CN105699471A - 一种对两种物质同时检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及聚合物敏感膜离子选择性电极，具体地说是一种对两种物质同时检测的方法。将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池中,对测量池缓冲溶液中已有的离子进行检测，得到不同电性已有的离子的对照电位信号；而后向测量池中加入固定修饰的功能化磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，从而获得酶促反应后生成带有不同电性的指示离子，电极捕获不同电性指示离子的电位信号，即得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号；与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号和不同电性已有的离子的对照电位信号的差值是由特定化学反应后生成的不同电荷指示离子引起的变化，进而间接地定量获得被测物浓度。本发明将恒电流技术和恒电位技术相结合，实现检测两种物质的目的。

Description

一种对两种物质同时检测的方法

技术领域

本发明涉及聚合物敏感膜离子选择性电极，具体地说是一种对两种物质同时检测的方法。

背景技术

环境中污染物种类繁多，对于污染物现有的检测方法有光谱法，色谱法，质谱法以及各种方法的联用；但是这些已有的检测方法存在监测速度慢、连续性差、分析成本高以及无法在线实时监测；已有的离子选择性电极通常只能检测一种物质，且大多是离子，对对应离子外的靶分子难以检测，而对多种物质的同时检测更加难以实现；因此对于环境中的污染物，开发一种现场、快速、高灵敏性以及高稳定性的检测方法迫在眉睫。

生物传感器因其具有操作简单、携带方便、对分析物可以进行连续快速检测等优越性能，已在环境、临床、食品安全等领域得到广泛应用。然而一般电位传感器在同一时间只能检测一种物质，效率相对较低。

发明内容

本发明的目的在于克服已有分析技术的不足，提供一种同时检测两种物质的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种对两种物质同时检测的方法，将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池中,对测量池缓冲溶液中已有的离子进行检测，得到不同电性已有的离子的对照电位信号；而后向测量池中加入固定修饰的功能化磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，从而获得酶促反应后生成带有不同电性的指示离子，电极捕获不同电性指示离子的电位信号，即得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号；与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号和不同电性已有的离子的对照电位信号的差值是由特定化学反应后生成的不同电荷指示离子引起的变化，进而间接地定量获得被测物浓度。

所述不同电荷指示离子的对照电位信号是采用恒电流和恒电位相结合的方式检测获得，将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池，在零电流情况下，获得其开路电位，而后检测溶液中的离子在对工作电极施加不同电性的电流时，工作电极识别带有不同电性的离子，得到不同电性离子的对照电位信号。

所述反应后不同电荷指示离子信号是采用恒电流和恒电位相结合的方式检测获得，将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池，再向测量池内加入固定化修饰的磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，在零电流情况下，获其得开路电位，而后对电机施加不同方向的电流，电极识别酶促反应后不同电荷的指示离子的电位信号，得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号；

其中，固定化修饰的磁珠上修饰固定有被测物的捕获分子，被测物的特异性识别分子以及酶标记过的信号分子，组成三明治夹心结构。

所述聚合物敏感膜离子选择性电极为在基底底部依次粘附电位传导层和聚合物敏感膜；其中，电位传导层为聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸(PEDOT/PSS)或咪唑盐离子。

所述聚合物敏感膜由聚合物基体材料、增塑剂、离子载体按重量份数比约为40:40:20混合，而后融入到四氢呋喃溶液中，搅拌使之成为均匀溶液，即得到聚合物敏感膜；所述敏感膜中不含有离子交换剂。此外离子载体为由阳离子交换剂和阴离子交换剂合成的中性电解质，该电解质零电流条件下不具有离子交换功能。所述聚合物基体材料为聚氯乙烯、聚丁基丙烯酸酯、聚丙烯酸丁酯、聚醚酰亚胺、橡胶或溶胶凝胶膜；增塑剂为邻硝2，基苯基醚(o-NPOE)、二-2-乙基己基癸酯、癸二酸二丁酯或癸二酸二辛酯；离子载体为四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵(ETH500)或四氯十二烷基铵(TDDA)。

所述被测物的特异性识别分子为核酸适体、抗原、抗体、多肽或DNA；所述核酸适体是根据特异性识别的物质设计的核酸序列，可以识别金属离子、有机农药、氨基酸、有机小分子、核酸、RNA等不同种类的靶分子；通过各种特异性的识别分子，达到检测多种物质的目的，弥补了已有离子选择性电极只能检测一种物质，且大多是离子的不足，并且实现了对离子外的不同靶分子同时检测的目的。

