WO2012168991A1 - 抗原を検出する方法 - Google Patents

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和晃 西尾
松川　望
吉井　重雄
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パナソニック株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an antigen using an antibody and an enzyme.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 4271866 (hereinafter referred to as Patent Document 1 and this document corresponds to US Patent Application Publication No. 2005/0282237) discloses an enzyme immunoassay method.
  • FIG. 2 shows the sandwich method included in the enzyme immunoassay.
  • the carrier 107 has an antibody 108 on its surface.
  • a sample containing the antigen 109 is supplied to the surface of the carrier 107, resulting in the antigen 109 binding specifically to the antibody 108. Thereafter, the sample containing the unreacted antigen 109 is removed from the carrier by washing.
  • the labeled antibody 111 having the enzyme 110 for detecting the antigen 109 is supplied to the surface of the carrier 107 to form a complex composed of antibody 108-antigen 109-labeled antibody 111. Thereafter, unreacted labeled antibody is removed by washing.
  • the substrate 112 of the enzyme 110 is supplied to the surface of the carrier 107.
  • Enzyme 110 reacts metabolically with substrate 112 to form product 113.
  • the luminescence or absorbance of the product 113 is measured to detect the antigen 109 indirectly.
  • the sandwich method requires not only the antibody 108 but also the labeled antibody 111 having the enzyme 110.
  • Labeled antibody 111 needs to be supplied after the specific reaction that occurs between antibody 108 and antigen 109. Furthermore, unreacted labeled antibody 111 needs to be removed.
  • One of the objects of the present invention is to provide a method for detecting an antigen without using a labeled antibody.
  • the present invention relates to a method for detecting an antigen comprising the following steps: A step (a) of immersing particles in a first buffer solution that is expected to contain the antigen, wherein an antibody and a multi-copper oxidase CueO are immobilized on the surface of the particles; Specifically reacts to A step (b) of recovering the particles obtained in the step (a); Step (c) of mixing the particles recovered in the step (b), a redox indicator (reduced form), and a second buffer to prepare a reaction solution, wherein the second buffer is Contains a substrate for multi-copper oxidase CueO, The second buffer solution has an ionic strength within a range of 0.3 mM to 1.0 mM, Step (d) of measuring the activity of multi-copper oxidase CueO contained in the reaction solution obtained in step (c) by an absorbance measurement method, and the first buffer solution if the following equation is satisfied Step (e) is determined to contain said antigen Activity measured in step
  • the present invention provides a method for detecting an antigen without using a labeled antibody.
  • FIG. 1 shows a reaction flow chart of a method for detecting an antigen according to the present invention.
  • FIG. 2 shows a reaction flowchart of a conventional enzyme immunoassay (sandwich method).
  • FIG. 3 shows an example of a particle carrier on which CueO and an antibody are immobilized.
  • FIG. 4 shows the results of the absorbance measurement performed in Example 1.
  • FIG. 1 shows a reaction flowchart of a method for detecting an antigen according to the present invention.
  • the particles 101 are immersed in a first buffer solution that is expected to contain the antigen 104.
  • each particle 101 has a multi-copper oxidase 102 and an antibody 103 on the surface.
  • the multi-copper oxidase 102 is described as “CueO”.
  • each particle 101 is preferably composed of particles having a diameter of 10 to 20 nanometers.
  • the antibody 103 and the CueO 102 are immobilized on the surface of the particle 101.
  • Antibody 103 reacts specifically with antigen 104.
  • an example of the material of the particle 101 is a noble metal.
  • noble metals are gold, silver and platinum. Gold is preferred.
  • Antibody 103 can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • An Fab fragment and an F (ab ′) 2 fragment produced by artificially removing an Fc region or a part thereof from an antibody can also be used as the antibody 103.
  • CueO102 is a kind of enzyme that catalyzes a redox reaction. As shown in FIG. 1, CueO102 catalyzes a reaction in which water is produced as product 106 by performing a four-electron reduction of substrate 105 composed of oxygen molecules.
  • the active center of CueO102 is composed of four copper ions having different properties, and each of these copper ions is called type 1, type 2, type 3a, and type 3b.
  • CueO derived from E. coli It is preferable to use CueO derived from E. coli.
  • Method (a) A method using non-specific adsorption by hydrophobic interaction generated between the particle 101 and the antibody 103 or CueO102.
  • antigens 104 detected by the present invention are viruses, bacteria, fungi, proteins, or oligonucleotides. Viruses, bacteria, or fungi are preferred.
  • the first buffer examples include Tris-HCl buffer, Tris buffered saline, or phosphate buffered saline.
  • the first buffer has a pH near neutral.
  • the particles 101 obtained in the step (a) are collected. More specifically, the particles 101 can be recovered by centrifugation. The particles 101 can be recovered using a filter.
