CN112394098B - 一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器及其制备方法以及应用，以一种具有二乙氨基苯酚官能团和两个相互作用的pH敏感位点的希尔型罗丹明衍生物PHX2为带电型生色离子载体，以聚己内酯和O‑乙酰柠檬酸三丁酯为纳米传感器的基质，一步沉淀法即得。基于离子交换传感机理，本发明以钠和钾离子选择性载体为例，进一步将其应用于制备具有金属离子特异性的荧光纳米光器件，研究发现其具有实时监测胞内离子浓度的性能。根据本发明，提供了一种具有低毒性和高生物相容性，并且可用于细胞内离子长期监测的新型金属离子选择性纳米传感器。

Description

一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性 纳米传感器及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米传感器领域，更具体地涉及一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器及制备方法和应用。
背景技术
细胞内离子如钠和钾离子等在生物活性中起重要作用。它们参与膜运输，细胞内信号传递，细胞活性调节等。光学传感器是基于离子的检测和成像技术而广泛使用的光学转导技术，通过与目标分析物离子相互作用而改变其光学特性。如今，已开发出许多用于离子检测的试剂，例如荧光蛋白，有机荧光分子，DNA功能化传感器和荧光微粒或纳米颗粒。离子选择性纳米传感器由于其较高的灵敏度，出色的选择性，快速的响应时间，良好的响应范围和简单的制备工艺而成为生物化学，临床医学和环境领域中检测游离离子的有效工具之一。通常，离子选择性纳米传感器由包裹在聚合物基质中的离子载体(L)，交换剂(R)和亲脂性pH指示剂(生色离子载体)组成。离子选择性纳米光纳米传感器的响应是基于通过离子交换团的质子化和去质子化形成的离子交换机制。目标离子(分析物)和离子载体在纳米传感器中结合，导致分析物和H+离子之间的竞争。然后，可以通过吸光度或荧光强度的变化观察生色离子载体的质子化/去质子化。
江德臣和他的同事合成了哌啶功能化硼二吡咯烷(BODIPY)衍生物作为苯氨基BODIPY类型的pH指示剂，该探针已成功地用于制备具有双(2-乙基己基癸二酸酯(DOS)和高分子量的聚氯乙烯(PVC)作为光学基质检测Pb2+的荧光开启选择性纳米传感器膜。此外，他们还开发了一种杯芳烃功能化的BODIPY衍生物(CBDP)的pH敏感染料作为生色离子载体，用于制备基于DOS和PVC的离子选择性纳米传感器，并成功检测了兔体内的氯离子，钾离子，钠离子和钙离子等。另外，Bakker和他的同事报告了一类具有不同酸度系数(pKa)的荧光恶嗪酮衍生物(Ox)染料用于DOS和PVC制备的纳米传感器膜中的生色离子团。在离子选择膜的基础上，前人已通过使用聚乙二醇-脂质或泊洛沙姆开发了微型或纳米传感器。Bakker等在泊洛沙姆的帮助下制备了基于Ox染料和DOS的纳米传感器，并测定其作为生色离子载体在纳米传感器中的pKa值。使用泊洛沙姆通过溶剂沉淀法获得了超小尺寸的离子选择性纳米颗粒，这使得纳米传感器用于可见图像检测成为可能。谢小江等人合成了一系列基于D-π-A结构的溶剂变色染料，作为基于DOS的离子选择性纳米传感器的生色离子载体。将该纳米传感器用于盘基网柄菌活细胞中的离子成像以及体外血浆中钠离子的检测。江德臣和他的同事还使用CBDP(与ETH 5350相比)作为制备基于DOS的纳米传感器的生色离子载体，将其用于HeLa细胞中细胞内钙离子的连续成像。但是，通过噻唑蓝分析，发现基于DOS的纳米传感器在高浓度下对细胞具有较大的毒性。此外，Clark和他的同事首次发明了以聚己内酯(PCL)为基质，以聚乙二醇为表面活性剂的钠离子纳米传感器。它是通过溶剂置换法制备的，其制备过程复杂，包括离心，洗涤和重悬。基于PCL的纳米传感器在肝脏中脂肪酶的浓度下，会在4小时内降解。PCL是众所周知的健康且生物相容性的材料，是一种广泛使用的FDA批准的聚合物，可作为光学基质。此外，PCL作为一种常用的生物材料，由于其流变和粘弹性优于许多脂肪族聚酯对应物，易于制备和操作。因此，PCL已被制成微粒和纳米微粒，在胶体药物传递系统中充当运输载体隔室。当前，用于离子选择性纳米传感器的商业化生色离子载体主要是ETH系列，包括ETH 5294(CH I，λex/em 535/660纳米)，ETH 5350(CH III，λex/em 645/669纳米)，ETH 5418。但是，很大一部分ETH化合物是弱荧光或非荧光的，其类型对于其应用而言过于简单。因此，需要开发更多的pH依赖型染料用于离子选择性纳米传感器。