所述被测物的捕获分子为具有捕捉被测物特异性识别分子功能的物质被称为捕获分子，其根据被测物的特异性识别分子设计得到；磁珠上连接的捕获分子，被测物的识别分子以及信号分子的组合形成三明治夹心模式。

所述磁珠为链和亲酶素功能化磁珠，用于固定两种或多种被测物的特异性识别分子，并且过程简便，易于操作；磁珠固定化过程中，每一步特定物质的连接都需要磁性分离，用特定洗脱液洗脱三遍；该磁珠为具有磁性的纳米颗粒，易于分离，操作简单，磁性分离过程可消除基体影响，提高该检测方法的稳定性、选择性和灵敏度；

所述待检测的物质为重金属，三氧化二砷，五氧化二砷、二甲基汞、铬类物质、有机农药类，有机磷农药、有机氮农药、有机氯农药、有机氟农药、有机硫农药、有机铜农药、大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，弧菌、抗生素，内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类、有机污染物，多溴联苯类，表面活性剂、酚类、醛类污染物中的两种或两种以上。

所述酶标记过的信号分子为辣根过氧化物酶、碱性磷酸脂酶、大豆过氧化物酶、漆酶、胆红素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、G四联体功能酶、氧化石墨烯、贵金属参杂氧化铁、氧化铈、单壁纳米管、碳纳米管、AgPt、AgAu、AgPd、FeS中两种或两种以上的物质。

所述底物为对硝基磷酸酯，磷酸二氢盐、二聚偏磷酸盐、四聚偏磷酸盐、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、邻苯二胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐氨基联苯胺、对茴香胺、间茴香胺、邻茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、氟苯胺、二甲基联苯胺、4,4’-亚甲基双邻氯苯胺、对氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、对乙氧基苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、N-苯基对苯二胺、联大茴香胺、邻联甲苯胺、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、鲁米诺、邻氨基苯酚、吲哚-3-乙酸中的两种或两种以上的物质。

检测原理：聚合物敏感膜离子选择性电极底部依次粘附的传导层和聚合物敏感膜中含有带不同电荷的离子；将聚合物敏感膜离子选择性电极即工作电极插入盛有酶促反应底物的测量池中，向测量池中加入功能化的磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，从而获得酶促反应产生的带有不同电荷的指示离子，施加不同方向的电流，可以使不同电性的离子聚集到敏感膜上，从而产生不同方向的电位，达到检测不同物质的目的。

本发明将恒电流技术和恒电位技术相结合，通过控制施加电流的大小，调控被测物检测的线性范围；通过控制施加电流的方向，识别带有不同电性的指示离子，实现检测两种物质的目的；通过恒电流技术和恒电位技术相结合，设计检测程序，实现电极的可逆、重复使用，提高该检测方法的稳定性，减小实验过程中误差。功能化磁珠可以固定被测物的特异性识别分子，使实验的选择性增强；还可以固定化信号分子，并且可以设计使信号放大，增加了实验的灵敏度；功能化磁珠具有磁性易于样品和基体分离，消除基体效应；本发明所制备的聚合物敏感膜离子选择性电极具有通用性强、选择性好、灵敏度高、成本低廉的特点，同时适合对复杂基质下目标物的检测。

本发明的优点在于：

1.本发明将恒电流技术和恒电位技术相结合，实现了电极的可逆、重复使用，减少工作量，能够提高分析的稳定性性和灵敏度，减小实验误差。

2.本发明离子选择性电极制备简单，易于小型化，便于携带；操作简单方便，稳定性、灵敏度和准确度较高。

3.本发明采用离子选择性电极的生物传感器对环境中污染物进行检测，实现了两种或多种物质的同时检测，大大增加对被测物的检测效率，因而本发明将发挥巨大的作用。

4.本发明离子选择性电极可分为液体离子选择性电极和固体接触式离子选择性电极，离子选择性电极灵活多样，通用性强、选择性好、成本低廉的特点，同时适合对复杂基质下目标物的检测。