  • step (c) particles 101 collected in step (b), a redox indicator (reduced form), and a second buffer are mixed to prepare a reaction solution.
  • the second buffer solution Prior to the addition of the particles 101 to the second buffer solution, the second buffer solution may previously contain a redox indicator (reduced form).
  • an oxidation-reduction reagent (reduced form) can be added to the second buffer solution.
  • the second buffer solution contains a substrate 105 of CueO102.
  • the substrate 105 are oxygen or proton. Oxygen and protons are contained in common commercial buffers.
  • redox indicators are 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), paraphenylenediamine, or 2,6-dimethoxyphenol.
  • ABTS 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • paraphenylenediamine paraphenylenediamine
  • 2,6-dimethoxyphenol 2,6-dimethoxyphenol.
  • ABTS 2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • paraphenylenediamine paraphenylenediamine
  • 2,6-dimethoxyphenol 2,6-dimethoxyphenol.
  • the second buffer solution preferably has a pH of 4.5 or more and 5.5 or less.
  • Sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or trimethylammonium is used to adjust the pH of the second buffer.
  • Examples of the second buffer are acetate buffer, citrate buffer, succinate buffer, phthalate buffer, or 2-morpholinoethane sulfonate buffer (MES).
  • MES 2-morpholinoethane sulfonate buffer
  • the second buffer solution is required to have an ionic strength that falls within the range of 0.3 mM to 1.0 mM. If it is less than 0.3 mM, it is difficult to ensure the stability of pH. If it exceeds 1.0 mM, it will be difficult to detect the antibody contained in the first buffer, as will be apparent from the examples described later.
  • step (d) the activity of CueO contained in the reaction solution obtained in step (c) is measured by an absorbance measurement method.
  • an ultraviolet-visible spectrophotometer is preferably used.
  • the activity of CueO is calculated from the amount of change in redox indicator oxidized per unit time and the amount of CueO used for measurement.
  • step (e) if the following equation is satisfied, it is determined that the first buffer contains an antigen.
  • Activity of CueO measured in step (d) ⁇ 1.4 ⁇
  • the blank value is the activity of CueO measured by an absorbance measurement method in which no antigen is used but the particles 101 and the second buffer solution are used.
  • the blank value can be calculated in parallel with step (c). Alternatively, the blank value can be calculated in advance.
  • Example 1 (Preparation of CueO) CueO derived from E. coli (K-12 strain) was produced and purified in E. coli as recombinant CueO as described below.
  • the gene for CueO was amplified by a PCR method using E. coli genomic DNA (LA PCR genomic DNA Set; manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a base sequence encoding a histidine tag was added to the oligo DNA primer, and a histidine tag was added to the carboxyl terminal side of the amino acid sequence of CueO.
  • the amplified DNA fragment was cloned into an expression vector (pRSFDuet-1; manufactured by Merck KGaA) (In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kits; Clontech). Laboratories). Escherichia coli (BL21 (DE3); manufactured by Agilent Technologies) was transformed with the expression vector. The transformed E. coli was cultured at 30 ° C. for 16 hours on LB medium containing 1 mM copper sulfate.
  • pRSFDuet-1 manufactured by Merck KGaA
  • Escherichia coli BL21 (DE3); manufactured by Agilent Technologies
  • a periplasmic fraction is extracted from the collected cells, and a histidine tag purification column (TALON CellThru Resin; Clontech Laboratories) and an anion exchange column (HiTrap Q HP 5 mL; GE Healthcare) were used to purify CueO from the extract.
  • TALON CellThru Resin Clontech Laboratories
  • HiTrap Q HP 5 mL HisTrap Q HP 5 mL; GE Healthcare
  • the purified CueO solvent was replaced with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Thereafter, the CueO solution was concentrated using an ultrafiltration unit (Amicon Ultra-4, MWCO: 30,000; manufactured by Millipore). The concentrated CueO solution had a concentration of 1 mg / mL. The concentration of the CueO solution was measured based on the Bradford method (Protein Assay Kit II; manufactured by Bio-Rad Laboratories) using Bovine Serum Albumin (BSA) as a standard. The resulting CueO solution was stored at 4 ° C.
  • An anti-bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin) antibody (anti-BSA antibody [Rabbit], 1 mg / mL; manufactured by Bethyl Laboratories) was used as the antibody 103.
  • the antibody was stored at 4 ° C.
  • a dispersion of gold particles containing CueO, antibody, and polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate was poured into four centrifuge tubes (thick PC tube 3.0 mL; manufactured by Beckman Coulter, Inc.). Each centrifuge tube had 3 milliliters of dispersion.
  • glycerol 0.05 milliliters of glycerol (> 99.5%; Life Technologies) was submerged in the bottom of each dispersion. Glycerol functioned as a cushion.
  • Each centrifuge tube was placed in a rotor (TLA-100.3; manufactured by Beckman Coulter) and set in a centrifuge (Optima TL; manufactured by Beckman Coulter). Four centrifuge tubes were centrifuged at 70,000 rpm, 4 ° C. for 20 minutes.