最近，杨有军及其同事报道了一种设计精巧的希尔型小分子pH探针(PHX2)，该探针具有对二乙氨基苯酚部分和两个相互作用的pH敏感位点，并与罗丹明骨架相连，从而提供了质子化正向协同的作用。PHX2的pKa约为6.9，被用作识别癌细胞反向跨膜梯度的理想探针，并成功地用于观察Hepa1-6细胞的微小pH变化。据我们所知，PHX2尚未被用作离子选择性纳米传感器中的生色离子载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器及其制备方法以及应用，从而解决现有技术中缺乏一种具有低毒性和高生物相容性，并且可用于金属离子检测的离子选择性纳米传感器的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器的制备方法，以一种新型pH响应罗丹明衍生物为带电型生色离子载体，以聚己内酯(PCL)和O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)为聚合物基质，一步沉淀即得，其中，所述新型pH响应罗丹明衍生物是一种修饰对二乙氨基苯酚官能团且连有两个相互作用的pH敏感位点的希尔型小分子pH探针(PHX2)。
虽然杨有军及其同事报道了一种设计精巧的希尔型(Hill-Type)小分子pH探针(PHX2)，但是，PHX2尚未被用作离子选择性纳米传感器中的生色离子载体，而本发明的主要目的即在于将该PHX2作为亲脂型的pH生色离子载体，用于制备一种具有可生物降解聚合物基质的光学离子选择性纳米传感器。聚己内酯(PCL)和O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)将用作掺入PHX2的纳米传感器的基质，因为它可以在体内降解并从体内清除，从而降低长期毒性。选择ATBC作为PCL的增塑剂，因为该聚合物可赋予机械稳定性，而增塑剂则可使传感成分在纳米颗粒内均匀分散。
因此应当理解的是，本发明的目的是以PHX2为亲脂性的pH生色离子载体，用于制备具有可生物降解聚合物基质的光学离子选择性纳米传感器，其中PHX2是根据文献报道制备，具体参考杨有军及其同事发表的文章(X.Luo,H.Yang,H.Wang,Z.Ye,Z.Zhou,L.Gu,J.Chen,Y.Xiao,X.Liang,X.Qian,Y.Yang,Highly sensitive Hill-type small-moleculepH probe that recognizes the reversed pH gradient of cancer cells,Anal.Chem.90(2018)5803-5809)。其中PHX2的pKa为6.9。PHX2能够选择性地点亮肿瘤细胞间质，快速高效区分正常组织与癌组织，对实体瘤组织进行快速诊断，在癌症诊断和荧光引导手术中具有极大的应用潜力。
根据本发明提供的一种基于希尔型小分子pH探针的离子选择性纳米传感器的制备方法，包括以下步骤：S1：将包含希尔型小分子pH探针PHX2，四(3,5-双(三氟甲基)苯基)硼酸钠(NaTFPB)，O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)，聚己内酯(PCL)以及泊洛沙姆的混合物溶解于四氢呋喃中，以形成均匀的粉红色溶液；S2：吸取步骤S1中获得的均相溶液，将其注入搅拌状态下的超纯水的涡旋中，获得一种基于PHX2的纳米传感器的纳米颗粒悬浮液；以及S3：将步骤S2获得的纳米颗粒悬浮液在表面上吹净N2超过30分钟，以除去THF，即得。
