CN103513028B - 一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：基础电极的清洁处理：对电极进行抛光、浸泡和清洗处理，去除其表面杂质后，获得表面新鲜洁净的电极；在基础电极上形成带有氨基的有机膜；将带有氨基有机膜的基础电极与参比电极、辅助电极构成三电极系统，将基础电极放置在pH2.0至10.0、浓度为0.1至10mg/mL的缓冲溶液中，在-800至+400mV的电位条件下处理1至60min，最终实现抗体膜在有机膜上的固定。这是一种在抗体固化的过程中无需使用交联剂或偶联剂，无需酶标记或荧光标记，成本低廉，简单易行的免疫传感器制备方法。

Description

一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法
技术领域
本发明涉及一种免疫分析领域中传感器的制备方法，特别是一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法。
背景技术
免疫分析的提出及发展是生物分析化学最伟大的成就之一。免疫分析技术结合了抗原、抗体分子间的特异性识别和电化学、光谱学、声学等技术的灵敏、方便等特点，已广泛应用于临床诊断、生物化学、环境分析、食品安全及军事医学等领域。免疫传感器作为一种新兴免疫分析手段，具有检测速度快，操作简便，成本较低等特点，受到人们愈来愈广泛的关注。
抗体的固定化是免疫传感器制备的关键技术之一。常用的有包埋法、交联法、共价键法及静电吸附法等，这些固定方法通常具有以下缺点：1.固定抗体时需占用一个免疫活性位点，造成抗体的活性损失或抗体膜不稳定，致使免疫传感器性能减弱，如检测灵敏度低、检测范围窄。2.使用的交联或偶联试剂昂贵，部分固定方法步骤繁琐，不易大规模操作、实施。因此现在需要一种能够解决上述问题的新的抗体固定方法。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种在抗体固化的过程中无需使用交联剂或偶联剂，无需酶标记或荧光标记，成本低廉，简单易行的免疫传感器制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：
基础电极的清洁处理：对电极进行抛光、浸泡和清洗处理，去除其表面杂质后，获得表面新鲜洁净的电极，
在基础电极上形成带有氨基的有机膜，
将带有氨基有机膜的基础电极与参比电极、辅助电极构成三电极系统，将基础电极放置在pH2.0至10.0、浓度为0.1至10mg/mL的IgG型抗体溶液中，在-800至+400mV的电位条件下处理1至60min，最终实现抗体膜在有机膜上的固定。
所述的基础电极选用铂、金、银、铜、石墨、炭糊或玻炭中的一种。
所述的带有氨基的有机膜通过自组装法或电聚合方法附着在以铂、金、银或铜为材质的基础电极上，通过电聚合方法附着在以石墨、炭糊或玻炭为材质的基础电极上。
所述的带有氨基的有机膜为氨基硫酚及其衍生物、硫脲类化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一种或多种。
所述的抗体膜为IgG型单克隆抗体或IgG型多克隆抗体。
所述的抛光步骤为：首先将基础电极的表面用金相砂纸打磨，然后依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，之后依次用丙酮、纯水淋洗干净；
所述的浸泡步骤为：将经抛光处理后的基础电极浸入piranha溶液中在50℃的条件下浸泡20min，然后用蒸馏水冲洗基础电极5次，上述的浸泡和冲洗步骤需进行2次操作。
所述的清洗步骤为：将基础电极取出后用纯水淋洗5次，并将其浸入纯水中进行超声清洗3次，每次清洗时间为5min，最后取出基础电极并用N2吹干。
所述的自组装方法为：将经过清洁处理后的基础电极浸入0.1～25mmol/L氨基有机物的溶液中浸泡24h，以在基础电极上形成末端为氨基的单层分子膜或多层分子膜，其中氨基有机物为氨基硫酚及其衍生物、硫脲类化合物、胱氨及其衍生物中的一种或多种。
所述的电聚合方法为：在 0.01～0.05mol/L氨基有机物溶液中，将经过清洁处理后的基础电极作为三电极系统的工作电极，以50mV/s的扫速在至500至+500mV的电位范围内循环扫描10至50圈后，用纯水淋洗基础电极5次，以在基础电极表面上形成带有自由氨基或亚氨基的聚合物薄膜，其中氨基有机物为硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一种或多种。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
利用本发明所公开的方法制备的免疫传感器，与现有的免疫传感器相比，具有以下优点：这种免疫传感器的构造简单，在抗体固化的过程中无需使用交联剂或偶联剂，无需酶标记或荧光标记，成本低廉，简单易行；并且该传感器的检测下限低、检测范围宽，操作简单，能够广泛应用于临床检验、生物医学、环境监测、食品安全、医药工业及军事、医学等领域。因此可以说这种制备方法具备了多种优点，具备广泛的市场前景和科研前景。
附图说明
图1是利用本发明所述方法制备出的免疫传感器的制备过程示意图。
图2是免疫传感器制备过程及对抗原检测后的循环伏安图。
图3是免疫传感器制备过程及对抗原检测后的交流阻抗谱。
图4是免疫传感器对抗原检测的工作曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图说明本发明的具体实施方式。
图2中的a为基础电极，b为氨基有机膜修饰电极，c为免疫传感器，d为传感器对抗原检测后的传感器。
图3中的a为基础电极，b为氨基有机膜修饰电极，c为免疫传感器，d为传感器对抗原检测后的传感器，内嵌图为曲线a和b的放大图。
实施例一
选择金电极作为基础电极，硫脲为氨基化合物，以羊抗至小鼠IgG抗体制备免疫传感器。
首先将金电极用金相砂纸打磨，依次用l.0、0.3、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，接着依次用丙酮、纯水淋洗干净。将抛光后的电极浸入新配制的piranha溶液中（３０％H2O2:浓H2SO4=1:3，体积比），50℃下浸泡20min，2次。取出电极用纯水淋洗5次，纯水中反复超声清洗3次，每次5min，用N2吹干。最后，将电极浸入25mmol/L 硫脲溶液中，浸泡24h，电极表面上形成硫脲自组装单分子膜。取出电极（硫脲修饰电极），作为工作电极浸入pH 3.0、1mg/mL的抗体溶液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在至400mV电位下，组装抗体10min，制得免疫传感器。利用制得的免疫传感器对抗原（小鼠IgG）进行检测，检测下限可达10-2ng/mL，检测范围为10-2-103ng/mL。
实施例二
选择铂电极作为基础电极，对氨基苯硫酚与半胱氨酸混合物为氨基化合物，以山羊抗至兔IgG抗体制备免疫传感器。
首先将铂电极用金相砂纸打磨，依次用l.0、0.3、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，接着依次用丙酮、纯水淋洗干净。将抛光后的电极浸入新配制的piranha溶液中（３０％H2O2:浓H2SO4=1:3，体积比），50℃下浸泡20min，2次。取出电极用纯水淋洗5次，纯水中反复超声清洗3次，每次5min，用N2吹干。最后，将电极浸入0.1mmol/L 对氨基苯硫酚与半胱氨酸混合溶液中，浸泡24h，电极表面上形成氨基有机膜。取出氨基有机膜修饰电极，作为工作电极浸入pH 2.0、10mg/mL抗体溶液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在+400mV电位下，组装抗体60min，制得免疫传感器。利用制得的免疫传感器对抗原（兔IgG）进行检测，检测下限可达10-2ng/mL，检测范围为10-2-103ng/mL。
实施例三
选择玻碳电极作为基础电极，邻苯二胺为氨基化合物，以兔抗至人IgG抗体制备免疫传感器。
首先将玻碳电极用金相砂纸打磨，依次用l.0、0.3、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，接着依次用丙酮、纯水淋洗干净。接着将电极浸入新配制的piranha溶液中（３０％H2O2:浓H2SO4=1:3，体积比），50℃下浸泡20min，2次。取出电极用纯水淋洗5次，纯水中反复超声清洗3次，每次5min，用N2吹干后，在 0.05mol/L邻苯二胺溶液中，以清洁处理好的电极为工作电极。以50mV/s的扫速在至500～500mV的电位范围内循环扫描50圈后，用纯水淋洗5次，得到修饰了氨基的电极表面。将该电极作为工作电极浸入pH 10.0、0.1mg/mL抗体溶液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在-800mV电位下，组装抗体1min，制得免疫传感器。利用制得的免疫传感器对抗原（人IgG）进行检测，检测下限可达10-2ng/mL，检测范围为10-2-103ng/mL。

