WO2011151964A1 - 抗原を検出する方法 - Google Patents

抗原を検出する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2011151964A1
WO2011151964A1 PCT/JP2011/001989 JP2011001989W WO2011151964A1 WO 2011151964 A1 WO2011151964 A1 WO 2011151964A1 JP 2011001989 W JP2011001989 W JP 2011001989W WO 2011151964 A1 WO2011151964 A1 WO 2011151964A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
buffer
carrier
antigen
buffer solution
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/001989
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和晃 西尾
望 松川
重雄 吉井
Original Assignee
パナソニック株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by パナソニック株式会社 filed Critical パナソニック株式会社
Priority to JP2011529392A priority Critical patent/JP4872033B1/ja
Priority to US13/296,879 priority patent/US8309345B2/en
Publication of WO2011151964A1 publication Critical patent/WO2011151964A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an antigen using an antibody and an enzyme.
  • Patent Document 1 discloses an enzyme immunoassay method.
  • FIG. 2 shows the sandwich method included in the enzyme immunoassay.
  • the carrier 107 has an antibody 108 on its surface.
  • a sample containing the antigen 109 is supplied to the surface of the carrier 107, resulting in the antigen 109 binding specifically to the antibody 108. Thereafter, the sample containing unreacted antigen 109 is removed by washing.
  • the labeled antibody 111 having the enzyme 110 for detecting the antigen 109 is supplied to the surface of the carrier 107 to form a complex composed of the antibody 108, the antigen 109, and the labeled antibody 111. Thereafter, unreacted labeled antibody is removed by washing.
  • the substrate 112 of the enzyme 110 is supplied to the surface of the carrier 107.
  • Enzyme 110 reacts metabolically with substrate 112 to form product 113.
  • the luminescence or absorbance of the product 113 is measured to detect the antigen 109 indirectly.
  • the sandwich method requires not only the antibody 108 but also the labeled antibody 111 having the enzyme 110.
  • Labeled antibody 111 needs to be supplied after a specific reaction between antibody 108 and antigen 109. Furthermore, unreacted labeled antibody 111 needs to be removed.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting an antigen without using a labeled antibody.
  • a method for detecting an antigen comprising the following steps (A) to (C): Contacting the carrier with a first buffer expected to contain the antigen (A), Here, an antibody and multi-copper oxidase CueO are immobilized on the carrier, The carrier is electrically conductive; The antibody reacts specifically with the antigen; A step of measuring current by a potentiostat method using the carrier and a second buffer (B), Here, the second buffer solution contains a substrate of the multi-copper oxidase CueO, The second buffer solution has an ionic strength that falls within the range of 0.3 mM to 1.0 mM, and if the following inequality is satisfied, the antigen is determined to be present in the first buffer solution.
  • the blank value is a current measured by a potentiostat method in which the antigen is not used but the second buffer is used.
  • the carrier is composed of carbon.
  • the second buffer solution has a pH of 5.0 or more and 6.0 or less.
  • the second buffer solution contains oxygen and protons.
  • the first buffer is Tris-HCl buffer, Tris buffered saline, or phosphate buffered saline.
  • the second buffer is an acetate buffer, a citrate buffer, a succinate buffer, a phthalate buffer, or a 2-morpholinoethane sulfonate buffer.
  • the second buffer solution is an acetate buffer solution, a citrate buffer solution, a succinate buffer solution, a phthalate buffer solution, or a 2-morpholinoethane sulfonate buffer solution.
  • the present invention provides a method for detecting an antigen without using a labeled antibody.
  • FIG. 1 is a diagram showing a reaction flow of an antigen detection method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a reaction flow of a conventional enzyme immunoassay (sandwich method).
  • FIG. 3 is a diagram showing a basic configuration of an electrochemical measurement device used in the antigen detection method according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing a basic configuration of a working electrode used in the antigen detection method according to the present invention.
  • 5 is a diagram showing an example of electrochemical measurement in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of electrochemical measurement in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a reaction flow of an antigen detection method according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a reaction flow of a conventional enzyme immunoassay (sandwich method).
  • FIG. 3 is a diagram showing a basic configuration of an electrochemical measurement device used in the antigen detection method according to the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing
  • FIG. 1 shows a reaction flow of the antigen detection method according to the present invention.
  • step (A) the carrier 101 is brought into contact with a first buffer solution that is expected to contain the antigen 104.
  • antigens 104 detected by the present invention are viruses, bacteria, fungi, proteins, or oligonucleotides. Viruses, bacteria, or fungi are preferred.
  • the first buffer examples include Tris-HCl buffer, Tris buffered saline, or phosphate buffered saline.
  • the first buffer has a pH near neutral.
  • the carrier 101 has a multi-copper oxidase 102 and an antibody 103 on the surface.
  • the carrier 101 forms a part of the working electrode in the step (B), it is required to be electrically conductive.
  • a suitable example of the material of the carrier 101 is carbon.
  • carbon carbon nanotubes, carbon black, ketjen black, glassy carbon, and highly oriented crystalline graphite (HOPG, highly oriented pyrolytic graphite) are preferably used. Carbon nanotubes are more preferred.
