CN105116032B - 流控参比电极系统以及应用其的生化分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化学分析领域，公开了一种流控参比电极系统及应用其的生化分析方法。本发明中，参比液注入口与参比通道连通，待测液注入口与待测液通道连通，检测通道与出口连通，参比通道、待测液通道、检测通道交汇；参比通道连接准参比电极，检测通道连接测试电极。进行生化分析时，先注入参比液，待参比液注入结束之后，再注入待测试溶液，监测测试电极的电信号，并根据检测到的电信号分析待测试溶液的组成成分或浓度。通过通道内流动的参比液与准参比电极构成流控参比电极系统，使得本发明的参比电极可集成在检测系统中，具有电解质的添加简单，无需半透膜，易于维护，寿命长等优点。

Description

流控参比电极系统以及应用其的生化分析方法

技术领域

本发明涉及生物化学分析领域，特别涉及流控参比电极系统以及应用其的生化分析方法。

背景技术

过去的几十年里，在摩尔定律的指导下，微电子技术以惊人的速度迅猛发展。在繁荣的微电子产业的基础上出现的计算机技术和互联网技术，加快了信息的加工处理速度与信息的传输速率，大大方便了信息的传递与获取，为人类生活带来了翻天覆地的变化。由于电信号具有易处理易传输易保持的特性，科学家致力于将压力、温度、pH等各种各样的信号转化成电信号以便加工处理，从而实现对各种变化过程的检测和控制。

在电化学的研究中，尤其是各种电化学参数的测量中，三电极体系因其操作方便，所得数据可信度高而备受青睐。三电极由测试电极、参比电极和辅助电极组成，三电极体系包含两个回路，一个回路有测试电极和参比电极组成，用来测试测试电极的电化学反应过程，一般可称为测量回路；另一个回路有测试电极和辅助电极组成，起传输电子形成回路的作用，一般可称为极化回路。在测定测试电极的电化学反应过程中，希望参比电极上通过的电流尽量小，以此减小因电极极化引起的误差。传统意义上的参比电极是指用于测量指示电极电位的电极，一般要求电极电位已知、恒定，重现性好，温度系数小，电流通过时极化电位及机械扰动的影响小等。

在传统的电化学研究中，常使用饱和甘汞电极、银-氯化银电极等作为参比电极使用，如图1所示，1为金属头，2为不溶性盐或金属氧化物，3为阴离子池，4为带有孔洞的密封层。其中孔洞部分包含半透薄膜，对特定的离子具有选择透过性，最常见的为甘汞电极、银-氯化银电极和饱和硫酸铜电极等。当参比电极正常工作时，金属及其不溶性盐或氧化物与阴离子池中的阴离子发生电化学反应，产生电极电位，由于阴离子池保证了反应环境的稳定因而保证了电极电位的稳定。反应产生的阳离子或阴离子通过密封层的孔洞与试液进行交换，从而将参比电极的电极电势传递给试液。但这种电极存在体积大、寿命短、以及电解质添加、半透更换与维护、电极保存均非常复杂的缺陷。

为了检测溶液中特定离子的浓度，出现了一种将场效应管与离子检测结合起来的离子敏感场效应管(Ion-Sensitive Field Effect Transistor，简称“ISFET”)。利用ISFET可以检测试液中的离子或分子，保持外加参比电压信号不变，当试液中特定的离子或分子与ISFET的敏感膜发生反应时，会引起场效应管沟道的能带变化，通过测量ISFET源漏端电信号可以检测试液中是否含有特定的成分。传统的参比电极可以为试液提供稳定的电势，但是由于传统参比电极以特定溶质的水溶液作为缓冲介质，体积较大，为了满足生化检测设备小型化的需要，又发展出传统新型参比电极，通过改变参比电极的结构和组成材料缩小电极的尺寸。

惰性金属具有优良的物理特性和稳定的化学特性，尤其铂金属经常被用作水的电解电极而不会被消耗。但是，研究发现由于惰性电极直接与试液进行接触，因此电极电势会受试液成分的影响。理论上差分型参比系统可以在获得稳定可靠信号的同时缩小器件的尺寸，并有望大规模地集成，实现在一块芯片上完成几千万项测试的目标。但就目前来看，还没有出现一种公认的钝化材料，在保证参比场效应管(REFET)与试液不发生任何反应的同时保证不改变REFET的电学参数，同时REFET钝化层的制备也会大大增加工艺的成本。背部引入栅电极的ISFET基于SOI硅片，背部电极通过电容耦合的方式作用于ISFET，避免了与试液直接接触，因此电极电势不会受试液成分的影响。但是由于SOI硅片的氧化隔离层厚度较大，背部电极施加的电压一般比较大，因此降低了器件的精度和稳定性。实验发现，通过在导电聚合物中填充特定的缓冲物质也可以制备参比电极，但是，其工作机理尚不明确。