Claims (8)

1.一种基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：
基础电极的清洁处理：对电极进行抛光、浸泡和清洗处理，去除其表面杂质后，获得表面新鲜洁净的电极，
在基础电极上形成带有氨基的有机膜，
将带有氨基有机膜的基础电极与参比电极、辅助电极构成三电极系统，将基础电极放置在pH2.0至10.0、浓度为0.1至10mg/mL的IgG型抗体溶液中，在-800至+400mV的电位条件下处理1至60min，最终实现抗体膜在有机膜上的固定。
2.根据权利要求1所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的基础电极选用铂、金、银、铜、石墨、炭糊或玻炭中的一种。
3.根据权利要求2所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的带有氨基的有机膜通过自组装法或电聚合方法附着在以铂、金、银或铜为材质的基础电极上，通过电聚合方法附着在以石墨、炭糊或玻炭为材质的基础电极上。
4.根据权利要求1所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的带有氨基的有机膜为氨基硫酚及其衍生物、硫脲类化合物、胱氨及其衍生物、硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的抗体膜为IgG型单克隆抗体或IgG型多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的抛光步骤为：首先将基础电极的表面用金相砂纸打磨，然后依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm的γ-氧化铝浆在麂皮上抛光，之后依次用丙酮、纯水淋洗干净；
所述的浸泡步骤为：将经抛光处理后的基础电极浸入piranha溶液中在50℃的条件下浸泡20min，然后用蒸馏水冲洗基础电极5次，上述的浸泡和冲洗步骤需进行2次操作；
所述的清洗步骤为：将基础电极取出后用纯水淋洗5次，并将其浸入纯水中进行超声清洗3次，每次清洗时间为5min，最后取出基础电极并用N2吹干。
7.根据权利要求3所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的自组装方法为：将经过清洁处理后的基础电极浸入0.1～25mmol/L氨基有机物的溶液中浸泡24h，以在基础电极上形成末端为氨基的单层分子膜或多层分子膜，其中氨基有机物为氨基硫酚及其衍生物、硫脲类化合物、胱氨及其衍生物中的一种或多种。
8.根据权利要求3所述的基于电位控制固定抗体的免疫传感器制备方法，其特征在于：所述的电聚合方法为：在 0.01～0.05mol/L氨基有机物溶液中，将经过清洁处理后的基础电极作为三电极系统的工作电极，以50mV/s的扫速在-500至+500mV的电位范围内循环扫描10至50圈后，用纯水淋洗基础电极5次，以在基础电极表面上形成带有自由氨基或亚氨基的聚合物薄膜，其中氨基有机物为硫堇及其衍生物、苯胺及其衍生物中的一种或多种。
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