  • the antibody 103 and the multi-copper oxidase 102 are immobilized on the surface of the carrier 101.
  • the antibody 103 specifically binds to the antigen 104.
  • Antibody 103 can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Fab fragment antibodies and F (ab ') 2 fragment antibodies from which the Fc region has been artificially removed can also be used.
  • the multi-copper oxidase 102 is a kind of enzyme that catalyzes a redox reaction.
  • the multi-copper oxidase 102 may be expressed as “CueO”.
  • the multi-copper oxidase 102 catalyzes a reaction in which water is generated as a product 106 by reducing the substrate 105 made of molecular oxygen by four electrons.
  • the active center of the multi-copper oxidase 102 is composed of four copper ions having different properties called type 1, type 2, type 3a, and type 3b.
  • a preferred multi-copper oxidase 102 is laccase. More preferably, CueO derived from E. coli is used.
  • Examples of the method for immobilizing the antibody 103 and the multi-copper oxidase 102 to the carrier 101 include the following method (a) and method (b).
  • the specific method (b) is as follows.
  • a carboxyl group is introduced into the carrier 101.
  • the carboxyl group is treated with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide.
  • antibody 103 and multi-copper oxidase 102 are added.
  • the amino group of the lysine residue on the surface of the antibody 103 reacts with the carboxyl group to form an amide bond.
  • the amino group of the lysine residue that the surface of the multi-copper oxidase 102 has reacts with the carboxyl group to form an amide bond.
  • Examples of the method for bringing the carrier 101 into contact with the first buffer solution include the following two methods: A method of coating the surface of the carrier 101 with the first buffer solution, and a method of immersing the carrier 101 in the first buffer solution.
  • step (B) the current is measured by the potentiostat method using the carrier 101 and the second buffer solution.
  • the second buffer solution contains the substrate 105 of the multi-copper oxidase CueO.
  • Examples of the substrate 105 are oxygen and proton. These are contained in common buffers that are commercially available.
  • the second buffer solution has a pH of 5.0 or more and 6.0 or less.
  • Sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, and trimethylammonium are used to adjust the pH.
  • the second buffer are acetate buffer, citrate buffer, succinate buffer, phthalate buffer, and MES (2-morpholinoethanesulfonic acid) buffer.
  • Acetate buffer is preferred.
  • the second buffer solution is required to have an ionic strength that falls within the range of 0.3 mM to 1.0 mM. If it is less than 0.3 mM, it is difficult to ensure the stability of pH. If it exceeds 1.0 mM, it will be difficult to detect the antibody contained in the first buffer, as will be apparent from the examples described later.
  • FIG. 3 shows an electrochemical measurement apparatus used for the potentiostat method.
  • the electrochemical measurement apparatus includes a measuring instrument 114 composed of a potentiostat, a working electrode 115, a reference electrode 116, and a counter electrode 117.
  • An example of the reference electrode 116 is a saturated KCl silver / silver chloride electrode.
  • An example of the counter electrode 117 is a Pt electrode.
  • the working electrode 115 includes a carrier 101.
  • FIG. 5 shows an example of the working electrode 115.
  • the working electrode 115 includes a carrier 101 attached to the tip of the glassy carbon electrode 121.
  • the tip of the glassy carbon electrode 121 further includes a net 122 and a ring 123.
  • the carrier 101 is fixed to the tip of the glassy carbon electrode 121 by the net 122 and the ring 123.
  • the material of the net 122 is nylon.
  • these three electrodes 115 to 117 connected to the measuring instrument 114 are immersed in the second buffer solution 119 stored in the reaction tank 118. Thereafter, the current is measured by the potentiostat method.
  • sweeping can be performed between a start potential of 0.6V and an end potential of 0V.
  • the reduction current generated by the enzyme activity of the multi-copper oxidase 102 increases as the potential approaches 0V.
  • the current hardly changes during the period from the start potential of 0.6 V to the potential of 0.45 V. This is because the reaction of the multi-copper oxidase 102 hardly progresses during this period.
  • the second buffer solution 119 includes the working electrode 115, the reference electrode 116, and the counter electrode 117 as shown in FIG. Can be coated.
  • Three electrodes 115 to 117 shown in FIG. 4 are arranged on the surface of the substrate 120.
  • step (C) if the following inequality is satisfied, it is determined that the first buffer contains an antigen.
  • Current measured in step (B) ⁇ 1.5 ⁇ (blank value)
  • the blank value is a current measured by the potentiostat method in which no antigen is used but the second buffer is used. By this determination, the antigen is detected.
  • the blank value can be calculated in parallel with the step (C). Alternatively, the blank value can be calculated in advance.
  • Example 1 (Preparation of antibody) A solution containing an anti-Bovine Serum Albumin antibody (anti-BSA antibody: IgG fraction of anti-Albumin (Bovine Serum) [Rabbit]; manufactured by Rockland) was used.
  • the antibody solvent was 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer (Tris-hydrochloric acid buffer) (pH 7) using an ultrafiltration unit (Amicon Ultra-4, MWCO: 30,000; manufactured by Millipore). .5).