根据本发明的一个优选方案，在步骤S1中进一步加入钾离子载体，即可获得一种钾离子选择性纳米传感器。
根据本发明的另一优选方案，在步骤S1中进一步加入钠离子载体，即可获得一种钠离子选择性纳米传感器。
优选地，步骤S2包括：吸取适量的均相溶液，并注入以800～1200转/分钟的速度搅拌的超纯水的涡旋中。
根据本发明的第二方面，提供一种根据上述制备方法制备得到的基于新型pH响应罗丹明衍生物的离子选择性纳米传感器。
本发明通过制备钠和钾离子选择性纳米粒子，分别评估了PHX2在阳离子选择性纳米传感器中的功能。并进一步地采用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)测量用于表征所提出的可生物降解纳米粒子的形态。通过紫外线-可见光(UV-VIS)吸收对其响应性能进行研究。进一步地，用人肝癌细胞(HepG2)研究了基于可生物降解基质(PCL和ATBC)的PHX2型纳米传感器的细胞毒性。
所述离子选择性纳米传感器对pH值的响应范围为5-12。
所述离子选择性纳米传感器可实现对金属离子的检测，对钠离子的响应浓度范围为10微摩尔/升～100毫摩尔/升，对钾离子的响应浓度范围为100微摩尔/升～1摩尔/升。
在脂肪酶的存在下，作为聚合物基质的聚己内酯(PCL)和O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)可降解。
结果表明，基于PCL和ATBC的PHX2型纳米传感器毒性较低，该种可生物降解纳米传感器的出色生物相容性表明，它可用于长期和连续监测细胞内离子。
根据本发明的第三方面，提供一种离子选择性纳米传感器在金属离子检测中的应用，通过添加离子选择性载体，所述离子选择性纳米传感器以离子交换原理为基础，可分别实现在体外或体内对金属离子的检测。
根据本发明提供的一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型离子选择性纳米传感器，其工作原理在于离子交换：将钠离子或钾离子从样品中萃取到有机相(PCL和ATBC)中，并结合离子载体。为了维持纳米颗粒的电荷平衡，生色离子载体(PHX2)必须将质子释放到水相中。去质子化的PHX2引起纳米颗粒悬浮液的吸收或荧光变化。纳米传感器的基于离子交换机理的响应过程可以用图1表示。众所周知，离子选择性纳米传感器中的生色离子载体分子，如ETH 5294和ETH 5350，通常在发生离子交换过程时仅使一个质子电离。然而，当PHX2在离子选择纳米光子中去质子化时，它最多可将两个质子电离。离子交换平衡可表示为：
Figure BDA0002785232500000051
其中Ind是离子载体，L是游离离子载体，M+是分析物离子(钠离子或钾离子)，
Figure BDA0002785232500000054
是离子载体，np表示纳米粒子，n是离子载体
Figure BDA0002785232500000055
的复杂化学计量。生色离子载体α的非质子化形式的相对部分由下式确定：
Figure BDA0002785232500000052
其中A是特定离子浓度下纳米传感器的紫外吸收强度，Amax是缓冲样品溶液中的吸收强度，Amin是1摩尔/升的氯化钾(或氯化钠)中的吸收强度。交换常数(Kexch)可以表示为等式(3)与基于离子交换膜的经典光电理论相同：
Figure BDA0002785232500000053
然后，离子选择性纳米传感器的依赖于活性的(分析物活性aI)响应由以下方程式表示：
Figure BDA0002785232500000061
其中aH是质子活性，IndT，LT和RT分别为生色离子载体，离子载体和阳离子交换剂的总浓度。