  • the supernatant was removed from each centrifuge tube to leave a concentrated gold particle dispersion (about 0.01 ml ⁇ 4).
  • Tris-hydrochloric acid buffer solution pH: 8.0, 1 mM, 3 ml
  • 0.01% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate was added to the concentrated gold particle dispersion (0.01 ml). Added.
  • this procedure is referred to as “procedure A”.
  • the obtained buffer solution is hereinafter referred to as “T buffer solution”.
  • the gold particle dispersion added with T buffer was poured into four centrifuge tubes (3.0 mL thick PC tube; manufactured by Beckman Coulter). Each centrifuge tube had 3 milliliters of dispersion. 0.05 milliliters of glycerol (> 99.5%; manufactured by Life Technologies) was submerged in the bottom of each dispersion. Glycerol functioned as a cushion. Each centrifuge tube was placed in a rotor (TLA-100.3; manufactured by Beckman Coulter) and set in a centrifuge (Optima TL; manufactured by Beckman Coulter). Four centrifuge tubes were centrifuged at 70,000 rpm, 4 ° C. for 20 minutes. The supernatant was removed from each centrifuge tube, leaving a concentrated gold particle dispersion (approximately 0.01 ml ⁇ 4). This procedure is referred to as “procedure B”.
  • Procedure A and procedure B were repeated once more.
  • the gold particle dispersion thus concentrated was collected from four centrifuge tubes, and the volume was adjusted to 1.2 ml by adding T buffer.
  • the concentration of CueO contained in the gold particle dispersion thus obtained was measured by the SDS-PAGE method. The result was 0.02 milligram / milliliter.
  • the gold particle dispersion thus obtained was stored at 4 ° C.
  • ABTS (2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium salt
  • ABTS (2,2′-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium salt
  • ABTS functioned as a redox indicator.
  • ABTS acetate buffer (pH: 3) having 1.0 mM acetate buffer concentration in ABTS acetate buffer (pH: 6) having 1.0 mM acetate buffer concentration was added to prepare an ABTS acetate buffer solution (pH: 5.5) having an acetate buffer concentration of 1.0 mM.
  • the temperature during pH adjustment was 25 ° C.
  • an ABTS acetate buffer (pH: 4.5) having an acetate buffer concentration of 1.0 mM was prepared.
  • each ABTS acetate buffer solution (pH: 5.5) having a concentration of 0.5 mM, 5 mM, and 10 mM was prepared. Further, each ABTS acetate buffer solution (pH: 4.5) having a concentration of 0.5 mM, 5 mM, and 10 mM was prepared.
  • the activity of CueO was measured by an absorbance measurement method using a redox indicator.
  • An ultraviolet-visible spectrophotometer (UV-1600PC; manufactured by Shimadzu Corporation) was used for absorbance measurement.
  • a cell (disposable cell semi-micro; manufactured by Tecl) having an optical path length of 1 centimeter was used as a measurement container.
  • ABTS acetate buffer (1.0 mM, pH: 4.5, 0.98 ml) was added to the cell, and then the cell was set in an ultraviolet-visible spectrophotometer. Next, a gold particle dispersion (0.02 milliliter) was added to the cell. Absorbance of ABTS acetate buffer was measured continuously (0.1 second interval) for 60 seconds at a wavelength of 420 nanometers. FIG. 4 shows the measurement results.
  • CueO activity (U / mg) was calculated from the amount of change in absorbance measured for 60 seconds based on the following formula.
  • 1U means that the amount of ABTS oxidized in 60 seconds is equal to 1 micromolar.
  • Table 5 to be described later shows the results of CueO activity measurement.
  • A absorbance (nanometer)
  • ⁇ the molar extinction coefficient of ABTS at a wavelength of 420 nanometers, which is 36,000 (M ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) in this example
  • l the optical path length, 1 centimeter in this example
  • B the concentration of CueO, 0.02 milligram / milliliter in this example.
  • T buffer (1 ml) was added to the resulting precipitate to suspend the T buffer.
  • the gold particles were precipitated again by centrifugation (2500 rpm, 23 ° C. for 3 minutes).
  • T buffer solution (0.6 ml) was added to the resulting precipitate and suspended. In this way, an antigen-antibody mixture was prepared.
  • ABTS acetate buffer (1.0 mM, pH: 4.5, 0.98 ml) was added to the cell, and then the cell was set in an ultraviolet-visible spectrophotometer. Next, a gold particle dispersion (0.02 milliliter) was added to the cell. Absorbance of ABTS acetate buffer was measured continuously (0.1 second interval) for 60 seconds at a wavelength of 420 nanometers. From the measurement results, the activity of CueO was calculated as a measured value. The measured values calculated in this way are shown in Table 5 described later.