  • the antibody concentration was measured based on the Bradford method (Protein Assay Kit II; manufactured by Bio-Rad) using Bovine Serum Albumin (BSA) as a standard.
  • the antibody had a concentration of 20 mg / mL.
  • the obtained anti-BSA antibody was stored at 4 ° C.
  • the gene for CueO was amplified by a PCR method using E. coli genomic DNA (LA PCR genomic DNA Set; manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a base sequence encoding a histidine tag was added to the oligo DNA primer, and a histidine tag was added to the carboxyl terminal side of the amino acid sequence of CueO.
  • the amplified DNA fragment was cloned into an expression vector (pRSFDuet-1 Novagen) (In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kits: Clontech).
  • Escherichia coli (BL21 (DE3); manufactured by Stratagene) was transformed with the expression vector.
  • the transformed E. coli was cultured at 30 ° C. for 16 hours on LB medium containing 1 mM copper sulfate.
  • the periplasmic fraction was extracted from the collected cells, and CueO was extracted from the extract using a histidine tag purification column (TALON CellThru Resin; manufactured by Clontech) and an anion exchange column (HiTrap Q HP 5 mL; manufactured by GE Healthcare). Purified.
  • the solvent of the purified solution containing CueO was replaced with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Thereafter, the CueO solution was concentrated using an ultrafiltration unit (Amicon Ultra-4, MWCO: 30,000; manufactured by Millipore). The concentrated CueO solution had a concentration of 4 mg / mL. The concentration of CueO was measured by the Bradford method using BSA as a standard. The resulting CueO solution was stored at 4 ° C.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • SWCNT carbon nanotubes
  • RMS ultrasonic homogenizer
  • a carbon felt having a diameter of 6 mm was cut out from a carbon felt having a thickness of 2 mm (manufactured by Nippon Carbon Co., Ltd.).
  • the carbon felt was set in a plastic column (Biospin empty column; manufactured by Bio-Rad).
  • acetate buffer solutions having concentrations of 0.5 mM, 5 mM, and 10 mM were prepared.
  • the enzyme activity of CueO was measured by electrochemical measurement by the potentiostat method.
  • the electrochemical measurement apparatus shown in FIG. 3 was used.
  • the measuring device 114 was a potentiostat (ALS760C (manufactured by BAS)).
  • the reference electrode 116 was a saturated KCl silver / silver chloride electrode (RE-1C; manufactured by BAS).
  • the counter electrode 117 was a Pt electrode (length: 23 cm, manufactured by BAS).
  • a carrier 101 having an antibody 103 and a multi-copper oxidase 102 is a glassy carbon electrode 121 (electrode size (ID): 3 mm, manufactured by BAS) by a nylon net 122 and a ring 123 The working electrode 115 was obtained.
  • the current value was measured by sweeping from a start potential of 0.6 V to an end potential of 0 V at a sweep rate of 20 mV / sec by a potentiostat method at 25 ° C.
  • FIG. 6 (2) shows the measurement results.
  • a carrier on which CueO and an antibody were immobilized was set at one end of a plastic column.
  • the column was flushed with 1 mL of Tris-HCl buffer (pH 7.5, 10 mM).
  • the carrier was taken out from the column. As shown in FIG. 5, the carrier 101 was attached to the tip of the glassy carbon electrode 121 using a nylon net 122 and a ring 123 to obtain a working electrode 115.
  • the working electrode 115 was immersed in a cell containing 10 mL of acetate buffer (pH 5.5, 1.0 mM). A sweep was performed from a starting potential of 0.6 V to an ending potential of 0 V at a sweep rate of 20 mV / sec by a potentiostat method at 25 ° C., and the current value was measured. (3) in FIG. 6 shows the measurement results.
  • the amplification factor was determined in the same manner as described above.
  • Table 1 shows blank values, measured values, and amplification factors when the sweep potential is 0.0V, 0.1V, 0.2V, and 0.3V.
  • the person skilled in the art knows that the first buffer solution contains an antigen. Will be understood based on Table 1. Thus, the antigen is detected in the present invention. Furthermore, those skilled in the art will readily understand that labeled antibody 111 is not used in the present invention.
  • the present invention can be used for a biosensor.