附图说明

图1为本发明检测装置的示意图(其中1为固体接触式离子选择性电极，2为参比电极，3为辅助电极)。

图2为本发明聚合物敏感膜离子选择性电极1的制作。聚合物敏感膜离子选择性电极1黏附的聚合物敏感膜(4为内层，5为外层)。

图3为本发明同时检测两种物质的效果图。

图4为本发明同时检测葡萄球菌和大肠杆菌的原理示意图。

图5为本发明电极测定不同浓度葡萄球菌特异性核酸序列标准电位变化响应信号。

图6为本发明电极测定不同浓度葡萄球菌特异性核酸序列的标准曲线。

图7为本发明电极同时检测两种细菌的标准工作曲线,(EC为大肠杆菌，SA为葡萄球菌)

具体实施方式

下面将结合实施例及附图对本发明作进一步的阐述。

本发明将恒电流技术和恒电位技术相结合，通过控制施加电流的大小，调控检测被测物的线性范围；通过控制施加不同电性的电流，识别带有不同电荷的指示离子，实现检测两种物质的目的；两种技术的结合实现了离子选择性电极的可逆、重复使用，提高了该检测方法的稳定性。此外，本发明所制备的聚合物敏感膜离子选择性电极具有通用性强、选择性好、灵敏度高、成本低廉的特点，同时该方法运用了磁性纳米材料，实现对复杂基质下目标物的检测。本发明将纳米材料、生物放大技术等引入核酸适体生物传感器的设计，实现靶分子高灵敏电位检测。所述功能化磁珠即为具有磁性的纳米材料，磁珠可以连接被测物的核酸适体，根据核酸适体设计两条部分互补的信号核酸序列，核酸适体引发信号核酸序列自发连接，进行链式反应(HCR)，形成大量具有一定空间结构的类酶物质；由于该过程可以在核酸链充足的条件下自发无限连接，从而达到信号放大的效果；将纳米材料和生物放大技术与核酸适体生物传感器结合，达到信号放大的效果，实现靶分子高灵敏电位检测。

具体检测：

a.将电化学工作站通过导线分别连接工作电极(聚合物敏感膜离子选择性电极)(1)和参比电极(2)，辅助电极(3)(图1)。

b.将上述步骤a中聚合物敏感膜离子选择性电极，即工作电极插入承有含有两种底物的缓冲溶液的测量池中，对测量池中缓冲溶液里已有的离子进行检测，将恒电流技术和恒电位技术相结合，在电流控制的条件下实现电极电位响应，首先在零电流的条件下走开路电位，确认工作电极的初始电位；而后设计检测程序，在程序中设计施加1s的恒电流，使溶液中的一种电性离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，再用1s检测溶液中该种离子的电位信号；而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位，即为一个循环；随后进行第二个循环即施加1秒的相反方向的恒电流，使溶液中的另外一种电性的离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，用1s检测溶液中该电性离子的电位信号，而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位，完成两种电性离子的检测；可以同时设计多个循环，多次重复的对两种离子进行检测，得到不同电性离子对照电位信号；

而后向测量池中加入固定修饰功能化的磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，从而获得酶促反应后生成的带有不同电荷的指示离子，即两种底物经过酶促反应生成两种带有相反电荷的离子，一中底物对应生成带正电的指示离子，另一种底物对应生成带负电的指示离子；将恒电流技术和恒电位技术相结合，在电流控制的条件下实现电极电位响应，电极识别酶促反应后不同电性的指示离子的电位信号，得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号(参考图3)；通过控制施加不同电性的电流，识别带有不同电荷的指示离子，实现检测两种物质的目的；通过控制施加电流的大小，调控检测被测物的线性范围；

c.根据与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号和不同电性离子对照电位信号的电位差绘制标准曲线；

e.通过检测得到的与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号和不同电性离子对照电位信号的电位差分析由特定化学反应后生成的不同电荷指示离子引起的变化，进而间接地定量获得待测物浓度，从而达到检测被测物的目的。