通过研究发现，相对于传统的检测手段，利用ISFET进行生化检测具有很多优点，可以简化检测步骤，提高检测速率。而由于ISFET工作在小信号状态，对试液的电势变化十分明显，因此需要参比电极为试液提供稳定的电势，随着ISFET在生化检测领域的应用，简易、稳定的参比电极系统也会变得越来越重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种流控参比电极系统以及应用其的生化分析方法，使得流控参比电极系统可集成，易于维护，并且使用寿命长。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种流控参比电极系统，包含：一个参比液注入口，至少一个待测液注入口，至少一个出口，参比通道，待测液通道和检测通道；

所述参比液注入口与所述参比通道连通；所述待测液注入口与所述待测液通道连通；所述检测通道与所述出口连通；所述参比通道、所述待测液通道、所述检测通道交汇；

所述参比通道连接准参比电极；所述检测通道连接测试电极。

本发明的实施方式还提供了一种应用上述流控参比电极系统的生化分析方法，包含以下步骤：

从所述参比液注入口注入参比参比液；其中，注入所述参比溶液的速度根据所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角及内径值确定；

待参比液注入结束之后，从所述待测液注入口注入待测试溶液；其中，注入待测试溶液的速度根据所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角及内径值、测试电极的响应时间确定；

监测测试电极的电信号，并分析所述待测试溶液的组成成分或浓度。

本发明实施方式相对于现有技术而言，利用流控技术将参比电极系统与测试电极整合在一起，通过通道内流动的参比液与准参比电极构成流控参比电极系统为测试电极提供稳定的参比电势，一方面将参比通道与检测通道整合实现了参比系统与测试电极的集成，另一方面流动的参比液可以避免传统参比电极中因为参比液有效成分的耗尽或参比液中流入了测试液中的污染离子或分子导致参比作用失效，最后一方面当确定了准参比电极后，只需冲入合适的参比液便可实现参比电极系统的参比作用，由于此时参比电极系统使用寿命及稳定性主要由所选准参比电极物理化学特性及参比液种类决定，因此一旦确定了特性稳定的准参比电极及适当的参比液种类，参比电极可以无限制地循环使用下去。综上，使得本发明的参比电极可集成在检测系统中，具有电解质的添加简单，无需半透膜，易于维护，寿命长等优点。

另外，所述参比液通道与所述待测液通道之间的夹角呈预设角度，可以通过调整参比液通道与待测液通道之间的夹角，减小冲洗死角的大小，湍流区域的大小以及强度。

另外，所述参比液通道与所述待测液通道之间的夹角呈90度，其中一个通道呈水平方向，另一个通道呈竖直方向，且竖直方向的通道的内径与水平方向的通道内径呈预设值。

另外，所述参比液通道上设有一开口，所述准参比电极从所述开口处连接到通道内；或者，所述准参比电极从所述参比液注入口连接到所述参比通道内。使得参比电极与参比液充分接触，进一步提供稳定的参比电极电位。

另外，所述测试电极为离子敏感场效应管ISFET或金属敏感电极；所述检测通道上设有一开口，所述ISFET的栅极及所述金属敏感电极安装在所述开口处，方便将参比电极系统与测量模块集成。

另外，所述流控参比电极系统还包含废液通道；所述参比液通道、所述待测液通道、所述检测通道和所述废液通道交汇。使得参比液可以直接从出口处流出，无需转向，从而避免形成冲洗死角。

另外，在注入参比溶液过程中，待参比液将所述参比通道、所述待测液通道交汇处的测试液冲洗干净时，停止注入参比缓冲溶液。

另外，在注入待测试溶液过程中，待测试液将所述待测液通道、所述检测通道中的参比液冲洗干净，监测测试电极的电信号，待所述测试电极的电信号稳定时，停止注入待测试溶液。可以监测测试电极的电信号是否稳定，来决是否继续注入测试溶液，以避免测试溶液注入量过少，不能准确检测测试溶液的成分或浓度；也可以避免测试溶液注入量过多，而造成测试溶液的浪费。