  • the present invention is particularly useful for rapid immunodiagnosis by multiplex assay.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　ラベル化抗体が不要の抗原の検出方法を提供する。抗原を含む第１の緩衝液に、抗体及びマルチ銅酸化酵素CueO が固定化された担体を接触させ、前記担体及び第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定し、測定された電流が１．５×（ブランク値）以上であるとき、前記抗原が存在することが決定される。前記第２の緩衝液は、前記CueO の基質を含有し、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有する。

Description

抗原を検出する方法
　本発明は、抗体および酵素を利用して抗原を検出する方法に関する。
　特許文献１は、酵素免疫測定法を開示している。図２は当該酵素免疫測定法に含まれるサンドイッチ法を示す。
　図２に示されるように、担体１０７は、抗体１０８を表面に有する。抗原１０９を含有する試料が担体１０７の表面に供給され、抗原１０９が抗体１０８に特異的に結合することがもたらされる。その後、未反応の抗原１０９を含有する試料が洗浄により除去される。
　次に、抗原１０９を検出する酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１が、担体１０７の表面に供給され、抗体１０８、抗原１０９、およびラベル化抗体１１１から構成される複合体を形成する。その後、未反応のラベル化抗体が洗浄により除去される。
　最後に、酵素１１０の基質１１２が担体１０７の表面に供給される。酵素１１０は基質１１２と代謝的に反応して、生成物１１３を形成する。生成物１１３の発光または吸光度が測定され、抗原１０９を間接的に検出する。
特許第４２７１０８６号公報
　しかし、サンドイッチ法は、抗体１０８だけでなく、酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１をも必要とする。ラベル化抗体１１１は、抗体１０８と抗原１０９との間の特異的反応の後に供給されることを必要とする。さらに、未反応のラベル化抗体１１１は除去されることを必要とする。
　本発明の目的は、ラベル化抗体を用いずに抗原を検出する方法を提供することである。
（１）以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を具備する、抗原を検出する方法：
　前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に担体を接触させる工程（Ａ）、
　　ここで、前記担体には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、
　　当該担体は導電性であり、
　　前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
　前記担体および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定する工程（Ｂ）、
　　ここで、前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
　　前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、および
　以下の不等式が充足されれば前記第１の緩衝液において前記抗原が存在することが決定される工程（Ｃ）
　　工程（Ｂ）において測定された電流　＞＝　１．５×（ブランク値）
　　ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。
（２）前記担体はカーボンから構成される、（１）の方法。
（３）前記第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有する、（１）の方法。
（４）前記第２の緩衝液は酸素およびプロトンを含有する、（１）の方法。
（５）前記第１の緩衝液は、トリス－塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である、（１）の方法。
（６）前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、（１）の方法。
（７）前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、（５）の方法。
　本発明は、ラベル化抗体を用いずに抗原を検出する方法を提供する。
図１は、本発明による抗原検出方法の反応フローを示す図である。 図２は、従来の酵素免疫測定法（サンドイッチ法）の反応フローを示す図である。 図３は、本発明による抗原検出方法において用いられる電気化学測定装置の基本構成を示す図である。 図４は、本発明による抗原検出方法において用いられる作用電極の基本構成を示す図である。 図５は、実施例１における電気化学測定の例を示す図である。 図６は、実施例１における電気化学測定の結果を示すグラフである。
　以下、図面を参照しながら、本発明の実施の形態が説明される。
　図１は、本発明による抗原検出方法の反応フローを示す。
　（工程Ａ）
　工程（Ａ）では、抗原１０４を含有すると予想される第１の緩衝液に担体１０１が接触される。
　本発明により検出される抗原１０４の例は、ウイルス、細菌、真菌、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである。ウイルス、細菌、または真菌が好ましい。
　第１の緩衝液の例は、トリス－塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である。好ましくは、当該第１の緩衝液は、中性付近のｐＨを有する。
　担体１０１は、マルチ銅酸化酵素１０２および抗体１０３を表面に具備する。
　担体１０１は、工程（Ｂ）において作用電極の一部を構成するため、電気的に導電性であることが必要とされる。担体１０１の材料の好適な例は、カーボンである。当該カーボンとして、カーボンナノチューブ、カーボンブラック、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、および高配向性結晶黒鉛（ＨＯＰＧ、高配向熱分解黒鉛）が好ましく用いられる。カーボンナノチューブがより好ましい。
　図１に示されるように、抗体１０３およびマルチ銅酸化酵素１０２が、担体１０１の表面に固定されている。抗体１０３は、抗原１０４と特異的に結合する。
　抗体１０３は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。Ｆｃ領域が人為的に除去されたＦａｂフラグメント抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体も用いられ得る。
　マルチ銅酸化酵素１０２は、酸化還元反応を触媒する酵素の一種である。本明細書においては、マルチ銅酸化酵素１０２は、「ＣｕｅＯ」と表記され得る。マルチ銅酸化酵素１０２は、分子状酸素からなる基質１０５を４電子還元し、生成物１０６として水が生成される反応を触媒する。マルチ銅酸化酵素１０２の活性中心は、タイプ１、タイプ２、タイプ３ａ、およびタイプ３ｂと呼ばれる性質の異なる４個の銅イオンから構成される。
　好ましいマルチ銅酸化酵素１０２は、ラッカーゼである。大腸菌由来のＣｕｅＯが用いられることがより好ましい。
　抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２を担体１０１に固定する方法としては、以下の方法（ａ）および方法（ｂ）が挙げられる。
　方法（ａ）：担体１０１と、抗体１０３またはマルチ銅酸化酵素１０２との間の疎水性相互作用による非特異的吸着を利用する方法。
　方法（ｂ）：担体１０１を、抗体１０３またはマルチ銅酸化酵素１０２に化学的に結合させる方法。
　具体的な（ｂ）の方法は、以下の通りである。
　担体１０１にカルボキシル基が導入される。そのカルボキシル基が１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドを用いて処理される。その後、抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２が添加される。抗体１０３の表面が有するリジン残基のアミノ基が、カルボキシル基と反応し、アミド結合を形成する。同様に、マルチ銅酸化酵素１０２の表面が有するリジン残基のアミノ基も、カルボキシル基と反応し、アミド結合を形成する。