本发明的创造性主要在于，在现有技术公开的一种修饰有对二乙氨基苯酚官能团且连有两个相互作用的pH敏感位点的pH依赖型的罗丹明染料(PHX2)的基础上，进一步将该染料首次用于离子选择性纳米传感器中作为带电型生色离子载体。聚己内酯(PCL)和O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)被用作离子选择性纳米传感器的聚合物基质；在脂肪酶的存在下，该聚合物基质可进行降解。基于PHX2的可生物降解的离子选择性的纳米传感器是通过一步简单的沉淀法制备的。通过透射电子显微镜和共聚焦荧光显微镜表征获得的纳米颗粒的形态，其流体动力学直径约为180纳米。基于PHX2的生物可降解纳米传感器对pH值的响应范围为5-12。以离子交换机理为理论基础，钠和钾离子分别被选作为被测阳离子的模型，即分别加入钠和钾离子选择性载体，用于评估基于PHX2的离子选择性纳米传感器的金属离子响应性能。制备的金属离子响应型纳米传感器显示出不到10秒的快速响应时间，宽响应范围(10微摩尔/升-100毫摩尔/升的钠离子和100微摩尔/升-1摩尔/升的钾离子)以及高的特异性。此外，该钠离子和钾离子选择性纳米传感器可以通过内吞作用进入人肝癌细胞，分布在细胞质中，可用于实时监测胞内的钠和钾离子浓度。该生物降解型离子选择性纳米传感器与细胞孵育24小时后显示出高的细胞活力(大于85％)，表明该体系的低毒性和高生物相容性。研究结果证明，新型荧光生色离子载体PHX2适用于基于离子载体的聚合物纳米传感器，并具有很好的兼容性。该基于新型PHX2生色离子载体和可生物降解基质PCL-ATBC的离子选择性纳米颗粒有望用于细胞内离子的长期监测，并且不会对生物体造成毒性。
根据本发明，一种修饰有对二乙氨基苯酚官能团和两个相互作用的pH敏感位点的罗丹明染料(PHX2)已成功被用作金属离子选择纳米传感器的生色离子载体。基于PHX2的纳米传感器由可生物降解基质PCL-ATBC和阳离子交换剂组成，对pH的响应范围为5至12。在此基础上，通过添加离子选择性载体，基于PHX2的纳米传感器以离子交换原理为基础，可以特异性响应钠离子和钾离子；同时表现出较高的灵敏度，出色的选择性和宽的检测范围以及快速的响应时间。研究结果表明新的生色离子载体(PHX2)在基于可生物降解基质的钠和钾离子纳米传感器中很好地发挥其作用。更重要的是，当与人肝癌细胞共培养时，发现该纳米传感器具有出色的生物相容性。
综上所述，本发明提供了一种具有低毒性和高生物相容性，并且可用于细胞内离子的长期监测的离子选择性纳米传感器。
附图说明
图1示出了基于PHX2的离子选择性纳米传感器的制备过程以及基于离子交换原理的传感机理的示意图；
图2示出了PHX2(0.28毫摩尔/升)在不同溶剂中的吸收光谱，插图显示了在四氢呋喃，苯和乙酸乙酯中的吸收光谱曲线的放大图；
图3A示出了基于PHX2的可生物降解纳米传感器的共聚焦荧光成像图，比例尺：20微米；图3B示出了纳米颗粒在水溶液中的流体力学尺寸分布；
图4A示出了基于PHX2的可生物降解纳米传感器经真空冷冻干燥后的TEM成像图，比例尺：20纳米；图4B示出了图4A中纳米颗粒的统计直径尺寸。
图5示出了基于PHX2的可生物降解纳米传感器在不同pH值的缓冲液(NaH2PO4+硼酸+柠檬酸+0.1摩尔/升的氯化钠)中的吸收光谱图；
图6A示出了在不同钠离子浓度下，基于PHX2的可生物降解型钠离子选择性纳米传感器的吸收光谱图；图6C示出了在不同钾离子浓度下，基于PHX2的可生物降解型钾离子选择性纳米传感器的吸收光谱图，图6B和图6D分别表示钠离子传感器和钾离子传感器的线性范围及最低检测限，背景：10毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液，pH 7.0；
图7A和图7B分别示出了在不同浓度的氯化钠和氯化钾溶液中，基于PHX2的可生物降解型钾离子及钠离子选择性纳米传感器在553纳米处的吸收强度随时间的响应曲线图。
图8A示出了基于PHX2的可生物降解型钠离子选择性纳米传感器的抗干扰性(钾离子，镁离子和钙离子浓度为10-6至10-1摩尔/升)；图8B示出了基于PHX2的可生物降解型钾离子选择性纳米传感器的抗干扰性(钠离子，镁离子和钙离子浓度为10-6至10-1摩尔/升)；
图9分别显示出了与基于PHX2的可生物降解型钾离子及钠离子选择性纳米传感器孵育的HepG2人肝癌细胞在明场，红色通道(λex＝561nm)，明场与红色通道的混合通道下的共聚焦图像(比例尺：10微摩尔)；
图10A和图10B显示出了CCK-8分析法表征不同浓度的基于PHX2的可生物降解型钾离子及钠离子选择性纳米传感器与人肝癌细胞共同孵育后的毒性实验。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