  • the concentration of the acetate buffer (more precisely, the concentration of acetic acid contained in the ABTS acetate buffer) is 1.0 mM or less, the amplification factor is 1.4 or more. . On the other hand, when the concentration of the acetate buffer was 5 mM or more, the amplification factor was 1.1 at the maximum.
  • the present invention can be used for a biosensor.
  • the present invention is particularly useful for rapid immunodiagnosis by multiplex assay.

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Abstract

　本発明は、抗体および酵素を利用して抗原を検出する方法に関する。具体的には、本発明は、ラベル化抗体を用いずに、抗原を検出する方法を提供する.。この方法は、抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に粒子を浸漬させる工程を含み、粒子の表面には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、上記抗体は上記抗原に特異的に反応する。この方法は、さらに、得られた粒子を回収する工程、回収された粒子、酸化還元指示薬（還元体）、および第２の緩衝液を混合し、反応溶液を調製する工程、得られた反応溶液に含有されるマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの活性度を、吸光度測定法により測定する工程、これに基づいて第１の緩衝液が上記抗原を含有することが決定される工程を含む。

Description

抗原を検出する方法
　本発明は、抗体および酵素を利用して抗原を検出する方法に関する。
　特許第４２７１０８６号公報（以下、特許文献１。また、本文献は、米国特許出願公開第２００５／０２８２２３７号明細書に対応する）は、酵素免疫測定法を開示している。図２は、当該酵素免疫測定法に含まれるサンドイッチ法を示す。
　図２に示されるように、担体１０７は、抗体１０８を表面に有する。抗原１０９を含有する試料が担体１０７の表面に供給され、抗原１０９が抗体１０８に特異的に結合することがもたらされる。その後、未反応の抗原１０９を含有する試料が洗浄により担体から除去される。
　次に、抗原１０９を検出する酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１が、担体１０７の表面に供給され、抗体１０８－抗原１０９－ラベル化抗体１１１から構成される複合体を形成する。その後、未反応のラベル化抗体が洗浄により除去される。
　最後に、酵素１１０の基質１１２が担体１０７の表面に供給される。酵素１１０は基質１１２と代謝的に反応して、生成物１１３を形成する。生成物１１３の発光または吸光度が測定され、抗原１０９を間接的に検出する。
特許第４２７１０８６号公報
　しかし、サンドイッチ法は、抗体１０８だけでなく、酵素１１０を具備しているラベル化抗体１１１をも必要とする。ラベル化抗体１１１は、抗体１０８と抗原１０９との間で生じる特異的反応の後に供給されることを必要とする。さらに、未反応のラベル化抗体１１１は除去されることを必要とする。
　本発明の目的の１つは、ラベル化抗体を用いずに、抗原を検出する方法を提供することである。
　本発明は、　以下の工程を具備する、抗原を検出する方法に係る：
　前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に粒子を浸漬させる工程（ａ）、ここで
　　前記粒子の表面には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、そして
　　前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
　前記工程（ａ）において得られた粒子を回収する工程（ｂ）、
　前記工程（ｂ）において回収された粒子、酸化還元指示薬（還元体）、および第２の緩衝液を混合し、反応溶液を調製する工程（ｃ）、ここで
　　前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
　　前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、
　工程（ｃ）において得られた反応溶液に含有されるマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの活性度を、吸光度測定法により測定する工程（ｄ）、および
　以下の式が充足されれば前記第１の緩衝液が前記抗原を含有することが決定される工程（ｅ）
　　工程（ｄ）において測定された活性度　＞＝　１．４×（ブランク値）
　　ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記粒子および前記第２の緩衝液は用いられる吸光度測定法により測定されたマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの活性度を表す。
　一態様において、本発明は、ラベル化抗体を用いずに、抗原を検出する方法を提供する。
図１は、本発明による抗原を検出する方法の反応フローチャートを示す。 図２は、従来の酵素免疫測定法（サンドイッチ法）の反応フローチャートを示す。 図３は、ＣｕｅＯおよび抗体が固定された粒子担体の一例を示す。 図４は、実施例１において行われた吸光度測定の結果を示す。
