CN102901822A

CN102901822A - 聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法

Info

Publication number: CN102901822A
Application number: CN2012104059503A
Authority: CN
Inventors: 王赪胤; 徐丹; 张莉; 管俊; 胡效亚
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2013-01-30

Abstract

聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，涉及电化学测试技术领域，将超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内，以此制备了一种无标记免疫传感器。通过电化学交流阻抗技术，阻抗相对变化值与抗原浓度对数成正比的关系，建立了一种免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本发明的检测方法的电化学阻抗信号得到放大，检测抗原灵敏度更高。本方法可用于人血清中h-IgG的无标记检测。

Description

聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及电化学测试技术，以及环境、医学卫生领域中生物分子与细菌的检测技术领域，特别是生物传感器制作技术领域。

背景技术

电化学免疫传感器是一种将电化学检测技术与免疫学技术相结合而发展起来的一种新型免疫传感器，这种传感器是将各种各样的特异性抗原（Antigen，Ag）- 抗体（Antibody，Ab）固定到电极的表面，通过固定化的分子识别物质和分析物之间的免疫反应，把抗原和抗体这种特异性结合的信息转换为可检测的电化学信号(电流或电位等)。根据测量信号的不同，电化学免疫传感器大致可以分为电导型、电流型、电位型、电容型和阻抗型等多种类型的免疫传感器。

电化学免疫传感器具有很多优点：第一，检测快速、实时，如检测一对生物大分子的相互作用时，通常只需要几分钟或者几十分钟，而且在检测过程中，就可以观察到生物分子之间的相互作用的结果；第二，结构、操作简单，不需要昂贵的检测仪器设备，也不需要专门的操作人员，更不需要对生物样品做标记；第三，灵敏度高、检出限低，抗原一抗体的特异性结合决定了免疫传感器的高灵敏度，少受其他干扰；第四，选择性高、特异性好，复杂的样品通常不需要经过分离或者掩蔽处理就能直接测定。这种方法克服了传统酶联免疫分析（ELISA）、柱免疫分析（ICA）、荧光免疫技术（FIAS）、放射性免疫分析（RIA）的抗体标记、辐射危害、背景噪音信号大、繁琐复杂的清洗过程、分析时间长、仪器贵重和需要专业操作人员等缺点。

电化学阻抗谱分析方法（EIS）是用来检测修饰有生物分子的电极界面的生物学反应特性的电化学技术，是一种测量电极界面性质的有效工具。阻抗型免疫传感器的分析原理是基于抗原/抗体之间的特异性结合而降低了电活性探针分子同电极之间的电子转移速率，即增加了电子转移阻抗。通过测量免疫反应前后电子转移阻抗之差（

R_ct）可以实现高灵敏检测的目的。近年来，由于电化学阻抗生物传感器具有制备简便、成本低廉、易于封装、快速实时和小型化监测等特点，所以在微生物检测、医疗诊断、药物残留、工业生产、环境检测、食品分析等领域得到广泛研究。

性能优良的免疫材料固定化方法是研制免疫传感技术的核心，成为改善电化学免疫传感性能的最有效途径之一，也一直是传感工作者探索的主要目标之一，并代表当前免疫分子固定化技术的发展方向。因此开发廉价、灵敏度高、特异性好和寿命长的免疫传感器固定化技术已成为研究和探索的目标。聚合物（高分子材料）是指具有相同化学结构的单分子物质，经聚合反应将化学键连接在一起而形成的大分子物质，它因其合成的灵活性、结构的预设性和性质的多样性等特点，在传感器的发展中具有举足轻重的地位。

目前研制的阻抗传感器的工作电极多数都是单电极体系，与当今先进的生物芯片相比，其阵列化和微型化程度还需要大大提高，对于检测体系的局部特征研究也很少有报道。所以，发展局部阻抗谱，对研究体系的微观过程势在必行。在随着先进科学技术和微细加工技术的不断革新，在提高电极的品质因数和灵敏度的同时，也要提高电极微阵列的密度和通量，因此，电极阵列化和多通道实时检测是未来阻抗型电化学免疫传感器的研究方向。

发明内容

本发明目的是提出一种提高电极微阵列的密度和通量的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法。

本发明技术方案是：将超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸（PAN-co-PAA）先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基（-COOH），将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内。

本发明公开了一种基于聚丙烯腈－共聚－丙烯酸（PAN-co-PAA）的两亲共聚物修饰玻碳电极，在电极表面形成微孔膜，获得了组合超微电极。在微孔内壁，经盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/ N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化微孔膜表面的羧基，以共价键的形式与单克隆抗体结合的方法，固定了抗体，以此制备了一种无标记免疫传感器。通过电化学交流阻抗技术，阻抗相对变化值与抗原浓度对数成正比的关系，建立了一种免疫分析方法。由于使用了功能化的聚合物材料，本发明的检测方法与常规电极的电化学交流阻抗测定技术相比，电化学交流阻抗技术，信号得到功能性的放大，检测抗原灵敏度更高，本方法可用于人血清中h-IgG的无标记检测。

本发明所述盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中，盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合投料摩尔比为1︰1。