实施例1

本发明检测环境中的致病菌：葡萄球菌和大肠杆菌为例，具体是通过检测两种细菌中的的特异性核酸序列来达到检测并区分细菌的目的。其测定步骤如下：

a.功能化磁珠的制备：取30微升链霉亲和素，经洗脱液洗脱3遍，在30微升链霉亲合素上固定大肠杆菌的捕获核酸链5-Biotin-CGCGAACAGTTC-3，由特异性核酸链按照碱基互补的原则得到，加入30微升浓度为5×10^-5的溶液，室温下震荡30min；而后依据碱基之间的作用力固定各浓度大肠杆菌的特异性核酸序列5-TATCAGGCATGGCTCTTGATAACGAACTGTTCGCG-3，室温下震荡1h；随后连接信号分子，该信号分子同样根据大肠杆菌的特异性核酸序列得到即5-ATCAAGAGCCATGCCTGATA-Biotin-3，根据第二步中特异性核酸序列的浓度进行固定，同样室温下震荡1h；最后固定辣根过氧化物酶(HRP)室温下震荡30min；每一步固定完成后都需用缓冲溶液洗3遍；葡萄球菌的固定化与上述步骤相似，三条链为依次为5-Biotin-CAATGTGCGGGT-3，5-GTCTAGCCATAAATTGATCGTTGACCCGCACATTG-3，5-CGATCAATTTATGGCTAGAC-Biotin-3；最后固定的酶为碱性磷酸酯酶；(参见图4)；洗脱完成后待用；

b.电极的制备：PVC颗粒、邻硝基苯辛醚、四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵的混合物100mg，其中为45％PVC颗粒、45％邻硝基苯辛醚和10％的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵，融入到1ml四氢呋喃溶液中，室温条件下搅拌2-4h即可得到聚合物敏感膜；电位传导层为聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸；移取10微升聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸滴加到玻碳电极上，室温下晾干，然后套上准备好的PVC管，滴加80微升制备好的聚合物敏感膜于电位传导层上，室温晾干后，再以2mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液活化12h，即获得聚合物敏感膜电极，作为工作电极。其中，按重量百分比计，45％PVC颗粒、45％邻硝基苯辛醚和10％的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵。

c.将工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)分别通过导线和电化学工作站相连作为检测装置(参见图1)插入含有底物的2mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液的测量池中，首先在零电流的条件下走开路电位，确认工作电极的初始电位；而后设计检测程序，在程序中设计施加1s5微安的恒电流，使溶液中的一种电性离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，再用1s检测溶液中该种离子的电位信号；而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位，即为一个循环；随后进行第二个循环即施加1秒-5微安的相反方向的恒电流，使溶液中的另外一种电性的离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，用1s检测溶液中该电性离子的电位信号，而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位；得到不同方向的电位变化信号，即对照电位信号；所述参比电极为Ag-AgCl，辅助电极为铂电极；

而后向测量池中加入磁性分离后的功能化磁珠，室温下反应8min，使其与底物进行酶促反应，HRP酶催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，碱性磷酸酯酶催化对硝基磷酸酯；从而获得酶促反应后生成的两种指示离子，检测反应后测量池中离子的电位信号，大肠杆菌对应向下的信号，葡萄球菌对应向上的信号。(参见图3)

所述洗脱液为10mMTris,1mMEDTA,500mMNaCl,1mMMgCl₂缓冲溶液,PH为7.4；所述底物为对硝基磷酸盐和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。所述核酸序列需在PH为7.4，10mMTris,1mMEDTA,500mMNaCl,1mMMgCl₂缓冲溶液下存在；底物需在2mMTrispH＝8的缓冲溶液下存在。

d.以单独检测葡萄球菌特异性核酸序列为例，分别用Tris缓冲溶液稀释核苷酸序列，获得浓度梯度分别为10^-13，10^-12，10^-11，10^-10，10^-9，10^-8mol/L的标准葡萄球菌特异性核酸序列溶液，而后利用上述工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)按照上述步骤进行检测标准溶液，产生标准电位信号(参见图5)；以对照和标准电位信号的差值对葡萄球菌特异性核酸序列浓度分别绘图得标准工作曲线(如图6)，根据标准工作曲线的电位差定量葡萄球菌的特异性核苷序列，间接定量葡萄球菌；