　以下、図面を参照しながら、本発明の例示的な実施の形態が説明される。
　図１は、本発明による抗原を検出する方法の反応フローチャートを示す。
　（工程ａ）
　工程（ａ）では、抗原１０４を含有すると予想される第１の緩衝液に粒子１０１が浸漬される。
　図３に示されるように、各粒子１０１は、マルチ銅酸化酵素１０２および抗体１０３を表面に具備する。以下、マルチ銅酸化酵素１０２は、「ＣｕｅＯ」と記述される。
　固定される抗体１０３およびＣｕｅＯ１０２の量を増加させる観点から、各粒子１０１は１０～２０ナノメートルの直径を有する粒子からなることが好ましい。
　図１および図３に示されるように、抗体１０３およびＣｕｅＯ１０２が、粒子１０１の表面に固定されている。抗体１０３は抗原１０４と特異的に反応する。
　抗体１０３およびＣｕｅＯ１０２が容易に固定化する観点から、粒子１０１の材料の例は貴金属である。当該貴金属の例は、金、銀および白金である。金が好ましい。
　抗体１０３は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体からＦｃ領域またはその一部が人為的に除去されて作製された、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントも抗体１０３として用いられ得る。
　ＣｕｅＯ１０２は、酸化還元反応を触媒する酵素の一種である。図１に示されるように、ＣｕｅＯ１０２は、酸素分子から構成される基質１０５の４電子還元を行い、そして生成物１０６として水が生成される反応を触媒する。ＣｕｅＯ１０２の活性中心は、性質の異なる４個の銅イオンから構成され、この銅イオンの各々は、タイプ１、タイプ２、タイプ３ａ、およびタイプ３ｂと呼ばれる。
　大腸菌由来のＣｕｅＯが用いられることが好ましい。
　抗体１０３及びＣｕｅＯ１０２を粒子１０１に固定する方法としては、以下の方法（ａ）が挙げられる。
　方法（ａ）：粒子１０１と、抗体１０３またはＣｕｅＯ１０２との間で生じる疎水性相互作用による非特異的吸着を利用する方法。
 
　本発明により検出される抗原１０４の例は、ウイルス、細菌、真菌、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドである。ウイルス、細菌、または真菌が好ましい。
　第１の緩衝液の例は、トリス－塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である。好ましくは、当該第１の緩衝液は、中性付近のｐＨを有する。
　浸漬は、抗体１０３と抗原１０４との間の特異的結合をもたらす。その後、洗浄により、未反応の抗原１０４を含有する第１の緩衝液は、粒子１０１の表面から除去される。
　本発明では、抗原１０４と抗体１０３との特異的結合が、ＣｕｅＯ１０２の酵素活性を上昇させる。
　（工程（ｂ））
　工程（ｂ）では、工程（ａ）において得られた粒子１０１を回収する。より具体的には、遠心分離法によって粒子１０１は回収され得る。フィルタを用いて粒子１０１は回収され得る。
　（工程（ｃ））
　工程（ｃ）では、工程（ｂ）において回収された粒子１０１、酸化還元指示薬（還元体）、および第２の緩衝液を混合し、反応溶液を調製する。粒子１０１の第２緩衝液への添加に先だって、第２の緩衝液が酸化還元指示薬（還元体）を予め含有し得る。これに代えて、粒子１０１を第２の緩衝液に添加した後に、第２の緩衝液に酸化還元試薬（還元体）を添加し得る。
　第２の緩衝液は、ＣｕｅＯ１０２の基質１０５を含有する。基質１０５の例は、酸素またはプロトンである。酸素およびプロトンは、市販されている一般的な緩衝液に含まれている。
　酸化還元指示薬の例は２，２‘‐アジノビス（３‐エチルベンゾチアゾリン‐６‐スルホン酸)（ＡＢＴＳ）、パラフェニレンジアミン、または２，６‐ジメトキシフェノールである。ＡＢＴＳが好ましい。なぜなら、ＡＢＴＳ（還元体）は商業的に入手可能であり、容易に調達できるからである。
　第２の緩衝液は、４．５以上５．５以下のｐＨを有することが好ましい。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、またはトリメチルアンモニウムが用いられて、第２の緩衝液のｐＨを調整する。第２の緩衝液の例は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ）である。酢酸緩衝液が好ましい。
　第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有することを必要とされる。０．３ｍＭ未満では、ｐＨの安定性を確保することが困難である。１．０ｍＭを超えると、後述される実施例からも明らかなように、第１の緩衝液に含有される抗体を検出することが困難となる。
　（工程（ｄ））
　工程（ｄ）では、工程（ｃ）において得られた反応溶液に含有されるＣｕｅＯの活性度を、吸光度測定法により測定する。
　吸光度を測定するために、紫外可視分光光度計が用いられることが好ましい。
　吸光度を測定する具体的な手順を、以下、説明する。まず、工程（ｃ）において第２の緩衝液に粒子１０１を浸漬した後、吸光度を連続的に一定時間測定し、単位時間あたりの吸光度の変化量を記録する。ＣｕｅＯにより反応溶液に含有される酸化還元指示薬（還元体）は酸化される。酸化状態における酸化還元指示薬の吸光度は、還元状態における酸化還元指示薬の吸光度とは異なるので、酸化還元指示薬の変化量が吸光度から算出される。
　ＣｕｅＯの活性度は、単位時間あたりに酸化された酸化還元指示薬の変化量および測定に使用されたＣｕｅＯの量から算出される。
　（工程（ｅ））
　工程（ｅ）では、以下の式が充足されれば第１の緩衝液が抗原を含有することが決定される。
　　（工程（ｄ）において測定されたＣｕｅＯの活性）≧１．４×（ブランク値）
　　ここで、ブランク値は、抗原は用いられないが、粒子１０１および第２の緩衝液は用いられる吸光度測定法により測定されたＣｕｅＯの活性度である。
　ブランク値は、工程（ｃ）と平行して算出され得る。または、ブランク値は、予め算出され得る。