试剂
泊洛沙姆(F127)，聚己内酯(PCL)，O-乙酰柠檬酸三丁酯(ATBC)，4-叔丁基杯[4]芳烃-四乙酸四乙酯(钠离子载体X，NaIX)，2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[N-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯](钾离子载体III，KIII)，四(3,5-双(三氟甲基)钠))-苯基]硼酸酯(NaTFPB)，2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇(Tris)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，四氢呋喃(THF)，2-丁酮，二甲基亚砜，苯，1，4-二氧六环，，二氯甲烷，乙酸乙酯均购自Sigma-Aldrich。细胞计数试剂盒8(CCK-8)从APExBIO(美国)购买。PHX2根据文献报道制备，具体参考杨有军及其同事发表的文章(X.Luo,H.Yang,H.Wang,Z.Ye,Z.Zhou,L.Gu,J.Chen,Y.Xiao,X.Liang,X.Qian,Y.Yang,Highly sensitive Hill-type small-moleculepH probe that recognizes the reversed pH gradient of cancer cells,Anal.Chem.90(2018)5803-5809)。
缓冲溶液
对于pH响应，用1摩尔/升的氢氧化钠溶液或1摩尔/升的盐酸溶液调节由5毫摩尔/升的NaH2PO4、5毫摩尔/升的硼酸和5毫摩尔/升的柠檬酸(背景为0.1摩尔/升的氯化钠)组成的通用pH缓冲液。将纳米颗粒悬浮液与通用pH缓冲溶液混合，以达到2.5毫摩尔/升的缓冲浓度。为了制备钠离子(或钾离子)标准液，将10毫摩尔/升的Tris-HCl(pH＝7.0)用作缓冲溶液，并逐渐添加氯化钠(或氯化钾)储备溶液。
实施例1：PHX2在不同溶剂中的吸收光谱测量
使用U-5100分光光度计(日立，日本)收集紫外线-可见(UV-VIS)吸收光谱。使用Zetasizer ZEN 3600(Malvern Instruments，美国)测量动态光散射(DLS)。在CCK-8试验中在酶标仪(Synery 2，BioTek，USA)上进行吸光度测量。
据报道，PHX2在0.5％DMSO溶液中的pKa值为6.9，具有强烈的红色荧光，已成功用于快速和高对比度的新鲜未处理的癌症活检组织与正常细胞的鉴别。本实验研究了PHX2在不同溶剂中的吸收光谱。如图2所示，UV-VIS的吸收波长显示出对溶剂极性的强烈依赖性。PHX2在550纳米的酒精中具有最高的吸收强度，在510纳米附近有一个小的肩峰。随着溶剂极性的降低，最大吸收峰在550纳米处下降，并且在520纳米附近的峰变得越来越明显。PHX2在四氢呋喃，苯和乙酸乙酯中的吸收光谱均在510和550纳米处显示两个吸收峰(图2中的插图)。
实施例2：基于PHX2的离子选择性纳米粒子的制备
在本发明中，四氢呋喃被用作溶解所有传感组分的溶剂，用于制备纳米传感器。基于PHX2的离子选择性纳米传感器的制备过程以及基于离子交换原理的传感机理如图1所示。其制备过程包括：将包含生色离子载体(PHX2)，离子载体(钠离子载体X或钾离子载体III)，离子交换剂(NaTFPB)，PCL，ATBC和泊洛沙姆的混合物溶解在四氢呋喃中以形成均匀的粉红色溶液。然后，将获得的混合物溶液沉淀到超纯水中，以获得具有所需的基于PHX2的纳米传感器的粉红色悬浮液。
为了制备基于PHX2的H+选择性纳米传感器，将0.3毫克PHX2(39.3毫摩尔/千克)，0.8毫克NaTFPB(64.0毫摩尔/千克)，6毫克ATBC，3毫克PCL和4毫克的泊洛沙姆溶解在1毫升的四氢呋喃中。然后，吸取1毫升体积的均相溶液，并以1000转/分钟的速度在涡旋中注入20毫升超纯水中，以获得粉红色纳米颗粒悬浮液。