附图说明

图1是现有技术中参比电极的结构示意图；

图2是根据本发明第一实施方式的流控参比电极系统的基本结构示意图；

图3是本发明第一实施方式的具有单个待测液注入口流控参比电极系统的结构示意图；

图4是本发明第一实施方式中不同内径的参比液通道形成冲洗死角的示意图；

图5是本发明第一实施方式中不同内径的待测液通道和参比液通道形成湍流现象的示意图；

图6是本发明第一实施方式中参比液通道与待测液通道非正交的示意图；

图7是本发明第一实施方式中交汇处四通示意图；

图8是本发明第一实施方式中交汇处非正交四通示意图；

图9是本发明第一实施方式中多通道检测系统的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

本发明的第一实施方式涉及一种流控参比电极系统。该参比电极系统包含：一个参比液注入口，至少一个待测液注入口，至少一个出口，参比液通道，待测液通道和检测通道；其中，参比液注入口与参比液通道连通；待测液注入口与待测液通道连通；检测通道与出口连通；参比液通道、待测液通道、检测通道交汇；参比液通道连接准参比电极；检测通道连接测试电极。

如图2所示本实施方式的流控参比电极系统的基本结构示意图，201为准参比电极，202为参比液注入口，204为测试电极，205为待测液注入口。

具体地说，准参比电极201可以为金属，比如铂电极、银电极等，但不只局限于惰性电极，也包括工业中常见的不锈钢电极、铝电极等其他电极。并且，该准参比电极不只是指一维结构的金属线电极，也包括金属片或金属块等，只要满足金属能很好地与液体接触，且可以方便地施加外部电压。准参比电极可以从参比液通道上开设的开口处连接到通道内，也可以从参比液注入口连接到参比液通道内，但本发明并不应以此为限，准参比电极只要接入参比通道，使准参比电极能与参比液通道内的参比液充分接触即可。

参比液从参比液注入口注入，可以与准参比电极形成稳定的电化学电势，且可以将准参比电极上的电势传递到测试电极204测试部分，比如参比液可以为KCl水溶液、NaCl水溶液等金属盐溶液。但参比液并不局限于只有一种溶质的水溶液，允许多种溶质形成的混合溶液；允许参比液为碱性或酸性溶液；且不局限于无机物溶液，也可以包含有机物溶质，可根据实际测试需要选择已知pH或浓度的参比液，或配比得到参比液。

不同酸碱性或浓度的测试溶液从待测液注入口注入，测试溶液中包含所要检测的物质。可以认为除去所要检测的物质，从参比液注入口注入的溶液与从待测液注入口注入的溶液具有相同的成分，但不局限于此。

测试电极为测试的主要模块，比如extended-gate ISFET，其中ISFET的栅极与测试液直接接触，比如为ISFET中的敏感膜，检测通道上设有一开口，ISFET的栅极安装在此开口处。但测试电极并不局限于ISFET，也包括其他测试系统，比如进行酸碱性(pH)检测时，也可利用Pt作为敏感电极。

以下以具有一个参比液注入口、一个待测液注入口、一个出口的参比电极系统说明其工作原理。如图3所示，准参比电极为Pt电极，参比液为KCl溶液，构成了Pt-KCl参比电极。在每次测试之前，从参比液注入口注入KCl溶液，然后从待测液注入口注入测试溶液，在参比液通道和待测液通道的交汇处(图3中标号203所示位置)，形成液界面。值得说明的是，相互接触的两个组成不同或浓度不同的电解质溶液相之间存在的相间电位叫液体接界电位(液界电位)。形成液体接界电位的原因是：由于两溶液相组成或浓度不同，溶质粒子将自发地从浓度高的相向浓度低的相迁移，这就是扩散作用。在扩散过程中，因正、负离子运动速度不同而在两相界面层中形成双电层，产生一定的电位差。所以，按照形成相间电位的原因，也可以把液体接界电位叫做扩散电位。由于注入待测液时会在203所示位置形成湍流现场，会大大降低扩散电位，从而满足了对参比电极电位已知、稳定，重现性好的一般要求。