本发明所述修饰是：将浓度为10 mg/mL 的聚丙烯腈－共聚－丙烯酸（PAN-co-PAA）的二甲基甲酰胺（DMF）溶液滴涂到玻碳电极上，待二甲基甲酰胺挥发完全之后，用二次水冲洗电极表面。选用聚丙烯腈－共聚－丙烯酸（PAN-co-PAA）的两亲共聚物材料，通过自组装技术，在常规圆盘电极表面自组装，可在电极表面形成纳米级微孔薄膜。

本发明将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内的具体方法是：先将玻碳电极浸入盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液中，活化1h后取出玻碳电极，用二次水洗去表面过量的混合液，再用氮气吹干玻碳电极表面；再将玻碳电极浸入pH为7.0的h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液中，置于4℃下12 h后取出玻碳电极，再将玻碳电极放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37.0℃水浴中30 min，以封闭非特异性位点，接着用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，最后，将制备好的电极浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中，置于4℃条件下保存。

上述盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液的浓度为0.2 mol/L 。

本发明在微孔内壁，经盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）/ N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化微孔膜表面的–COOH，以共价键的形式与单克隆抗体结合的方法，达到固定抗体的目的。

另，本发明所述盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的混合溶液的浓度为0.2 mol/L 。

所述h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液的浓度为1 μg/mL。

附图说明

图1为PAN-co-PAA在电极表面形成的微孔膜的扫描电镜图（荷兰Philips 公司XL–30E 扫描电子显微镜，电子枪的电压设置为20千伏，样品表面喷金）

图2A为以裸玻碳电极制备传感器在K₃ [Fe(CN)₆]中的稳态伏安图。

图2B为以本发明方法制备的传感器在K₃ [Fe(CN)₆]中的稳态伏安图。

图3A为本发明方法制备的传感器检测h-IgG的EIS信号图。

图3B为本发明方法制备的传感器检测h-IgG的线性关系图。

具体实施方式

一、传感器的制备过程

1、前处理：玻碳电极（直径 3 mm）首先是用细砂纸抛光处理，然后用超细的Al₂O₃粉末为抛光粒子，采用丝绸再在玻碳电极表面进行抛光，接着用二次水冲洗。最后，再采用等体积的二次水、乙醇和硝酸的混合溶液进行超声处理。经过预处理后，将玻碳电极在0.5 mol/L H₂SO₄溶液中，在-0.5到+1.4 V范围内进行循环伏安扫描至获得稳定的伏安曲线为止。

2、修饰：室温下，在空气湿度>60 %的条件下，用微量进样器移取10 μL浓度为10 mg/mL聚丙烯腈－共聚－丙烯酸（PAN-co-PAA）的二甲基甲酰胺（DMF）溶液滴涂到事先已经处理好的玻碳电极上。等到DMF挥发完全之后，用二次水冲洗电极表面，此时微孔薄膜在电极表面上自组装形成。

通过扫描电镜技术、电化学表征技术证明该电极具有超微组合电极的特点，如图1所示，所有微孔均为纳米级。

3、固定：先将上述电极浸入浓度为0.2 mol/L的EDC与NHS（摩尔比1：1）组成的混合溶液中，活化1h，然后取出电极，用二次水洗去表面过量的混合液，再用氮气吹干电极表面待用。

再将电极浸入0.2 mL 浓度为1 μg/mL的h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）中，置于4℃下12 h。然后将电极取出后放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37.0℃水浴中30 min，以封闭非特异性位点，接着用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白。将制备好的电极浸入至磷酸缓冲溶液（pH=7.0）中，置于4℃保存备用。

二、传感器的电化学表征

以裸玻碳电极和本发明制备传感器（抗体结合前）分别为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂丝电极为对电极组成的三电极体系在CHI660A电化学工作站上进行电化学测试与表征。

图2A和图2B分别为裸玻碳电极和本发明制备传感器在6×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆ 和1 mol/L KNO₃溶液中的循环伏安图。

如图2A 所示，50 mV/s扫描速度时裸玻碳电极的循环伏安图为典型的 “峰形” 的伏安曲线，表明此时K₃Fe(CN)₆发生的氧化还原反应是受线性扩散控制的。

如图2B所示，当扫描速度为5 mV/s时，纳米孔修饰玻碳电极的伏安曲线变为典型的超微电极的稳态 “S” 形曲线，表明Fe(CN)₆ ^3－/Fe(CN)₆ ^4－在微孔内发生的氧化还原反应传质速率很快。微孔纳米孔修饰玻碳电极具有超微电极的特征。当扫描速度达到为50 mV/s时，循环伏安图又转为“峰形” 的伏安曲线。

三、h-IgG的电化学交流阻抗测定：

免疫传感器阻抗的相对变化值的测定在含有5 mmol/L的[Fe(CN)₆]^3-/4-0.1 mol/L的PBS和KNO₃底液中，采用电化学交流阻抗法进行测定。电化学交流阻抗实验在Autolab电化学工作站（Ecochemie, Netherlands）上进行。以制备电极为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极电化学交流阻抗测定的频率范围是10^-1 Hz到10⁶Hz，使用开路电位（OCP），正弦波电位的振幅为10 mV。