为了制备钾离子选择性纳米传感器，总量为1毫克的钾离子载体III(2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基双[N-[5′-硝基(苯并-15-冠-5)-4′-基]氨基甲酸酯]，购于Sigma-Aldrich)(68.5毫摩尔/千克)，0.3毫克的PHX2(36.7毫摩尔/千克)，0.8毫克的NaTFPB(59.8毫摩尔/千克)，6毫克ATBC，3毫克PCL和4毫克泊洛沙姆溶解在1毫升四氢呋喃中。然后，吸取1毫升体积的均相溶液，并以1000转/分钟的速度在涡旋中注入20毫升超纯水中，以获得粉红色纳米颗粒悬浮液。对于制备钠离子选择性纳米传感器，四氢呋喃混合物包含1毫克钠离子载体X(4-叔丁基杯[4]芳烃-四乙酸四乙酯，购于Sigma-Aldrich)(68.5毫摩尔/千克)，0.3毫克PHX2(37.7毫摩尔/千克)和0.4毫克NaTFPB(30.7毫摩尔/千克)，6毫克的ATBC和3毫克的PCL。钠离子选择性纳米光学传感器和基于PHX2的H+选择性纳米光学传感器的制备过程相同。
实施例3：基于PHX2的纳米传感器的表征
为了表征基于PHX2的纳米传感器，本实施例研究了基于PHX2的纳米传感器的共聚焦荧光成像，TEM成像以及纳米粒子的动态尺寸分布。
为了对纳米颗粒进行透射电子显微镜(TEM)成像，将5毫升基于PHX2的钾离子-选择性纳米颗粒悬浮液在LPHA 1-4LD Christ冷冻干燥机(德国)中干燥成粉末。然后，将干燥的粉末溶解在1毫升纯水中。接下来，将几滴溶解的悬浮液分散到带有碳膜的TEM网格上，在空气中干燥，并使用JEM2100透射电子显微镜(日本)进行可视化。为了对细胞内离子选择性纳米传感器进行共聚焦荧光成像，将人肝癌细胞(HepG2)与DMEM在共聚焦培养皿中培养24h。除去培养基后，将细胞在10毫摩尔/升磷酸盐缓冲盐水(PBS)中与100毫摩尔/升钾离子选择性纳米颗粒悬浮液一起于37摄氏度孵育1小时，并用10毫摩尔/升磷酸盐缓冲盐水(PBS)仔细洗涤3次。为了对纳米颗粒进行共聚焦成像，将5毫升纳米颗粒悬浮液和50毫克琼脂糖在水浴中加热直至琼脂糖溶解。然后，将1毫升液体移入共聚焦皿中并在室温下冷却。用100倍物镜在561纳米激发下对钾离子选择性纳米粒子和细胞内钾离子的共聚焦成像。
如图3A所示，基于PHX2的纳米粒子在561纳米激发时显示出具有均匀粒度的红色荧光。此外，由动态光散射(DLS)确定的流体动力学直径约为180纳米，如图3B中所示，小于报道的基于聚乙二醇(PEG)的纳米颗粒(约为260纳米)，结果与谢小江等人先前的报道一致。基于泊洛沙姆的纳米粒子比基于PEG的纳米粒子具有更小，更窄的尺寸分布。计算出的流体力学尺寸的多分散指数(PDI)为0.12，与图3A中的均匀尺寸密切相关。图4A显示了真空冷冻干燥后基于PHX2的纳米颗粒的TEM图像，其统计直径尺寸在5-10纳米之间，如图4B所示。形态的变形是由真空冷冻干燥程序引起的。
实施例4：基于PHX2的纳米传感器的响应表现
为了研究基于PHX2的纳米传感器的pH响应，制备了包含PHX2和阳离子交换剂(TFPB-)以及泊洛沙姆的混合物。从图5可以看出，检测到的纳米传感器的pH响应为3至12。随着pH值的增加，基于PHX2的纳米传感器在553纳米附近的吸光度降低。在强酸性pH条件(pH<4.5)下，PHX2基本被质子化。基于PHX2的纳米传感器的pH响应范围为5至12，比基于生色离子载体I的纳米传感器的pH响应范围宽(pH响应约为3至10)。
利用钠离子和钾离子选择性离子载体分别制备基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器。钠离子和钾离子选择性纳米传感器在不同离子溶液中的UV-VIS吸收光谱如图6A和图6C所示。使用PHX2作为生色离子载体，钠离子-和钾离子-选择性纳米传感器均显示出对增加主离子浓度的吸收响应降低的现象。PHX2掺入的钠离子选择性纳米传感器对钠离子浓度线性响应范围是从10微摩尔/升到100毫摩尔/升，其最低检测限为10微摩尔/升如图6B所示；观察到PHX2包裹的钾离子选择性纳米传感器的线性响应范围为100微摩尔/升至1摩尔/升，其最低检测限为10-4.1摩尔/升如图6D所示。