值得说明的是，参比液自左往下从参比通道进入检测通道时，当参比液通道的内径较大时，会在交汇处形成一个冲洗死角(这个位置比较难冲洗到)，有可能使测试溶液中的物质残留形成污染，从而影响后续的测试结果的准确性。如图4所示是不同内径的参比液通道可能形成冲洗死角的示意图，从图中可以看出，参比通道的内径越大，检测通道的内径越小，越容易形成冲洗死角。

当测试溶液自上而下从待测液通道进入检测通道时，在交汇处可能存在湍流现象，这种湍流现象会减小液界面电势差，当湍流现象大到一定程度时，可以认为液界面电势差为零，从而可以保证测试结果的准确。如图5所示是不同内径的待测液通道和参比液通道可能形成湍流现象的示意图，图中为从上端口输入时各处等压线图，可以看到，对于三种管道尺寸的液体流动，均会在丁字接口处形成湍流现象，对于不同尺寸形成的湍流的分布区域和强度均不同：当左边管道口径大时，湍流区域小且强度弱；当右边管道口径大时，湍流区域大且强度强。

值得一提的是，上述试验都是在参比液通道与待测液通道之间的夹角呈90度时所进行的测试，研究发现，参比液通道与待测液通道之间的夹角会影响冲洗死角的大小，湍流区域的大小以及强度。此外，参比液和测试溶液注入的速度也会影响冲洗死角的大小，湍流区域的大小以及强度。因此，为了获得较为准确的测试结果，可以根据需要，调整参比通道与待测液通道之间的夹角，使其呈预设角度(如图6所示)；或者调整参比液通道与待测液通道的内径大小关系，在湍流区域的大小以及强度满足预设值的同时，减小冲洗死角的大小。比如，参比液通道与待测液通道之间的夹角呈90度，其中一个通道呈水平方向，另一个通道呈竖直方向，并且竖直方向的通道的内径与水平方向的通道内径呈预设的比例关系，在湍流区域的大小以及强度满足预设值的前提下，尽量减小冲洗死角的大小。

除了上述参比液通道、待测液通道与检测通道为三通之外，交汇处还可以是四通(如图7所示)，或者非正交交叉(如图8所示)，从参比液注入口注入的参比液可以从3-1出口处流出，无需转向，从而避免形成冲洗死角。也就是说，流控参比电极系统还可以包含废液通道；参比液通道、待测液通道、检测通道和废液通道交汇形成四通。此外，参比液通道、待测液通道与检测通道中涉及的管道并不局限于平直的管道，为了器件的紧凑性，可以适当弯曲管道，也可以适当增加折点。

此外，本实施方式的流控参比电极系统还可以包含多个待测液通道与相应的检测通道，从而形成多通道检测系统(如图9所示)，可同时检测多种不同成分，不同浓度的测试溶液，从而提高检测效率。

与现有技术相比，本实施方式的流控参比电极系统通过通道内流动的参比液与准参比电极构成流控参比电极系统，使得本发明的参比电极可集成在检测系统中，具有电解质的添加简单，无需更换半透膜，易于维护，寿命长等优点。通过通道内流动的参比液与准参比电极构成流控参比电极系统为测试电极提供稳定的参比电势，一方面将参比通道与检测通道整合实现了参比系统与测试电极的集成，另一方面流动的参比液可以避免传统参比电极中因为参比液有效成分的耗尽或参比液中流入了测试液中的污染离子或分子导致参比作用失效，最后一方面当确定了准参比电极后，只需冲入合适的参比液便可实现参比电极系统的参比作用，由于此时参比电极系统使用寿命及稳定性主要由当所选准参比电极物理化学特性及参比液种类决定，因此一旦确定了稳定的准参比电极及适当的参比液种类，参比电极可以无限制地循环使用下去。综上，使得本发明的参比电极可集成在检测系统中，具有电解质的添加简单，无需更换半透膜，易于维护，寿命长等优点。

本发明第二实施方式涉及一种生化分析方法，该方法应用第一实施方式的流控参比电极系统对测试溶液的组成成分或浓度进行检测，先从参比液注入口注入参比液，待参比液注入结束之后，从待测液注入口注入待测试溶液，监测测试电极的电信号，并根据监测到的电信号分析待测试溶液的组成成分或浓度。