　以下の実施例１を用いて、本発明はより詳細に説明される。
　（実施例１）
　（ＣｕｅＯの調製）
　大腸菌由来（Ｋ－１２株）のＣｕｅＯは、以下に記述されるように、組換ＣｕｅＯとして大腸菌内で生産され、精製された。
　ＣｕｅＯの遺伝子は、大腸菌ゲノムＤＮＡ（ＬＡ　ＰＣＲ用ｇｅｎｏｍｅ　ＤＮＡ　Ｓｅｔ；　タカラバイオ社製）を用いるＰＣＲ法により増幅された。
　当該ＰＣＲにおいては、ヒスチジンタグをコードする塩基配列がオリゴＤＮＡプライマーに付加され、ＣｕｅＯのアミノ酸配列のカルボキシル末端側にヒスチジンタグを付加した。
　増幅されたＤＮＡ断片は、発現ベクター（ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１；Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ製）にクローニングされた（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｄｒｙ－Ｄｏｗｎ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）。当該発現ベクターを用いて大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）；Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が形質転換された。形質転換された大腸菌は、１ｍＭの硫酸銅を含有するＬＢ培地上で３０℃、１６時間培養された。
　回収した菌体よりペリプラズム画分が抽出され、ヒスチジンタグ精製カラム（ＴＡＬＯＮ　ＣｅｌｌＴｈｒｕ　Ｒｅｓｉｎ；　Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）および陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ　５ｍＬ；　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、抽出液からＣｕｅＯが精製された。
　脱塩カラム（ＨｉＴｒａｐ　ｄｅｓａｌｔｉｎｇ；　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、精製されたＣｕｅＯの溶媒が１０ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換された。その後、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４、ＭＷＣＯ：３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いてＣｕｅＯ溶液は濃縮された。濃縮後のＣｕｅＯ溶液は、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。ＣｕｅＯ溶液の濃度は、Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）をスタンダードとして用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（プロテインアッセイキットＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）に基づいて測定された。得られたＣｕｅＯ溶液は４℃で保管された。
　（抗体の調製）
　抗ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ）抗体（抗ＢＳＡ抗体［Ｒａｂｂｉｔ］、１ｍｇ／ｍＬ；Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）が抗体１０３として用いられた。抗体は４℃で保管された。
　（ＣｕｅＯ１０２及び抗体１０３の粒子１０１への固定）
　２０ナノメートルの直径を有する金粒子の分散液（Ｇｏｌｄ　Ｃｏｌｌｏｉｄ　２０ｎｍ；ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を用いた。当該金粒子は、粒子１０１として機能した。この分散液（１２ミリリットル）および抗体（０．１２ミリリットル）を混合し、２３℃で４０分間静置した。続いて、ＣｕｅＯ溶液（０．１２ミリリットル）を加え、２３℃で４０分間静置した。さらに、ポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレート（ＡＮＡＰＯＥ―２０；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の１０％水溶液（０．１２ミリリットル）を添加し、２３℃で１０分間静置した。
　次に、粒子１０１に固定されなかったＣｕｅＯおよび抗体を以下のように、除去した。
　ＣｕｅＯ、抗体、およびポリオキシエチレン（２０)ソルビタンモノラウレートを含有する金粒子の分散液を４本の遠心管（肉厚PCチューブ３．０ｍＬ；ベックマン・コールター社製）に注いだ。各遠心管は、３ミリリットルの分散液を有していた。
　０．０５ミリリットルのグリセロール（＞９９．５％；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を各分散液の底部に沈めた。グリセロールは、クッションとして機能した。
　各遠心管をローター（ＴＬＡ―１００．３；ベックマン・コールター社製）に入れ、遠心機（Ｏｐｔｉｍａ　ＴＬ；ベックマン・コールター社製）にセットした。４本の遠心管は、７０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心された。
　各遠心管から上清を除き、濃縮された金粒子分散液（約０．０１ミリリットルｘ４本）を残した。