哺乳动物细胞的钠离子浓度约为12毫摩尔/升，而胞质钾离子浓度通常约为139毫摩尔/升。因此，提出的基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器具有细胞内金属离子检测所需的灵敏度。表1比较了可用的新型基于生色离子载体的纳米传感器(或纳米传感器/薄膜)的响应性能。与其他已报道的基于生色离子载体的离子选择性纳米传感器(或纳米传感器/薄膜)相比，基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器显示出相当的动态范围。
表1基于PHX2的可生物降解型纳米传感器与文献已报道的基于生色离子载体的纳米传感器或传感膜的组成成分和响应性能比较
Figure BDA0002785232500000121
aGQDs是石墨烯量子点的缩写。
为了评估基于PHX2的钠离子选择性纳米传感器的响应时间，在553纳米的最大波长下连续监测氯化钠溶液从10微摩尔/升到100毫摩尔/升的吸收强度，及在553纳米波长下连续监测氯化钾溶液从100微摩尔/升到1摩尔/升的吸收强度。如图7A和图7B所示，钠离子选择性纳米传感器和钾离子选择性纳米传感器均在10秒快速响应。
实施例5：基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器的选择性
为了评估基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器的选择性，我们研究了钾离子，镁离子和钙离子对钠离子选择性纳米传感器的干扰，以及钠离子，镁离子钙离子和钙离子对钾离子选择性纳米传感器的干扰。如图8A和8B所示，实线是从方程式(4)获得的理论曲线。点是根据等式(2)计算得到的实验数据点。发现实际测定的数据点较好的遵循了理论曲线。通常，在不存在离子选择性离子载体的情况下，自由离子交换过程由霍夫迈斯特系列控制的(钾离子>钠离子>镁离子>钙离子)。在图8A和图8B中，由于在纳米传感器中掺入了离子载体(钠离子载体X和钾离子载体III)，因此基于PHX2的钠离子和钾离子选择性纳米传感器具有优于干扰离子的选择性。
实施例6：基于PHX2的纳米传感器的细胞内成像
基于PHX2的离子选择性纳米粒子与人肝癌细胞细胞孵育1小时，以研究细胞内成像。如图9中荧光场所示，通过非特异性内吞作用将纳米传感器加载到人肝癌细胞细胞中，并均匀地分布在细胞质中。而且细胞中的离子选择性纳米传感器在561纳米激发时显示出强红色荧光。结果表明基于PCL和ATBC的纳米传感器具有良好的生物相容性。
实施例7：基于PHX2的纳米传感器的细胞毒性
为了进一步研究掺入可生物降解基质(PCL和ATBC)的PHX2型纳米光电极的细胞毒性，使用了商业CCK-8检测法。人肝癌细胞获自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所(中国上海)。对于细胞培养，将人肝癌细胞在装有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％抗生素(青霉素/链霉素)的高Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，GIBCO)中于37摄氏度的潮湿培养箱中培养，温度为5％CO2。
根据手册，通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)对不同浓度的基于PHX2的纳米传感器进行细胞毒性测定。人肝癌细胞(1×104细胞/孔)在96孔板(100微升/孔)中培养，并在37摄氏度的5％CO2中孵育24小时。将不同浓度的纳米颗粒悬浮液添加到每个孔中，并孵育24小时。然后在每个孔中加入10微升CCK-8溶液，1小时后,在酶标仪记录450纳米的吸光度值。对照组使用纯培养基。通过方程式(5)计算细胞的活力。所有的实验至少重复3遍。
Figure BDA0002785232500000141
