CN105424787B - 一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法 - Google Patents

一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法，属于新型生物传感检测技术领域。基于丝网印刷电极导电性好，价格便宜，重现性好，方便携带，可以实施在线检测等特点，能够适用于不同环境下的测试，减少了玻碳电极磨制过程中造成的不确定因素，因此，基于丝网印刷策略实现对四环素和土霉素检测能够到达良好的效果。

Description

一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法，属于新型生物传感检测技术领域。采用丝网印刷电极的检测方法，利用四环素和土霉素结合相应适配体链前后，适配体链末端二茂铁离电极的距离变化而产生的信号强度的差异，来判断待测样品中四环素和土霉素的含量，从而实现对两种四环素类抗生素的灵敏检测。
背景技术
抗生素，是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种物质，因此通过对抗生素的检测能够监测待测样品中微生物的生长状况。
目前已有的抗生素的检测方法很多，但是大多都是需要大型设备和专业的操作人员。丝网印刷电极，因其导电性好，价格便宜，重现性好，方便携带，可以实施在线检测等特点，能够适用于不同环境下的测试，减少了玻碳电极磨制过程中造成的不确定因素，因此，基于丝网印刷策略的检测能够到达良好的效果。
适配体传感器是将分子识别与分析化学方法相结合的一种生物传感器，通过适配体与靶分子之间的特异性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。
本发明采用氧化锌纳米棒为基底材料，利用四环素和土霉素结合相应适配体链前后，适配体链末端二茂铁离电极的距离变化而产生的信号强度的差异，实现对四环素和土霉素的检测，增强了传感器的灵敏度，扩宽了线性范围，有效地降低了传感器的检出限，实现了对抗生素的超灵敏分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，有效克服了目前抗生素检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是基于氧化锌纳米棒为基底材料，构建了一种无酶，超灵敏的适配体传感器。
本发明的目的之二是利用电子媒介体二茂铁离电极的距离变化而产生的信号强度的差异，实现对四环素和土霉素的检测。
本发明的目的之三是实现了对四环素类的两种抗生素土霉素和四环素的同时检测。
本发明的技术方案如下：
1. 一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法
（1）将3 ~ 6 µL、质量分数为0.015% ~ 0.15%的盐酸滴加在双通道丝网印刷电极的工作电极上1 ~ 30 min，超纯水洗净；
（2）滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 1.5 mg/mL的氧化锌纳米棒溶液，室温下晾干；
（3）滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 0.4 mol/L的EDC/NHS溶液，室温下孵化0.2 ~ 2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（4）分别滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 10 µmol/L的羧基和二茂铁修饰的四环素适配体和3 ~ 6 µL、0.1 ~ 10 µmol/L羧基和二茂铁修饰的土霉素适配体于双通道丝网印刷电极的两个工作电极上，室温下孵化0.2 ~ 2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（5）分别滴加3 ~ 6 µL、0.01 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的四环素TET和土霉素OTC标准溶液至两个工作电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器。
2. 氧化锌纳米棒的制备
（1）将0.5 ~ 5.0 g可溶性淀粉溶于35 ~ 85 mL沸水中，并加入0.35 ~ 1.5 gZnNO3，于50 ~ 100 ℃下反应5 ~30 min；
（2）在上述溶液中加入 0.01 ~ 1 mL氨水，保持50 ~ 90 ℃下反应10 ~ 60 min，将产物于7000 ~ 12000 r/min下离心10 min，35 ~ 80 ℃下干燥8 h；
（3）将所得固体在管式炉内空气气氛中450 ~ 700 ℃煅烧1 ~ 10 h，得到氧化锌纳米棒。
3. 传感器用于四环素和土霉素的检测步骤
（1）使用多通道电化学工作站进行测试，丝网印刷的Ag/AgCl电极为参比电极，丝网印刷的石墨电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，将丝网印刷电极板三电极体系浸入到5 ~ 20 mL、20 ~ 100 mmoL/L、pH 6.00 ~8.10的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用循环伏安法对四环素和土霉素标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，测量抗原加入四环素和土霉素前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）氧化锌纳米棒的使用，即增大了传感表面的比表面积，又增加了适配体链的负载位点，提高了对于抗生素的检出量。
（2）本发明基于丝网印刷策略，实现了对四环素类的两种抗生素土霉素和四环素的同时检测。
（3）本发明采取了适配体与待测靶分子特异性识别的原理，在进行微量检测的同时，保证了检测结果的准确性。
具体实施方式
实施例1
一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法
（1）将3 µL、质量分数为0.015%的盐酸滴加在双通道丝网印刷电极的工作电极上1min，超纯水洗净；
（2）滴加3 µL、0.1 mg/mL的氧化锌纳米棒溶液，室温下晾干；