　濃縮された金粒子分散液（０．０１ミリリットル）に０．０１％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有するトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ：８．０、１ｍＭ、３ミリリットル）を添加した。以下、この手順を「手順Ａ」という。得られた緩衝液は、以後「Ｔ緩衝液」と表記される。
　Ｔ緩衝液を添加した金粒子分散液を４本の遠心管（肉厚PCチューブ３．０ｍＬ；ベックマン・コールター社製）に注いだ。各遠心管は、３ミリリットルの分散液を有していた。０．０５ミリリットルのグリセロール（＞９９．５％；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を各分散液の底部に沈めた。グリセロールは、クッションとして機能した。各遠心管をローター（ＴＬＡ―１００．３；ベックマン・コールター社製）に入れ、遠心機（Ｏｐｔｉｍａ　ＴＬ；ベックマン・コールター社製）にセットした。４本の遠心管は、７０，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心された。各遠心管から上清を除き、濃縮された金粒子分散液（約０．０１ミリリットルｘ４本）を残した。この手順を「手順Ｂ」という。
　手順Ａおよび手順Ｂをもう一度繰返した。
　このようにして濃縮された金粒子分散液を４本の遠心管から集め、Ｔ緩衝液を加えて容量を１．２ミリリットルに調整した。このようにして得られた金粒子分散液に含有されるＣｕｅＯの濃度を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により測定した。その結果は、０．０２ミリグラム／ミリリットルであった。このようにして得られた金粒子分散液は４℃で保管された。
　（酢酸緩衝液の調製）
　ｐＨメータを用いてｐＨの値を測定しながら、酢酸に水酸化ナトリウムが加えられて、３のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。当該酢酸緩衝液は５％に希釈され、５０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に、６のｐＨを有する１Ｍ酢酸緩衝液を調製した。さらに、５０ｍＭの濃度を有する酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
　（ＡＢＴＳ溶液の調製）
　（2,2’-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウム塩（５４９ミリグラム、東京化成工業社製、以下、「ＡＢＴＳ」という）を超純水で溶解して、１０ミリリットルのＡＢＴＳ溶液（１００ｍＭ）を調製した。以下、（2,2’-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウム塩を「ＡＢＴＳ」という。ＡＢＴＳは酸化還元指示薬として機能した。
　（ＡＢＴＳ酢酸緩衝液の調製）
　以下の表１に示される液体を混合し、１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以下の表２に示される液体を混合し、０．５ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に０．５ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以下の表３に示される液体を混合し、５ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に５ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以下の表４に示される液体を混合し、１０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）を調製した。同様に１０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ｐＨメータを用いてｐＨを測定しながら、１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：６）に１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：３）が添加され、１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を調製した。ｐＨ調整時の温度は２５℃であった。同様に、１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：４．５）が調製された。
　同様に、０．５ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度を有する各ＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：５．５）を調製した。さらに０．５ｍＭ、５ｍＭ、及び１０ｍＭの濃度を有する各ＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：４．５）を調製した。
　（吸光度測定法によるＣｕｅＯの活性度の測定）
　ＣｕｅＯの活性度は、酸化還元指示薬を用いた吸光度測定法により測定された。吸光度測定のために、紫外可視分光光度計（ＵＶ-１６００ＰＣ；島津製作所社製）を使用した。測定容器として、１センチメートルの光路長を有するセル（ディスポーザブル・セル　セミミクロ；Ｋａｒｔｅｌｌ社製）が用いられた。
　（ブランク値の測定）
　まず、ブランク値が以下のように測定された。ブランク値の測定においては、抗原は用いられなかった。
　ＡＢＴＳ酢酸緩衝液（１．０ｍＭ、ｐＨ：４．５、０．９８ミリリットル）をセルに加えた後、当該セルを紫外可視分光光度計にセットした。次に、金粒子分散液（０．０２ミリリットル）をセルに加えた。波長４２０ナノメートルにおいてＡＢＴＳ酢酸緩衝液の吸光度を連続的（０．１秒間隔）に６０秒間測定した。図４は、測定結果を示す。
