％邻-硝基苯辛醚，溶入到3mL四氢呋喃溶液中，室温下在平底小烧杯(直径3.6cm)中放置12h，待四氢呋喃完全挥发干后即得到有弹性的聚合物敏感膜3，厚度为200μm。将所述聚合物敏感膜3用打孔器取直径0.6-0.8cm的敏感膜。制备的聚合物敏感膜3通过四氢呋喃黏附于聚阳离子选择性电极4外壁底部。
步骤b中，检测池中的10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体与10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5M的三磷酸腺苷作用20分钟后，加入26.7μg/mL鱼精蛋白作用10分钟，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，以10分钟时的电极电位值作为标准信号；
步骤c中，根据标准信号和对照信号的电位差绘制标准曲线(如图3)；
步骤d中，将10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体加入盛有待测样品三磷酸腺苷的检测池9中作用20分钟，加入26.7μg/mL鱼精蛋白作用10分钟，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，以10分钟时的电极电位值作为样品信号；参照标准曲线即得待测物的浓度。
检测装置：聚阳离子选择性电极4(参见图1)内插有Ag-AgCl内参比电极1，同时将pH 7.4含有0.12M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲2注入聚阳离子选择性电极4内，并且底部黏附聚合物敏感膜3；聚阳离子选择性电极4的工作电极为正极，饱和甘汞电极为参比电极为负极，正极与负极通过导线与CHI660相连(参见图2)。
电极性能的测试：在缓冲溶液中含有0.12M氯化钠存在的情况下，测定电极对鱼精蛋白依然有很好的响应，检出限可达0.05μg/mL。
本实施例步骤a中，适配体也可以是以重金属离子如钾、汞、铅、铜、锌、铀；有机染料如磺基罗丹明B、活性墨绿KE-4BD；氨基酸如精氨酸、L-酪氨酸胺；有机小分子如可卡因、胆酸、阿斯巴甜(含苯丙氨酸)，(R)-沙利度胺、17β-雌二醇；核酸如三磷酸腺苷、腺苷酸、二磷酸腺苷；RNA如TAR-RNA；多糖如纤维二糖、唾液乳糖；酶如凝血酶、蛋白激酶、中心粒细胞弹性蛋白酶、HIV-1逆转录酶；毒素如蓖麻毒素；生长因子如碱性纤维母细胞生长因子、血小板源性生长因子B链；抗体如人免疫球蛋白IgE；细菌和细胞如孢子、肺癌细胞为配体的各类核酸适体。
实施例2
本实施例以滴定法测定钾离子为例，其测定步骤如下：
a.5.0mL pH 7.4含有0.12M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中，加入2×10-6M钾的适配体，适配体碱基序列为5’-GGTTGGTGTGGTTGG-3’，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，以每两分钟为时间间隔，依次加入5μL 1mg/mL鱼精蛋白，记录电位实时响应；
b.5.0mL pH 7.4含有0.12M氯化钠的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中，加入2×10-6M钾的适配体分别与5×10-6M、10-5M、5×10-5M、10-4M、5×10-4M的钾离子，两者作用20分钟后，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，以每两分钟为时间间隔，依次加入5μL1mg/mL鱼精蛋白，记录电位实时响应，如图4所示；
c.以电极电位响应最大值一半时所对应鱼精蛋白的浓度作为信号，绘制标准曲线；
d.2×0-6M钾的适配体加入含有待测样品的溶液中，两者作用20分钟，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，以每两分钟为时间间隔，依次加入5μL 1mg/mL鱼精蛋白，记录电位实时响应(如图4)。根据电极电位响应最大值一半时所对应鱼精蛋白的浓度，参照标准曲线，可以计算待测样品中钾离子的浓度。
实施例3
与实施例1的不同之处在于：本实施例以三磷酸腺苷(ATP)适配体为核酸酶的底物，测定核酸酶的活度为例。缓冲溶液为pH 4.6醋酸-醋酸钠缓冲，含有0.15M氯化钠和0.001M硫酸锌。
其测定步骤如下：
a.3.0mL pH 4.6含有0.15M氯化钠和0.001M硫酸锌的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中含有10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体，碱基序列为5’-ACCTGGGGGA GTATT GCGGA GGAAG GT-3’，加入26.7μg/mL鱼精蛋白和二者相互作用10分钟后，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，以10分钟时的电极电位值作为对照信号；
b.3.0mL上述缓冲溶液中，1U/mL、5U/mL、10U/mL、30U/mL、50U/mL的核酸酶分别与10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体作用十分钟以后，加入1mM乙二胺四乙酸(EDTA)停止酶反应，再将26.7μg/mL鱼精蛋白加入上述溶液中，相互作用十分钟后，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，以10分钟时的电极电位值作为标准信号；