（3）滴加3 µL、0.1 mol/L的EDC/NHS溶液，室温下孵化0.2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（4）分别滴加3 µL、0.1 µmol/L的羧基和二茂铁修饰的四环素适配体和3µL、0.1 µmol/L羧基和二茂铁修饰的土霉素适配体于双通道丝网印刷电极的两个工作电极上，室温下孵化0.2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（5）分别滴加3 µL、0.01 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的四环素TET和土霉素OTC标准溶液至两个工作电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器。
实施例2
一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法
（1）将5 µL、质量分数为0.08%的盐酸滴加在双通道丝网印刷电极的工作电极上10min，超纯水洗净；
（2）滴加5 µL、0.5 mg/mL的氧化锌纳米棒溶液，室温下晾干；
（3）滴加5 µL、0.2 mol/L的EDC/NHS溶液，室温下孵化0.8 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（4）分别滴加5 µL、6 µmol/L的羧基和二茂铁修饰的四环素适配体和5 µL、5 µmol/L羧基和二茂铁修饰的土霉素适配体于双通道丝网印刷电极的两个工作电极上，室温下孵化0.7 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（5）分别滴加3 µL、0.01 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的四环素TET和土霉素OTC标准溶液至两个工作电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器。
实施例3
一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法
（1）将6 µL、质量分数为0.15%的盐酸滴加在双通道丝网印刷电极的工作电极上30min，超纯水洗净；
（2）滴加6 µL、1.5 mg/mL的氧化锌纳米棒溶液，室温下晾干；
（3）滴加6 µL、0.4 mol/L的EDC/NHS溶液，室温下孵化2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（4）分别滴加6 µL、10 µmol/L的羧基和二茂铁修饰的四环素适配体和6 µL、10 µmol/L羧基和二茂铁修饰的土霉素适配体于双通道丝网印刷电极的两个工作电极上，室温下孵化2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
（5）分别滴加6 µL、0.01 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的四环素TET和土霉素OTC标准溶液至两个工作电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器。
实施例4
氧化锌纳米棒的制备
（1）将0.5 g可溶性淀粉溶于35 mL沸水中，并加入0.35 g ZnNO3，于50 ℃下反应5min；
（2）在上述溶液中加入 0.01 mL氨水，保持50℃下反应10 min，将产物于7000 r/min下离心10 min，35℃下干燥8 h；
（3）将所得固体在管式炉内空气气氛中450 ℃煅烧1 h，得到氧化锌纳米棒。
实施例5
氧化锌纳米棒的制备
（1）将3.0 g可溶性淀粉溶于55 mL沸水中，并加入0.5 g ZnNO3，于75 ℃下反应10min；
（2）在上述溶液中加入 0.5 mL氨水，保持80 ℃下反应30 min，将产物于10000 r/min下离心10 min，60 ℃下干燥8 h；
（3）将所得固体在管式炉内空气气氛中600 ℃煅烧5 h，得到氧化锌纳米棒。
实施例6
氧化锌纳米棒的制备
（1）将5.0 g可溶性淀粉溶于85 mL沸水中，并加入1.5 g ZnNO3，于100 ℃下反应30 min；
（2）在上述溶液中加入1 mL氨水，保持90 ℃下反应60 min，将产物于12000 r/min下离心10 min，80 ℃下干燥8 h；
（3）将所得固体在管式炉内空气气氛中700 ℃煅烧10 h，得到氧化锌纳米棒。
实施例7
传感器用于四环素和土霉素的检测步骤
（1）使用多通道电化学工作站进行测试，丝网印刷的Ag/AgCl电极为参比电极，丝网印刷的石墨电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，将丝网印刷电极板三电极体系浸入到5 mL、20 mmoL/L、pH 6.00的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用循环伏安法对四环素和土霉素标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，测量抗原加入四环素和土霉素前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
实施例8
传感器用于四环素和土霉素的检测步骤
（1）使用多通道电化学工作站进行测试，丝网印刷的Ag/AgCl电极为参比电极，丝网印刷的石墨电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，将丝网印刷电极板三电极体系浸入到10 mL、70 mmoL/L、pH 7.40的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用循环伏安法对四环素和土霉素标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，测量抗原加入四环素和土霉素前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
实施例9
传感器用于四环素和土霉素的检测步骤
（1）使用多通道电化学工作站进行测试，丝网印刷的Ag/AgCl电极为参比电极，丝网印刷的石墨电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，将丝网印刷电极板三电极体系浸入到20 mL、100 mmoL/L、pH 8.10的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用循环伏安法对四环素和土霉素标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V~ 0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，测量抗原加入四环素和土霉素前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。