同理同时检测大肠杆菌和葡萄球菌，得到同时检测两种细菌的标准工作曲线图(如图7)。

实施例2

检测两条特定micro-RNA序列，其测定步骤如下：

a.功能化磁珠的制备：取30微升链霉亲和素，经洗脱液洗脱3遍，然后将其和micro-RNA序列的捕获核酸链，micro-RNA，信号核酸链依次连接，两条micro-RNA序列分别为人体中的一种micro-RNA序列5-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3，斑马鱼miR-184的序列5-GGGAAUAGUAAGAGGCGGU-3；相应的捕获核酸链和信号核酸链可以根据碱基互补配对原则得到，具体，人的micro-RNA捕获分子：5-Biotin-GACACCAGGGAUUCCUG-3；信号分子：5-GAAAACUGGACCCA-Biotin-3；斑马鱼miR-184的捕获分子：5-Biotin-CAGACCGCCUCU-3；信号分子：5-UACUAUUCCCCAC-Biotin-3；其它过程和实施例1中的过程相似；每连接一条链都需用洗脱液洗脱3遍，最后人体中的micro-RNA标记的辣根过氧化物酶(HRP)，斑马鱼miR-184碱性磷酸酯酶；洗脱完成后，待用；

所述洗脱液为10mMTris,1mMEDTA,500mMNaCl,1mMMgCl₂,PH为7.4；所述底物为对硝基磷酸盐和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。所述核酸序列需在PH为7.4，10mMTris,1mMEDTA,500mMNaCl,1mMMgCl₂缓冲溶液下存在；底物需在2mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液下存在。

b.电极的制备：PVC颗粒、邻硝基苯辛醚、四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵的混合物100mg，融入到1ml四氢呋喃溶液中，室温条件下搅拌2-4h即可得到聚合物敏感膜；电位传导层为聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸；移取10微升聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸滴加到玻碳电极上，室温下晾干，然后套上准备好的PVC管，滴加80微升制备好的聚合物敏感膜于电位传导层上，室温晾干后，再以2mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液活化12h，即获得聚合物敏感膜电极，作为工作电极。其中，按重量百分比计，45％PVC颗粒、45％邻硝基苯辛醚和10％的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵。

c.工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)分别通过导线和电化学工作站相连作为检测装置(参见图1)；将工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)插入含有底物的50mmol/LpH＝8的PBS缓冲溶液的测量池中，首先在零电流的条件下走开路电位，确认工作电极的初始电位；而后设计检测程序，在程序中设计施加1s5微安的恒电流，使溶液中的一种电性离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，再用1s检测溶液中该种离子的电位信号；而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位，即为一个循环；随后进行第二个循环即施加1秒-5微安的相反方向的恒电流，使溶液中的另外一种电性的离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，用1s检测溶液中该电性离子的电位信号，而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位；得到不同方向的电位变化信号，即对照电位信号；所述参比电极为Ag-AgCl，辅助电极为铂电极；

而后向测量池中加入磁性分离后的功能化磁珠，室温下反应8min，使其与底物进行酶促反应，HRP酶催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，碱性磷酸酯酶催化对硝基磷酸酯；从而获得酶促反应后生成的两种指示离子，检测反应后测量池中离子的电位信号，人体中的micro-RNA对应向下的信号，斑马鱼miR-184对应向上的信号。

实施例3

本发明检测环境中的两种抗生素氧氟沙星、诺氟沙星，具体是通过检测两种抗生素中的特异性核酸适配体(aptamer)来达到检测并区分抗生素的目的。其测定步骤如下：

a.功能化磁珠的制备：取30微升链霉亲和素，经洗脱液洗脱3遍，然后将其和两种抗生素中的捕获核酸链，特异性核酸适配体，信号核酸链依次连接，相应的捕获核酸链和信号核酸链可以根据碱基互补配对原则得到；其它过程和实施例1中的过程相似；每连接一条链都需用洗脱液洗脱3遍，最后氧氟沙星标记的辣根过氧化物酶(HRP)，诺氟沙星标记碱性磷酸酯酶；洗脱完成后，待用；

b.电极的制备：PVC颗粒、邻硝基苯辛醚、四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵的混合物100mg，融入到1ml四氢呋喃溶液中，室温条件下搅拌2-4h即可得到聚合物敏感膜；电位传导层为聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸；移取10微升聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸滴加到玻碳电极上，室温下晾干，然后套上准备好的PVC管，滴加80微升制备好的聚合物敏感膜于电位传导层上，室温晾干后，再以50mmol/LpH＝8的PBS缓冲溶液活化12h，即获得聚合物敏感膜电极，作为工作电极。其中，按重量百分比计，45％PVC颗粒、45％邻硝基苯辛醚和10％的四(4-氯苯基)硼酸四(十二烷基)铵。