　第１の緩衝液に担体１０１を接触させる方法としては、以下の２つの方法が挙げられる：
　第１の緩衝液で、担体１０１の表面を被覆する方法、および
　第１の緩衝液に、担体１０１を浸漬する方法。
　当該接触は、抗体１０３と抗原１０４との間の特異的結合をもたらす。その後、洗浄により、未反応の抗原１０４を含有する第１の緩衝液は、担体１０１の表面から除去される。
　本発明では、抗原１０４と抗体１０３との特異的結合が、マルチ銅酸化酵素１０２の酵素活性の上昇をもたらす。
　（工程（Ｂ））
　工程（Ｂ）では、担体１０１および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流が測定される。
　第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの基質１０５を含有する。基質１０５の例は、酸素およびプロトンである。これらは、市販されている一般的な緩衝液に含まれている。
　第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有することが好ましい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、およびトリメチルアンモニウムが用いられて、ｐＨを調整する。第２の緩衝液の例は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、およびＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液である。酢酸緩衝液が好ましい。
　前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有することを必要とされる。０．３ｍＭ未満では、ｐＨの安定性を確保することが困難である。１．０ｍＭを超えると、後述する実施例からも明らかなように、第１の緩衝液に含有される抗体を検出することが困難となる。
　図３は、ポテンシオスタット法のために用いられる電気化学測定装置を示す。当該電気化学測定装置は、ポテンシオスタットから構成される測定器１１４、作用電極１１５、参照電極１１６、およびカウンター電極１１７を具備する。
　参照電極１１６の例は、飽和ＫＣｌ銀／塩化銀電極である。カウンター電極１１７の例は、Ｐｔ電極である。作用電極１１５は、担体１０１を具備する。
　図５は、作用電極１１５の一例を示す。作用電極１１５は、グラッシーカーボン電極１２１の先端に取り付けられた担体１０１を具備する。グラッシーカーボン電極１２１の先端は、ネット１２２およびリング１２３をさらに具備する。ネット１２２およびリング１２３によって、担体１０１がグラッシーカーボン電極１２１の先端に固定される。好ましくは、ネット１２２の材料はナイロンである。
　図３に示されるように、測定器１１４に接続されたこれら３つの電極１１５～１１７は、反応槽１１８の内部に貯められた第２の緩衝液１１９に浸漬される。その後、ポテンシオスタット法により電流が測定される。ポテンシオスタット法では、開始電位０．６Ｖおよび終了電位０Ｖの間で掃引が行われ得る。マルチ銅酸化酵素１０２の酵素活性により生じる還元電流は、電位が０Ｖに近づくに従い増大する。後述する実施例１から明らかなように、開始電位０．６Ｖから電位０．４５Ｖまでの期間では、電流はほとんど変化しない。これは、当該期間においては、マルチ銅酸化酵素１０２の反応がほとんど進行しないためである。
　３つの電極１１５～１１７が第２の緩衝液１１９に浸漬されることに代えて、図４に示されるように、第２の緩衝液１１９が、作用電極１１５、参照電極１１６、およびカウンター電極１１７を被覆し得る。図４に示される３つの電極１１５～１１７は、基板１２０の表面に配置されている。
　（工程（Ｃ））
　工程（Ｃ）では、以下の不等式が充足されれば第１の緩衝液が抗原を含有することが決定される。
　　工程（Ｂ）において測定された電流≧１．５×（ブランク値）
　　ここで、ブランク値は、抗原は用いられないが、第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。当該決定により、抗原が検出される。
　ブランク値は、工程（Ｃ）と平行して算出され得る。または、ブランク値は、予め算出され得る。
　以下の実施例１を用いて、本発明はより詳細に説明される。
　（実施例１）
　（抗体の調製）
　抗Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ抗体（抗ＢＳＡ抗体：ＩｇＧ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－Ａｌｂｕｍｉｎ　（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）　［Ｒａｂｂｉｔ］　；Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を含有する溶液が用いられた。当該抗体の溶媒が、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４、ＭＷＣＯ：　３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて１０ｍＭ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン－塩酸緩衝液（トリス－塩酸緩衝液）（ｐＨ７．５）に置換された。
　溶媒を置換した後、抗体の濃度は、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（プロテインアッセイキットＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に基づいて測定された。抗体は２０ｍｇ／ｍＬの濃度を有した。得られた抗ＢＳＡ抗体は４℃で保管された。
　（ＣｕｅＯ溶液の調製）
　大腸菌由来（Ｋ－１２株）のＣｕｅＯは、以下に記述されるように、組換体ＣｕｅＯとして大腸菌内で生産され、精製された。
　ＣｕｅＯの遺伝子は、大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＬＡ　ＰＣＲ用ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｔ；　タカラバイオ社製）を用いるＰＣＲ法により増幅された。
　当該ＰＣＲにおいては、ヒスチジンタグをコードする塩基配列がオリゴＤＮＡプライマーに付加され、ＣｕｅＯのアミノ酸配列のカルボキシル末端側にヒスチジンタグを付加した。
　増幅されたＤＮＡ断片は、発現ベクター（ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１　Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングされた（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｄｒｙ－Ｄｏｗｎ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔｓ；クロンテック社製）。当該発現ベクターを用いて大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）；ストラタジーン社製）が形質転換された。形質転換された大腸菌は、１ｍＭの硫酸銅を含有するＬＢ培地上で３０℃、１６時間培養された。
　回収した菌体よりペリプラズム画分が抽出され、ヒスチジンタグ精製カラム（ＴＡＬＯＮ　ＣｅｌｌＴｈｒｕ　Ｒｅｓｉｎ；　クロンテック社製）および陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ　５ｍＬ；　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、抽出液からＣｕｅＯが精製された。
　脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ；　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、精製されたＣｕｅＯを含有する溶液の溶媒が１０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換された。その後、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４、ＭＷＣＯ：３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＣｕｅＯ溶液は濃縮された。濃縮後のＣｕｅＯ溶液は、４　ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。ＣｕｅＯの濃度は、ＢＳＡをスタンダードとして用いたＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定された。得られたＣｕｅＯ溶液は４℃で保管された。
　（担体の調製）
　５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が５ｍｇのカーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ；Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に添加された。その後、当該ＤＭＳＯ溶液を超音波ホモジナイザー（ｓｏｎｉｆｉｅｒ　１５０；Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いて、出力１０　Ｗａｔｔｓ　（ＲＭＳ）で３分間かけて均質化し、ＳＷＣＮＴ懸濁液を得た。
　２ｍｍの厚みを有するカーボンフェルト（日本カーボン社製）から、６ｍｍの直径を有するカーボンフェルトが切り抜かれた。当該カーボンフェルトは、プラスチック製カラム（バイオスピンエンプティーカラム；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）にセットされた。
　５００μＬのＳＷＣＮＴ懸濁液がカーボンフェルト上に滴下され、当該カーボンフェルトにカーボンナノチューブを吸着した。０．３ｍＬのＤＭＳＯおよび３ｍＬの超純水が当該カラムにこの順に流された。次に、当該カラムに１ｍＬのトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流され、当該カラムを洗浄した。当該カラム内で得られたカーボンフェルトが担体として用いられた。
　（ＣｕｅＯ溶液及び抗体の担体への固定）
　上記の担体がセットされたカラムに、２ｍｇ／ｍＬのＣｕｅＯ溶液、６ｍｇ／ｍＬの抗ＢＳＡ抗体を含有する０．１ｍＬのトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が滴下された。２５℃で１０分間のインキュベートにより、ＣｕｅＯおよび抗ＢＳＡ抗体がカーボンフェルトから構成される担体に結合した。このようにして、ＣｕｅＯおよび抗ＢＳＡ抗体が固定化された。
　当該カラムに、２ｍＬの氷冷したトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流された。得られた担体は４℃で保管された。
　（酢酸緩衝液の調製）
　ｐＨメータを用いてｐＨを測定しながら、酢酸に水酸化ナトリウムが加えられて、３のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。当該酢酸緩衝液は０．１％に希釈され、１．０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に、６のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。さらに、１．０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
　ｐＨメータを用いてｐＨを測定しながら、１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）に１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）が添加され、１．０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を調製した。ｐＨ調整時の温度は２５℃であった。
　同様に、０．５ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）がそれぞれ調製された。
　（ポテンシオスタット法による電気化学測定）
　（測定装置）
　ＣｕｅＯの酵素活性は、ポテンシオスタット法による電気化学測定により測定された。図３に示される電気化学測定装置が用いられた。測定器１１４は、ポテンシオスタット（ＡＬＳ７６０Ｃ（ＢＡＳ社製））であった。参照電極１１６は飽和ＫＣｌ銀／塩化銀電極（ＲＥ－１Ｃ；ＢＡＳ社製）であった。カウンター電極１１７はＰｔ電極（長さ２３ｃｍ、ＢＡＳ社製）であった。
　図１及び図５に示されるように、抗体１０３及びマルチ銅酸化酵素１０２を具備する担体１０１が、ナイロンネット１２２およびリング１２３によってグラッシーカーボン電極１２１（電極サイズ（ＩＤ）：３ｍｍ、ＢＡＳ社製）に固定され、作用電極１１５を得た。
　（ブランク値の算出）
　当該作用電極１１５を用いて測定が行なわれた。支持電解質として１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１ｍＭ）をセルに供給した。当該セルに、作用電極１１５、参照電極１１６、及びカウンター電極１１７が浸漬された。当該浸漬は、担体１０１に含有される１０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）が１ｍＭ酢酸緩衝液に置換されることをもたらした。
　２５℃においてポテンシオスタット法により、２０ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度で、開始電位０．６Ｖから終了電位０Ｖまで掃引がなされ、電流値を測定した。図６の（２）は、測定結果を示す。
　ＣｕｅＯの酵素活性により生じる還元電流は電位が０．６Ｖから０Ｖに近づくに従い増大した。開始電位０．６Ｖから０．４５Ｖまでの期間では、酵素反応がほとんど進行しなかったため、０．４５Ｖの電位における電流値が基準値（図６における符号「１」）として定義された。以下の等式によってブランク値が定義された。
　　（ブランク値）＝（測定された電流値（２））－（当該基準値（１））
　（抗原の検出）
　ＣｕｅＯおよび抗体が固定された担体がプラスチック製カラムの一端にセットされた。カラムに１ｍＬのトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）が流された。
　次に、被覆されたシリカビーズ（３００ｎｍ、ｍｉｃｒｏｍｏｄ社製）を含有する１ｍＬのトリス－塩酸緩衝液（２５　ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ））が当該カラムに流された。各シリカビーズは、抗原であるＢＳＡによって被覆されていた。
　当該カラムの末端より流れ出てきた溶液が回収され、再度、当該カラムに流された。これが１０回、繰り返された。最後に、２ｍＬのトリス－塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）がカラムに流された。
　カラムから担体が取り出された。図５に示されるように、グラッシーカーボン電極１２１の先端に、ナイロンネット１２２およびリング１２３を用いて担体１０１が取付けられ、作用電極１１５を得た。
　ブランク値の測定と同様に、１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、１．０ｍＭ）を含有するセルに作用電極１１５が浸漬された。２５℃においてポテンシオスタット法により、２０ｍＶ／ｓｅｃの掃引速度で、開始電位０．６Ｖから終了電位０Ｖまで掃引がなされ、電流値を測定した。図６の（３）は、測定結果を示す。
　測定値は以下の等式により定義された。
　（測定値）＝（測定された電流値（３））－（基準値（１））
　増幅率が以下の等式のように定義された：
　（増幅率）＝（測定値）／（ブランク値）。
　０．５ｍＭ、５ｍＭ、および１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を用いて、上記の場合と同様に増幅率が求められた。