Claims (2)

1.一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）氧化锌纳米棒的制备
1）将0.5 ~ 5.0 g可溶性淀粉溶于35 ~ 85 mL沸水中，并加入0.35 ~ 1.5 g ZnNO3，于50 ~ 100 ℃下反应5 ~30 min；
2）在上述溶液中加入 0.01 ~ 1 mL氨水，保持50 ~ 90 ℃下反应10 ~ 60 min，将产物于7000 ~ 12000 r/min下离心10 min，35 ~ 80 ℃下干燥8 h；
3）将所得固体在管式炉内空气气氛中450 ~ 700 ℃煅烧1 ~ 10 h，得到氧化锌纳米棒；
（2）丝网印刷传感器的制备
1）将3 ~ 6 µL、质量分数为0.015% ~ 0.15%的盐酸滴加在双通道丝网印刷电极的工作电极上1 ~ 30 min，超纯水洗净；
2）滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 1.5 mg/mL的上述氧化锌纳米棒溶液，室温下晾干；
3）滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 0.4 mol/L的EDC/NHS溶液，室温下孵化0.2 ~ 2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
4）分别滴加3 ~ 6 µL、0.1 ~ 10 µmol/L的羧基和二茂铁修饰的四环素适配体和3 ~ 6µL、0.1 ~ 10 µmol/L羧基和二茂铁修饰的土霉素适配体于双通道丝网印刷电极的两个工作电极上，室温下孵化0.2 ~ 2 h，超纯水洗净，室温下晾干；
5）分别滴加3 ~ 6 µL、0.01 ~ 20 ng/mL的一系列不同浓度的四环素TET和土霉素OTC标准溶液至两个工作电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱中晾干，制得一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器。
2.如权利要求1所述的一种同时检测四环素和土霉素的丝网印刷传感器，用于四环素和土霉素的同时检测，其特征在于，步骤如下：
（1）使用多通道电化学工作站进行测试，丝网印刷的Ag/AgCl电极为参比电极，丝网印刷的石墨电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，将丝网印刷电极板三电极体系浸入到5 ~ 20 mL、20 ~ 100 mmoL/L、pH 6.00 ~ 8.10的PBS缓冲溶液中进行测试；
（2）用循环伏安法对四环素和土霉素标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V ~0.6V；
（3）当背景电流趋于稳定后，测量加入四环素和土霉素抗原前后的传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
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