c.工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)分别通过导线和电化学工作站相连作为检测装置(参见图1)；将工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)插入含有底物的50mmol/LpH＝8的PBS缓冲溶液的测量池中，首先在零电流的条件下走开路电位，确认工作电极的初始电位；而后设计检测程序，在程序中设计施加1s5微安的恒电流，使溶液中的一种电性离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，再用1s检测溶液中该种离子的电位信号；而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位，即为一个循环；随后进行第二个循环即施加1秒-5微安的相反方向的恒电流，使溶液中的另外一种电性的离子高效的聚集到工作电极的聚合物敏感膜上，用1s检测溶液中该电性离子的电位信号，而后设计120s的时间使工作电极自发回到开始检测得到的初始电位；得到不同方向的电位变化信号，即对照电位信号；所述参比电极为Ag-AgCl，辅助电极为铂电极；

而后向测量池中加入磁性分离后的功能化磁珠，室温下反应8min，使其与底物进行酶促反应，HRP酶催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，碱性磷酸酯酶催化对硝基磷酸酯；从而获得酶促反应后生成的两种指示离子，检测反应后测量池中离子的电位信号，氧氟沙星对应向下的信号，诺氟沙星对应向上的信号。

实施例4

本发明检测环境中的两种重金属铅和汞，具体检测其特异性核酸适配体(aptamer)。

功能化磁珠的制备：取30微升链霉亲和素，经洗脱液洗脱3遍，然后将其和两种金属的捕获核酸链，特异性核酸适配体(aptamer)，信号核酸链依次连接，相应的捕获核酸链和信号核酸链可以特异性核酸适配体(aptamer)根据碱基互补配对原则得到；其它过程和实施例1中的过程相似；每连接一条链都需用洗脱液洗脱3遍，最后汞金属对应标记辣根过氧化物酶(HRP)，铅金属对应标记碱性磷酸酯酶；洗脱完成后，待用；

工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)分别通过导线和电化学工作站相连作为检测装置(参见图1)；将工作电极(1)、参比电极(2)、辅助电极(3)插入含有底物的10mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液的测量池中，首先在零电流的条件下走开路电位，确认工作电极的初始电位；而后设计检测程序，检测缓冲溶液中原有离子的电位信号，为对照电位信号；而后向测量池中加入磁性分离后的功能化磁珠，室温下反应8min，使其与底物进行酶促反应，HRP酶催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，碱性磷酸酯酶催化对硝基磷酸酯；从而获得酶促反应后生成的两种指示离子，检测反应后测量池中离子的电位信号，汞对应向下的信号，铅对应向上的信号。

实施例5

检测两种免疫球蛋白IgG和IgE：

将免疫球蛋白IgG和IgE溶解于10mmol/LpH＝8的Tris缓冲溶液中，链霉亲和素与免疫球蛋白IgG和IgE结合，然后IgG对应标记辣根过氧化物酶(HRP)，IgE对应标记碱性磷酸酯酶；其标记过程和实施例1相似；最后经过磁性分离转移到盛有两种底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺和碱性磷酸酯酶的测量池中，进行酶促反应，HRP酶催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺，碱性磷酸酯酶催化对硝基磷酸酯；从而获得酶促反应后生成的两种指示离子，检测反应后测量池中离子的电位信号，IgG对应向下的信号，IgE对应向上的信号。

实施例6

本发明基于具有类酶功能的核酸序列作为信号分子；使用一个发夹DNA结构作为催化信标，作用等同于上文所述的酶标；该信标包括两部分，其一为环状的可识别被测物特异性识别分子的核酸序列，作用等同于上文所述的捕获分子；其二为颈部成杂交状态的富G序列5-GGGTAGGGCGGGTTGGGT-3；目标核酸序列能够触发信标释放出富G序列，在实验过程中，目标核酸序列为被测物的特异性核酸序列；在血红素的存在下，富G序列能够显示过氧化酶活性，与底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺反应产生带电荷的指示离子，检测得到电位信号。该方法可使以上实验中功能化磁珠的制作过程简单化，减少工作量和检测时间，同时降低试验成本。

采用本发明的检测方式的聚合物敏感膜离子选择性电极还可对食品中氨基酸的检测，通过检测特异性识别氨基酸的识别分子，达到检测氨基酸的目的。同时还可对生物体细胞中多糖的检测，通过检测特异性识别生物体细胞中多糖的识别分子，达到检测氨基酸的目的。