　表１は、掃引電位が０．０Ｖ、０．１Ｖ、０．２Ｖ、および０．３Ｖである場合におけるブランク値、測定値、および増幅率を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から理解されるように、酢酸緩衝液の濃度が０．５ｍＭまたは１．０ｍＭである場合には、１．５以上の増幅率が得られた。一方、酢酸緩衝液の濃度が５ｍＭ以上である場合には、増幅率が小さかった。
　従って、１．０ｍＭ以下の濃度を有する第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法によって測定された増幅率が１．５以上であれば、第１の緩衝液が抗原を含有することを当業者は表１に基づいて理解するであろう。このようにして、本発明では抗原が検出される。さらに、当業者は、本発明においてラベル化抗体１１１が用いられていないことを容易に理解し得るであろう。
　本発明は、バイオセンサに用いられ得る。本発明は、マルチプレックスアッセイによる迅速な免疫診断に特に有用である。
１０１、１０７　担体
１０２　マルチ銅酸化酵素
１０３、１０８　抗体
１０４、１０９　抗原
１０５、１１２　基質
１０６、１１３　生成物
１１０　酵素
１１１　ラベル化抗体
１１４　測定器
１１５　作用電極
１１６　参照電極
１１７　カウンター電極
１１８　反応槽
１１９　低イオン強度の緩衝液
１２１　グラッシーカーボン電極
１２２　ナイロンネット
１２３　リング

Claims (7)

  1. 　以下の工程（Ａ）～（Ｃ）を具備する、抗原を検出する方法：
    　前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に担体を接触させる工程（Ａ）、
    　　ここで、前記担体には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、
    　　当該担体は導電性であり、
    　　前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
    　前記担体および第２の緩衝液を用いるポテンシオスタット法により電流を測定する工程（Ｂ）、
    　　ここで、前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
    　　前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、および
    　以下の不等式が充足されれば前記第１の緩衝液において前記抗原が存在することが決定される工程（Ｃ）
    　　工程（Ｂ）において測定された電流　＞＝　１．５×（ブランク値）
    　　ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記第２の緩衝液は用いられるポテンシオスタット法により測定された電流である。
  2. 　前記担体はカーボンから構成される、請求項１の方法。
  3. 　前記第２の緩衝液は、５．０以上６．０以下のｐＨを有する、請求項１の方法。
  4. 　前記第２の緩衝液は酸素およびプロトンを含有する、請求項１の方法。
  5. 　前記第１の緩衝液は、トリス－塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１の方法。
  6. 　前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、請求項１の方法。
  7. 　前記第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、請求項5の方法。
PCT/JP2011/001989 2010-06-03 2011-04-01 抗原を検出する方法 WO2011151964A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011529392A JP4872033B1 (ja) 2010-06-03 2011-04-01 抗原を検出する方法
US13/296,879 US8309345B2 (en) 2010-06-03 2011-11-15 Method for detecting an antigen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010127456 2010-06-03
JP2010-127456 2010-06-03

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/296,879 Continuation US8309345B2 (en) 2010-06-03 2011-11-15 Method for detecting an antigen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011151964A1 true WO2011151964A1 (ja) 2011-12-08

Family

ID=45066358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/001989 WO2011151964A1 (ja) 2010-06-03 2011-04-01 抗原を検出する方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8309345B2 (ja)
JP (1) JP4872033B1 (ja)
WO (1) WO2011151964A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5011458B1 (ja) * 2011-06-06 2012-08-29 パナソニック株式会社 抗原を検出する方法
WO2012168991A1 (ja) * 2011-06-06 2012-12-13 パナソニック株式会社 抗原を検出する方法
CN102901822A (zh) * 2012-10-23 2013-01-30 扬州大学 聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022246292A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 PERSOWN, Inc. Electrochemical diagnostic system and methods of obtaining and using electrochemical diagnostic results
US11513097B1 (en) 2021-05-21 2022-11-29 PERSOWN, Inc. Methods of obtaining and using electrochemical diagnostic results

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008064514A (ja) * 2006-09-05 2008-03-21 Toyota Central R&D Labs Inc 電極触媒及び酵素電極

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6344333B2 (en) * 1998-09-08 2002-02-05 Synectig Corporation Reagent-free immunoassay monitoring electrode assembly
JP4271086B2 (ja) 2004-06-08 2009-06-03 株式会社東芝 免疫分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008064514A (ja) * 2006-09-05 2008-03-21 Toyota Central R&D Labs Inc 電極触媒及び酵素電極

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IRINA POZDNYAKOVA: "Non-linear effects of macromolecular crowding on enzymatic activity of multi-copper oxidase", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1804, no. 4, 2 March 2010 (2010-03-02), pages 740 - 744 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5011458B1 (ja) * 2011-06-06 2012-08-29 パナソニック株式会社 抗原を検出する方法