　６０秒の間測定された吸光度の変化量から、以下の数式に基づいてＣｕｅＯの活性度（Ｕ/ｍｇ）を算出した。ＣｅｕＯの活性度の単位について、１Ｕとは、６０秒間に酸化されたＡＢＴＳの量が１マイクロモルに等しいことを意味する。後述する表５にＣｕｅＯ活性度測定の結果が示される。
　ＣｕｅＯの活性度（Ｕ／ｍｇ）＝Ａ／εｌＢ
　ここで、
　Ａは吸光度（ナノメートル）、
　εは波長４２０ナノメートルにおけるＡＢＴＳのモル吸光係数であり、本実施例では３６，０００（Ｍ－１ｃｍ－１）であり、
　ｌは光路長であり、本実施例では１センチメートルであり、そして
　ＢはＣｕｅＯの濃度であり、本実施例では０．０２ミリグラム／ミリリットルである。
　このようにして、ブランク値が測定された。
　（抗原－抗体混合液の調製）
　金粒子分散液（０．６ミリリットル）に、ＢＳＡによって被覆されたシリカビーズ（直径３００ナノメートル；２５ミリグラム／ミリリットル；ｍｉｃｒｏｍｏｄ
Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）を抗原として０．０６ｍＬを加えた後、金粒子分散液を２３℃で３０分間インキュベートした。抗原を捕捉した金粒子を遠心（２５００ｒｐｍ、２３℃、３分間）により沈殿させ、上清を除いた。このようにして得られた沈殿にＴ緩衝液（１ミリリットル）を加え、緩衝液を懸濁した。得られた懸濁液は、第１の緩衝液に対応する。遠心（２５００ｒｐｍ、２３℃、３分間）により、再度、金粒子を沈殿させた。得られた沈殿にＴ緩衝液（１ミリリットル）を加え、T緩衝液を懸濁した。遠心（２５００ｒｐｍ、２３℃で３分間）により、再度、金粒子を沈殿させた。得られた沈殿にＴ緩衝液（０．６ミリリットル）を加えて懸濁した。このようにして、抗原－抗体混合液を調製した。
　（反応溶液の調製および吸光度の測定）
　ＡＢＴＳ酢酸緩衝液（１．０ｍＭ、ｐＨ：４．５、０．９８ミリリットル）をセルに加えた後、当該セルを紫外可視分光光度計にセットした。次に、金粒子分散液（０．０２ミリリットル）をセルに加えた。波長４２０ナノメートルにおいてＡＢＴＳ酢酸緩衝液の吸光度を連続的（０．１秒間隔）に６０秒間測定した。測定結果からＣｕｅＯの活性度を測定値として算出した。このように算出された測定値は、後述される表５に示される。
　増幅率が以下の等式のように定義された：
　（増幅率）＝（測定値）／（ブランク値）。
　１．０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：４．５、５．０、および５．５）および１０ｍＭの酢酸緩衝液濃度を有するＡＢＴＳ酢酸緩衝液（ｐＨ：４．５、５．０、および５．５）を用いて、上記と同様に増幅率が算出された。表５にそれらの結果が示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５から明らかなように、酢酸緩衝液の濃度（正確には、ＡＢＴＳ酢酸緩衝液に含有される酢酸の濃度）が１．０ｍＭ以下である場合には、増幅率は１．４以上である。一方、酢酸緩衝液の濃度が５ｍＭ以上の場合には、増幅率は最大でも１．１であった。
　従って、増幅率が１．４以上であれば、抗原が検出されることを当業者は表５に基づいて理解するであろう。さらに、当業者は、本発明においてラベル化抗体１１１が用いられていないことを容易に理解し得るであろう。
　本発明は、バイオセンサに用いられ得る。本発明は、マルチプレックスアッセイによる迅速な免疫診断に特に有用である。
１０１　粒子
１０２　マルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯ
１０３　抗体
１０４　抗原
１０５　基質
１０６　生成物
１０７　担体
１０８　抗体
１０９　抗原
１１０　酵素
１１１　ラベル化抗体
１１２　基質
１１３　生成物

Claims (6)

  1. 以下の工程を具備する、抗原を検出する方法：
    　前記抗原を含有すると予想される第１の緩衝液に粒子を浸漬させる工程（ａ）、ここで
    　　前記粒子の表面には抗体およびマルチ銅酸化酵素CueOが固定されており、そして
    　　前記抗体は前記抗原に特異的に反応し、
    　前記工程（ａ）において得られた粒子を回収する工程（ｂ）、
    　前記工程（ｂ）において回収された粒子、酸化還元指示薬（還元体）、および第２の緩衝液を混合し、反応溶液を調製する工程（ｃ）、ここで
    　　前記第２の緩衝液は、前記マルチ銅酸化酵素CueOの基質を含有し、
    　　前記第２の緩衝液は、０．３ｍＭ以上１．０ｍＭ以下の範囲に収まるイオン強度を有し、
    　工程（ｃ）において得られた反応溶液に含有されるマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの活性度を、吸光度測定法により測定する工程（ｄ）、および
    　以下の式が充足されれば前記第１の緩衝液が前記抗原を含有することが決定される工程（ｅ）
    　　工程（ｄ）において測定された活性度　＞＝　１．４×（ブランク値）
    　　ここで、前記ブランク値は、前記抗原は用いられないが、前記粒子および前記第２の緩衝液は用いられる吸光度測定法により測定されたマルチ銅酸化酵素ＣｕｅＯの活性度を表す。
  2. 請求項１の方法であって、
    　前記粒子は金からなる、方法。
  3. 請求項１の方法であって、
    　第１の緩衝液は、トリス－塩酸緩衝液、トリス緩衝生理食塩水、またはリン酸緩衝生理食塩水である、方法。
  4. 請求項１の方法であって、
    　前記第２の緩衝液は、４．５以上５．５以下のｐＨを有する、方法。
  5. 請求項１の方法であって、
    　前記第２の緩衝液は、酸素およびプロトンを含有する、方法。
  6. 請求項１の方法であって、
    　第２の緩衝液は、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、または２－モルホリノエタンスルホン酸緩衝液である、方法。
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