另外，本发明将恒电位技术和恒电流技术相结合，电极通过施加外加电流，进而对其实现电极界面底物浓度的控制：聚合物敏感膜离子选择性电极为工作电极1连接到提供电流控制的仪器CHI760电化学工作站，首先检测开路电位，然后选择施加1秒5μA的脉冲电流，使得指示离子快速转移到电极敏感膜相，实现检测的快速化，灵敏化，对电位信号的变化情况进行实时测定。这种恒电位技术和恒电流技术相结合实现了电极的可逆、重复使用，减少工作量，能够提高分析的稳定性性和灵敏度，减小实验误差。

Claims (8)

1.一种对两种物质同时检测的方法，其特征在于：将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池中,对测量池缓冲溶液中已有的离子进行检测，得到不同电性已有的离子的对照电位信号；而后向测量池中加入固定修饰的功能化磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，从而获得酶促反应后生成带有不同电性的指示离子，电极捕获不同电性指示离子的电位信号，即得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号；与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号和不同电性已有的离子的对照电位信号的差值是由特定化学反应后生成的不同电荷指示离子引起的变化，进而间接地定量获得被测物浓度。

2.按权利要求1所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述不同电荷指示离子的对照电位信号是采用恒电流和恒电位相结合的方式检测获得，将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池，在零电流情况下，获得其开路电位，而后检测溶液中的离子在对工作电极施加不同电性的电流时，工作电极识别带有不同电性的离子，得到不同电性离子的对照电位信号。

3.按权利要求1所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述反应后不同电荷指示离子信号是采用恒电流和恒电位相结合的方式检测获得，将聚合物敏感膜离子选择性电极插入含有两种底物的缓冲溶液的测量池，再向测量池内加入固定化修饰的磁珠，室温下使其与底物进行酶促反应，在零电流情况下，获其得开路电位，而后对电机施加不同方向的电流，电极识别酶促反应后不同电荷的指示离子的电位信号，得到与被测物反应后不同电性指示离子的电位信号；

其中，固定化修饰的磁珠上修饰固定有被测物的捕获分子，被测物的特异性识别分子以及酶标记过的信号分子，组成三明治夹心结构。

4.按权利要求1、2或3所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述聚合物敏感膜离子选择性电极为在基底底部依次粘附电位传导层和聚合物敏感膜；其中，电位传导层为聚(3,4-乙烯二氧噻吩)-聚苯乙烯磺酸(PEDOT/PSS)或咪唑盐离子。

5.按照权利要求3所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述被测物的特异性识别分子为核酸适体、抗原、抗体、多肽或DNA。

6.按权利要求3所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述待检测的物质为重金属，三氧化二砷，五氧化二砷、二甲基汞、铬类物质、有机农药类，有机磷农药、有机氮农药、有机氯农药、有机氟农药、有机硫农药、有机铜农药、大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，弧菌、抗生素，内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类、有机污染物，多溴联苯类，表面活性剂、酚类、醛类污染物中的两种或两种以上。

7.按权利要求3所述的对两种物质同时检测的方法，其特征在于：所述酶标记过的信号分子为辣根过氧化物酶、碱性磷酸脂酶、大豆过氧化物酶、漆酶、胆红素氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、G四联体功能酶、氧化石墨烯、贵金属参杂氧化铁、氧化铈、单壁纳米管、碳纳米管、AgPt、AgAu、AgPd、FeS中两种或两种以上的物质。

8.按照权利要求1所述的同时检测两种物质的方法，其特征在于：所述底物为对硝基磷酸酯，磷酸二氢盐、二聚偏磷酸盐、四聚偏磷酸盐、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、邻苯二胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐氨基联苯胺、对茴香胺、间茴香胺、邻茴香胺、甲苯胺、氯苯胺、氟苯胺、二甲基联苯胺、4,4’-亚甲基双邻氯苯胺、对氨基偶氮苯、萘胺、硝基萘胺、对乙氧基苯胺、邻苯二胺、间苯二胺、对苯二胺、N-苯基对苯二胺、联大茴香胺、邻联甲苯胺、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、鲁米诺、邻氨基苯酚、吲哚-3-乙酸中的两种或两种以上的物质。