其中，注入参比溶液的速度根据参比液通道与待测液通道之间的夹角确定。由于参比溶液的速度会影响冲洗死角的大小，湍流区域的大小以及强度，因此当参比电极系统设计完成之后，为了使检测结果更准确，需要根据参比液通道与待测液通道之间的夹角，来确定参比缓冲溶液的注入速度，以尽可能减小冲洗死角的大小。比如，当参比液通道与待测液通道之间的夹角呈某一角度时，参比溶液的最大注入速度应大于某一数值，低于这一数值，可能会影响检测结果的准确性，可通过模拟仿真，来确定这一门限速度。当参比液注入速度大时，可以认为可以充分把交汇处污染液冲洗掉，此时主要关注的是测试液之间的污染。此外，注入待测试溶液的速度根据参比液通道与待测液通道之间的夹角、测试电极的响应时间确定。由于测试溶液的注入速度，会影响湍流区域的大小以及强度，从而影响液界面的电位差，影响检测结果的准确性；另外，测试电极的响应时间和测试溶液的注入速度一起决定了测试溶液的注入量，对于某些测试溶液样本量较小时，需要根据测试电极的响应时间来决定测试溶液的注入速度，以确保测试溶液注入后测试电极能及时响应，给出检测结果。

值得说明的是，在注入待测试溶液过程中，应保证检测通道中液体全部为测试液体，可提前计算决定测试液冲入量，也可通过监测测试电极的电信号，待测试电极的电信号稳定时，停止注入待测试溶液。即，可以监测测试电极的电信号是否稳定，来决是否继续注入测试溶液，以避免测试溶液注入量过少，不能准确检测测试溶液的成分或浓度；也可以避免测试溶液注入量过多，而造成测试溶液的浪费。

上面各种方法的步骤划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分，分解为多个步骤，只要包含相同的逻辑关系，都在本专利的保护范围内；对算法中或者流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计，但不改变其算法和流程的核心设计都在该专利的保护范围内。

不难发现，本实施方式为与第一实施方式相对应的方法实施例，本实施方式可与第一实施方式互相配合实施。第一实施方式中提到的相关技术细节在本实施方式中依然有效，为了减少重复，这里不再赘述。相应地，本实施方式中提到的相关技术细节也可应用在第一实施方式中。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种流控参比电极系统，其特征在于，包含：一个参比液注入口，至少一个待测液注入口，至少一个出口，参比通道，待测液通道，检测通道和废液通道；

所述参比液注入口与所述参比通道连通；所述待测液注入口与所述待测液通道连通；所述检测通道与所述出口连通；所述参比通道、所述待测液通道、所述检测通道和所述废液通道交汇形成四通；

所述参比通道连接准参比电极；所述检测通道连接测试电极；

所述准参比电极为金属，其中，参比液从所述参比液注入口注入，与所述准参比电极形成稳定的电化学电势；

所述测试电极为离子敏感场效应管ISFET或金属敏感电极；

所述检测通道上设有一开口，所述ISFET的离子敏感电极或所述金属敏感电极安装在所述开口处。

2.根据权利要求1所述的流控参比电极系统，其特征在于，所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角呈预设角度。

3.根据权利要求2所述的流控参比电极系统，其特征在于，所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角呈90度，其中一个通道呈水平方向，另一个通道呈竖直方向，且竖直方向的通道的内径与水平方向的通道内径呈预设值。

4.根据权利要求1所述的流控参比电极系统，其特征在于，所述参比通道上设有一开口，所述准参比电极从所述开口处连接到通道内。

5.根据权利要求1所述的流控参比电极系统，其特征在于，所述准参比电极从所述参比液注入口连接到所述参比通道内。

6.一种应用如权利要求1至5任一项所述的流控参比电极系统的生化分析方法，其特征在于，包含以下步骤：

从所述参比液注入口注入参比液；其中，注入所述参比溶液的速度根据所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角及内径值确定；

待参比液注入结束之后，从所述待测液注入口注入待测试溶液；其中，注入待测试溶液的速度根据所述参比通道与所述待测液通道之间的夹角及内径值、测试电极的响应时间确定；

监测测试电极的电信号，并分析所述待测试溶液的组成成分或浓度。

7.根据权利要求6所述的生化分析方法，其特征在于，在注入参比溶液过程中，待参比液将所述参比通道、所述待测液通道交汇处的测试液冲洗干净之后，停止注入参比溶液。

8.根据权利要求6所述的生化分析方法，其特征在于，在注入待测试溶液过程中，待测试液将所述待测液通道、所述检测通道中的参比液冲洗干净之后，监测测试电极的电信号，待所述测试电极的电信号稳定时，停止注入待测试溶液。