c.通过标准信号和对照信号得到电位差，进而得到标准工作曲线；
d.将待测的样品酶溶液加入10-6M三磷酸腺苷(ATP)的适配体中作用十分钟，加入1mM乙二胺四乙酸(EDTA)停止酶反应，再将26.7μg/mL鱼精蛋白加入上述溶液进一步作用十分钟后，将聚阳离子选择性电极4插入上述溶液，记录聚阳离子电极的实时电位响应，记录10分钟时的电极电位值作为样品信号。参照标准工作曲线即可得样品酶活度。
本实施例步骤b中，标准待测物为核酸适体相对应的检测物，或者能够与核酸适体相互作用的物质，包括脱氧核糖核酸酶、限制性内切酶、外切核酸酶、核酸酶S1、核酸酶和其抑制剂的混合物，羟基自由基，或者抗氧化剂和羟基自由基混合溶液。

Claims (13)

1.一种聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
a.检测池(9)中置入核酸适体10-9-1M，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极(4)插入检测池(9)，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生对照信号；
b.在洗净的检测池(9)中加入核酸适体10-9-1M与分别与不同浓度的标准待测物溶液作用0.01-10小时后，再加入与核酸适体1∶10000-10000∶1质量比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极(4)插入检测池(9)，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生标准待测物溶液不同浓度下的标准信号；
c.根据上述标准信号和对照信号得到标准曲线；
d.在洗净的检测池(9)中置入待测液，加入核酸适体10-9-1M与待测液作用0.01-10小时后，加入上述比例量的聚阳离子实现信号传导，将聚阳离子选择性电极(4)插入检测池(9)中，记录聚阳离子电极的实时电位响应，产生样品信号；根据样品信号和对照信号得到待测信号，参照标准曲线，即得待测液的浓度。
2.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：聚阳离子采用一次性加入，加入量为10-9-1M；或者采用间歇式加样，间隔时间不大于10分钟。
3.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：采用手动或通过自动进样装置加样，速度1.0-100μL/s，溶液浓度为1.0-100mg/mL，时间间隔0.1-100分钟。
4.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：将聚阳离子选择性电极在0-1小时响应时间内任意时间点的电位值作为响应信号；或者以电极电位响应最大值一半时所对应聚阳离子的浓度为信号。
5.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：所述聚合物敏感膜(3)为：聚合物基体材料、增塑剂、阳离子交换剂和离子液体按重量份数比为20-50∶20-50∶0.1-10∶0.1-10混合，而后溶入到四氢呋喃溶液中，混均后在室温下放置12-24h，待四氢呋喃完全挥发干后即得到有弹性的聚合物敏感膜。
6.按权利要求5所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻-硝基苯辛醚(o-NPOE)、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；阳离子交换剂为3-十二烷基甲基氯化氨(TDMA)或离子液体；离子液体为四(十二烷基)-四(4-氯苯基)硼酸铵(ETH 500)。
7.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：所述聚阳离子为鱼精蛋白、聚季铵盐-6、聚烯丙基胺、树枝状化合物聚酰胺Poly(amidoamine)和聚丙撑亚胺Poly(propylenimine)或鱼精蛋白类似蛋白。
8.按权利要求1所述的聚合物膜离子选择性电极的检测方法，其特征在于：所述核酸适体包括：以重金属离子、有机染料、氨基酸、有机小分子、核酸、RNA、多糖、酶、生长因子、抗体、细菌、细胞、病毒为配体的各类核酸适体。
9.一种聚合物膜离子选择性电极检测装置，其特征在于包括：
检测池(9)，为用于盛放被测物的容器；
聚阳离子选择性电极(4)，为工作电极，内部盛有内充液(2)，底部设有聚合物敏感膜(3)；
内参比电极(1)，一端插入聚阳离子选择性电极(4)内，另一端连接到外部电位测量装置；
外参比电极(5)，一端设于检测池(9)中，另一端连接到外部电位测量装置。
10.按权利要求9述的聚合物膜离子选择性电极检测装置，其特征在于：所述聚阳离子选择性电极(4)还可与旋转圆盘电极(6)的旋转电极头相连，信号输出端连接到外部电位测量装置。
11.按权利要求9述的聚合物膜离子选择性电极检测装置，其特征在于：所述检测池(9)还可置于超声仪(7)的超声池中。
12.按权利要求9述的聚合物膜离子选择性电极检测装置，其特征在于：还具有流动注射仪或自动进样装置(8)，其出口对应检测池(9)。
13.按权利要求9述的聚合物膜离子选择性电极检测装置，其特征在于：所述外部电位测量装置为电化学工作站或离子计。
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