WO2012168991A1 (ja) * 2011-06-06 2012-12-13 パナソニック株式会社 抗原を検出する方法
US8470549B2 (en) 2011-06-06 2013-06-25 Panasonic Corporation Method for detecting an antigen
CN102901822A (zh) * 2012-10-23 2013-01-30 扬州大学 聚合物自组装超微孔膜免疫组合传感器的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US8309345B2 (en) 2012-11-13
JP4872033B1 (ja) 2012-02-08
US20120058490A1 (en) 2012-03-08
JPWO2011151964A1 (ja) 2013-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Shi et al. A novel label-free amperometric immunosensor for carcinoembryonic antigen based on redox membrane
Nam et al. Highly sensitive electrochemical detection of proteins using aptamer-coated gold nanoparticles and surface enzyme reactions
JP4872033B1 (ja) 抗原を検出する方法
Wu et al. A novel reagentless amperometric immunosensor based on gold nanoparticles/TMB/Nafion-modified electrode
WO2009032901A1 (en) Biosensors and related methods
JP2017211383A (ja) 酵素電極およびそれを用いたバイオセンサ
Karadag et al. Modified gold surfaces by 6-(ferrocenyl) hexanethiol/dendrimer/gold nanoparticles as a platform for the mediated biosensing applications
Zhang et al. A highly sensitive electrochemical aptasensor for thrombin detection using functionalized mesoporous silica@ multiwalled carbon nanotubes as signal tags and DNAzyme signal amplification
Miao et al. Voltammetric determination of tumor necrosis factor-α based on the use of an aptamer and magnetic nanoparticles loaded with gold nanoparticles
Dou et al. Voltammetric immunoassay for the detection of protein biomarkers
Tang et al. Novel potentiometric immunosensor for the detection of diphtheria antigen based on colloidal gold and polyvinyl butyral as matrixes
KR20110108661A (ko) 미각 수용체 기능화된 탄소 나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 미각센서 및 이를 포함한 고선택성 바이오 전자혀
JP4892686B2 (ja) 酵素センサ、該酵素センサを使用した分析方法及びキット
Zhang et al. Enzymatic deposition of Au nanoparticles on the designed electrode surface and its application in glucose detection
Cetinel et al. Addressable self‐immobilization of lactate dehydrogenase across multiple length scales
Xiang et al. Multi-enzyme layer-by-layer assembly for dual amplified ultrasensitive electronic detection of cancer biomarkers
Davis Engineering the bioelectronic interface: applications to analyte biosensing and protein detection
Lee et al. Peptide sequence-driven direct electron transfer properties and binding behaviors of gold-binding peptide-fused glucose dehydrogenase on electrode
Darain et al. Development of a new and simple method for the detection of histidine-tagged proteins
Takamatsu et al. Transient potentiometry based D-serine sensor using engineered D-amino acid oxidase showing quasi-direct electron transfer property
US20230293059A1 (en) Method for electrochemically measuring oxidoreductase using a biosensor, and biosensor used therein
Zhang et al. Sandwich-format electrochemiluminescence assay for PDGF-BB using quantum dots–dendrimer nanocomposites as probe
Sakamoto et al. Biocathode design with highly‐oriented immobilization of multi‐copper oxidase from Pyrobaculum aerophilum onto a single‐walled carbon nanotube surface via a carbon nanotube‐binding peptide
Zheng et al. DNA walker-amplified signal-on electrochemical aptasensors for prostate-specific antigen coupling with two hairpin DNA probe-based hybridization reaction
Lu et al. A novel glutathione-S transferase immunosensor based on horseradish peroxidase and double-layer gold nanoparticles

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011529392

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11789379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11789379

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1