为了研究掺入PHX2的纳米传感器的细胞毒性，将钾离子选择性纳米传感器通过共孵育方式进入人肝癌细胞中。根据谢小江等人的先前文献，根据NaTFPB的量定义纳米传感器的浓度，本研究中原始钾离子及钠离子纳米颗粒悬浮液的浓度可以定义为45微摩尔/升及23微摩尔/升。将原始纳米颗粒悬浮液稀释10、20、50和100倍，以形成浓度为4.5、2.3、0.9和0.45微摩尔/升的钾离子光极溶液如图10(A)及2.3、1.2、0.45、0.23微摩尔/升的钠离子光极溶液如图10(B)所示。然后，将各种稀释的纳米颗粒悬浮液与人肝癌细胞同时培养24小时。如图10A及图10B所示，即使在最高浓度的条件下，含有该可生物降解的钾离子选择性纳米传感器的细胞在24小时后仍具有超过85％的高细胞活力。结果表明，基于PCL和ATBC的PHX2型纳米传感器的毒性较低。基于PHX2的可生物降解纳米传感器的出色生物相容性表明，它可用于长期和连续监测细胞内离子。

Claims (10)

1.一种基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器的制备方法，其特征在于，以一种新型罗丹明衍生物为带电型生色离子载体，以聚己内酯和O-乙酰柠檬酸三丁酯为聚合物基质，一步沉淀即得，其中，所述新型罗丹明衍生物是一种以对二乙氨基苯酚为官能团且连有两个相互作用的pH敏感位点的希尔型小分子pH探针PHX2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将包含希尔型小分子pH探针PHX2，四（3,5-双（三氟甲基）苯基）硼酸钠，O-乙酰柠檬酸三丁酯，聚己内酯以及泊洛沙姆的混合物溶解于四氢呋喃中，以形成均匀的粉红色溶液；
S2：吸取步骤S1中获得的均相溶液，将其注入搅拌状态下的超纯水的涡旋中，获得一种基于PHX2的纳米传感器的纳米颗粒悬浮液；
S3：将步骤S2获得的纳米颗粒悬浮液在表面上吹净氮气超过30 分钟，以除去THF，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中进一步加入钾离子选择性载体，即可获得一种钾离子选择性纳米传感器。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中进一步加入钠离子选择性载体，即可获得一种钠离子选择性纳米传感器。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：吸取适量的均相溶液，并注入以800~1200转/分钟的速度搅拌的超纯水的涡旋中。
6.一种根据权利要求1~5中任意一项所述的制备方法制备得到的基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的金属离子选择性纳米传感器。
7.根据权利要求6所述的基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器，其特征在于，所述金属离子选择性纳米传感器对pH值的响应范围为5-12。
8.根据权利要求6所述的基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器，其特征在于，当所述金属离子选择性纳米传感器是一种钠离子选择性纳米传感器时可实现对钠离子的检测，对钠离子的响应浓度范围为10微摩尔/升~100 毫摩尔/升；当所述金属离子选择性纳米传感器是一种钾离子选择性纳米传感器时可实现对钾离子的检测，对钾离子的响应浓度范围为100微摩尔/升~1摩尔/升。
9.根据权利要求6所述的基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器，其特征在于，在脂肪酶的存在下，作为聚合物基质的聚己内酯可降解。
10.一种根据权利要求6所述的基于希尔型pH响应罗丹明衍生物的新型金属离子选择性纳米传感器在金属离子检测中的应用，其特征在于，通过添加阳离子选择性载体，所述离子选择性纳米传感器以离子交换原理为基础，可分别实现在溶液中或细胞内对金属离子的检测。
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