图3A中，a ~ e对应的h-IgG浓度分别为0.1，1，5，50，500 ng/mL。

从图3A的a ~ e曲线可以看出：随着h-IgG浓度的增加，Nyquist图半圆的直径逐渐变大，

逐渐增加。这是由于当h-IgG与抗体结合时，随着h-IgG浓度的增加，无活性电子和传质封闭层随之增加，极大的阻碍了电子传递。

用阻抗的相对变化值对h-IgG抗原浓度对数做图，可以得出线性范围为10^-1到5.0

10²ng/mL ，如图3B所示。线性回归方程为

= 697.09 + 364.3lg[h-IgG] (ng/mL)，线性相关系数为0.997，检出限为0.05 ng/mL（S/N=3）。高浓度的h-IgG的检测可以通过用pH=7.4的PBS稀释后再检测。

提取三名人的新鲜血清标本，留取血清1 ~ 2 mL。取10 μL血清用PBS缓冲溶液稀释，根据上述测试方法测定IgG含量，同时加入标样作加标回收率实验，实验结果见表1。实验结果表明：实际人血清样本中h-IgG测量值分别为10. 0，11. 5和13. 0 g/L，加标回收率分别为91 %、95 %和103 %，相对标准偏差在3.6 ~ 5.5 %之内（n=3）。测得人血清中免疫球蛋白IgG平均含量为11. 5 g/L，均在正常人血清人h-IgG含量(8 ~ 14 g/L)范围之内，回收率实验结果令人满意。

表1：人血清样本中h-IgG含量及其回收率的测定（测定次数n=3）

四、电极测试信号的放大验证：

常规方法固定IgG抗体电极的制备：将同等玻碳电极GCE电极表面抛光，置于含0.5 mmol/L硫堇单体（TH）、0.1 mol/L KCl和4 × 10^-3mol/L亚甲基蓝（MB）的磷酸盐缓冲液( PBS, pH=6. 0)中,于+ 1. 5 V的恒电位条件下循环伏安扫描10min至获得稳定的伏安曲线；于- 0.45 ~ + 0.15 V之间以扫速50 mV / s的条件下循环扫描25圈，将硫堇单体聚合到玻碳电极上；将修饰电极浸入纳米金（GNP）溶液中，室温下置于暗处4 h，取出用二次水冲洗干净，抗体的固定以及抗原的检测方法同上。该法的检测下限是1.0 ng/mL。

当检测浓度1.0 10²ng/mL h-IgG抗原时，本发明的修饰电极与常规修饰电极阻抗比较，常规修饰电极的Rct = 1375 ohm，采用本发明的传感器在相同条件下来检测该浓度的的

Rct’ = 44230 ohm，

Rct’的值约是

Rct的32倍。由此可以得出，常规方法固定抗体的传感器与本发明的传感器两种方法相比，后者可以将免疫反应的信号放大约32倍，检测下限低20倍。

因此得出，本发明用于多发性骨髓瘤人体血清中h-IgG的检测技术，操作简便，仪器设备简单，成本低廉，测定快速，可以更加灵敏的检测h-IgG，能够为病症诊断和疗效判断提供依据。

Claims

1.聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于将超微孔膜材料聚丙烯腈－共聚－丙烯酸先修饰到玻碳电极表面，再采用盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液活化膜微孔内壁上的羧基，将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内。

2.根据权利要求书1所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合投料摩尔比为1︰1。

3.根据权利要求书1所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述玻碳电极在修饰前经抛光处理，清洗后，再采用由二次水、乙醇和硝酸的混合溶液超声处理，然后将玻碳电极在0.5 mol/L 的H₂SO₄水溶液中，在-0.5到+1.4 V范围内进行循环伏安扫描直至获得稳定的伏安曲线为止。

4.根据权利要求书3所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述二次水、乙醇和硝酸的混合溶液中二次水、乙醇和硝酸的投料体积比为1︰1︰1。

5.根据权利要求书1所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述修饰是：将浓度为10 mg/mL 的聚丙烯腈－共聚－丙烯酸的二甲基甲酰胺溶液滴涂到玻碳电极上，待二甲基甲酰胺挥发完全之后，用二次水冲洗电极表面。

6.根据权利要求书2所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于将单克隆抗体以共价结合形式固定到膜微孔内的方法是：先将玻碳电极浸入盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，活化1h后取出玻碳电极，用二次水洗去表面过量的混合液，再用氮气吹干玻碳电极表面；再将玻碳电极浸入pH为7.0的h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液中，置于4℃下12 h后取出玻碳电极，再将玻碳电极放入20 mg /mL的牛血清蛋白中，置于37.0℃水浴中30 min，然后用二次水冲洗除去表面多余的牛血清蛋白，最后，将制备好的电极浸入pH为7.0的磷酸缓冲溶液中，置于4℃条件下保存。

7.根据权利要求书6所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的浓度为0.2 mol/L 。

8.根据权利要求书6或7所述的聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法，其特征在于所述h-IgG单克隆抗体的磷酸缓冲溶液的浓度为1 μg/mL。